L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des voies respiratoires. C’est une maladie complexe et hétérogène, présentant un large spectre de manifestations cliniques dans lequel l’âge de début joue un rôle important. L’asthme résulte de nombreux facteurs génétiques et environnementaux et des interactions entre ces facteurs.Afin d’identifier de nouveaux gènes de susceptibilité à l’asthme et aux maladies allergiques, nous avons réalisé des études d’association pan-génomiques et de clonage positionnel en prenant en compte des mécanismes complexes : 1) empreinte parentale, 2) hétérogénéité de la maladie et 3) interactions gène-environnement.Nous avons tout d’abord réalisé une étude de clonage positionnel pour le phénotype asthme-plus-rhinite dans des familles d’origine européenne de quatre études indépendantes (770 familles recensées par un asthmatique et incluant 3200 sujets) en prenant en compte l'effet de l'origine parentale. L’intégration de données génétiques et épigénétiques, nous a permis d’identifier un mécanisme de médiation de l’effet d’un variant génétique transmis par le père sur le phénotype combiné asthme-plus-rhinite, par une méthylation différentielle d’un site CpG localisé dans le gène MTNR1A.Nous avons ensuite pris en compte la variabilité de l’âge de début de l'asthme dans la modélisation de la maladie par des méthodes d’analyse de survie et avons réalisé une méta-analyse d’études d'association pan-génomiques du délai de survenue de l’asthme dans neuf populations d’origine européenne (5462 asthmatiques et 8424 non asthmatiques). Nous avons ainsi identifié un nouveau locus de susceptibilité à l’asthme localisé dans la région 16q12. Nous avons également mis en évidence que les variants génétiques des régions 9p24 et 17q12-q21 étaient associés à un asthme précoce alors que les variants en 16q12 étaient associés à un asthme plus tardif. Enfin, nous avons réalisé une méta-analyse de cinq études d’interaction pan-génomiques du délai de survenue de l’asthme avec l’exposition au tabagisme passif dans l’enfance (3643 exposés et 5275 non-exposés). Nous avons montré que l’effet des variants génétiques des régions 9p24 et 17q12-q21 sur le délai de survenue de l’asthme était augmenté par l’exposition au tabagisme parental dans l’enfance.La prise en compte de mécanismes complexes dans les études génétiques, nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de susceptibilité à l’asthme et de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l'origine de l’asthme et de son expression variable au cours de la vie. / Asthma is a chronic airway inflammatory disease. It is a complex and heterogeneous disease with a wide spectrum of clinical manifestations in which the age of onset plays an important role. Asthma results from many genetic and environmental factors and from interactions between these factors.To identify new susceptibility genes to asthma and allergic diseases, we performed genome-wide association studies and positional cloning studies, while taking into account complex mechanisms: 1) parental imprinting, 2) heterogeneity of the disease and 3) gene-by-environment interactions.We first conducted a positional cloning study for asthma-plus-rhinitis in European families of four independent studies (770 families ascertained through an asthmatic and including 3200 subjects) while taking into account parent-of-origin effects. The integration of genetic and epigenetic data enabled us to identify that the effect of a paternally inherited genetic variant on the combined phenotype asthma-plus-rhinitis was mediated by a differentially methylated CpG site within MTNR1A gene. We then took into account the variability of age-of-asthma onset in the disease modeling using survival analysis methods and conducted a meta-analysis of genome-wide association studies of time-to-asthma onset in nine European populations (5,462 asthmatics and 8,424 non-asthmatics). We identified a new asthma susceptibility locus in 16q12. We also showed that genetic variants of 9p24 and 17q12-q21 regions were associated with early-onset asthma while 16q12 variants were associated with later-onset asthma. Finally, we performed a meta-analysis of five genome-wide interaction studies of time-to-asthma onset with early-life tobacco smoke exposure (3,643 exposed and 5,275 unexposed). We showed that the effect of genetic variants of 9p24 and 17q12-q21 regions on time-to-asthma onset was increased by early-life tobacco smoke exposure.Studying complex mechanisms in genetic studies led to identify new asthma susceptibility genes and to better understand the pathophysiological mechanisms underlying asthma and its variable expression throughout life.

O desenvolvimento e invasão de tumores cerebrais primários são diretamente influenciados pela matriz extracelular. Considerando que lisil oxidase (LOX) e os demais membros da família das lisil oxidases (LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4) apresentam complexidade tanto estrutural quanto funcional e estão envolvidos em processos biológicos vitais, como motilidade celular, sinalização celular e regulação gênica, a desregulação da expressão destas proteínas pode levar à gênese e progressão tumoral. O presente trabalho teve como objetivos avaliar os níveis de expressão dos genes que codificam todos os membros da família das lisil oxidases em astrocitomas de diferentes graus de malignidade e correlacionar com a expressão de BMP1 e HIF1A, mutação de IDH1 e tempo de sobrevida total dos pacientes. Adicionalmente, as expressões das proteínas codificadas por estes genes foram também realizadas, além de um estudo funcional in vitro do papel de LOX em astrocitomas. A análise da expressão dos genes foi realizada por PCR quantitativa em tempo real numa série de 153 astrocitomas e 22 amostras de tecido cerebral não neoplásico. A expressão proteica foi conduzida por imuno-histoquímica em amostras de astrocitomas. O silenciamento da expressão de LOX foi realizado em linhagens celulares de glioblastoma humano U87MG e A172 transfectadas com o siRNA para os ensaios funcionais. A expressão de todos os genes (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4, BMP1 e HIF1A) aumentou com o grau de malignidade dos astrocitomas, com maiores níveis nos casos de glioblastoma. Foi encontrada uma correlação positiva nos valores de expressão dos genes principalmente nos glioblastomas. Somente a expressão de LOXL3 teve um impacto na sobrevida dos casos com GBM. Pacientes com maior expressão apresentaram maior sobrevida em relação aos com menor expressão de LOXL3. Os casos de astrocitoma grau II com mutação de IDH1 apresentaram menor expressão de LOXL1 e de LOXL4 quando comparados com os casos sem mutação. Os casos de GBM com mutação de IDH1, por sua vez, apresentaram menores níveis de expressão de LOX e de LOXL1 do que os casos sem IDH1 mutado. Os níveis de expressão das proteínas da família das lisil oxidases também estavam maiores nas amostras de glioblastoma, com localização nuclear e citoplamastica das células, além de marcação do endotélio. Interessantemente, um caso de glioblastoma com mutação de IDH1 apresentou menor expressão de LOX, inclusive nas células endoteliais. Nas análises funcionais, o silenciamento de LOX por siRNA e o tratamento com o inibidor BAPN das linhagens celulares U87MG e A172 afetaram a capacidade de migração. Além sito, a menor expressão de LOX afetou a capacidade de invasão e crescimento independente de ancoragem das células. Em conjunto, esses resultados corroboram o papel de LOX em processo importantes da tumorigênese dos astrocitomas. Adicionalmente, a expressão de LOX é influenciada pelo status de mutação de IDH1. Portanto, este trabalho fornece novas informações para as possíveis intervenções terapêuticas para o tratamento dos pacientes com astrocitomas / The development and invasion of primary brain tumors are directly influenced by the extracellular matrix. Considering that lysyl oxidase (LOX) and other lysyl oxidase family members (LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4) have both structural and functional complexity and that they are involved in vital biological processes such as cell motility, cell signaling and gene regulation, a deregulation of these proteins can lead to the genesis and tumor progression. This study aimed to evaluate the expression levels of genes that code for the lysyl oxidase family members in astrocytomas of different malignant grades and to correlate to the expression of BMP1 and HIF1A, IDH1 mutation and overall patients\' survival. Moreover, protein expression coded by these genes was also analyzed, besides an in vitro functional study of LOX role in astrocytomas. Gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR in a series of 153 astrocytomas and 22 samples of non-neoplastic brain. Protein expression was analyzed by immunohistochemistry in astrocytoma samples. LOX knockdown was performed in cells of human glioblastoma U87MG and A172 transfected with siRNA. Expression levels of all genes (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4, BMP1 e HIF1A) increased with the malignant grade of astrocytomas, glioblastomas presenting the higher levels. Positive correlations of gene expression values were observed specially in glioblastomas. Only LOXL3 expression impacted in the overall survival of glioblastoma cases. Patients with higher expression presented longer survival time than those with lower LOXL3 expression. Astrocytoma grade II cases with IDH1 mutation presented lower LOXL1 and LOXL4 expression when compared to those cases with wild type IDH1. On the other hand, GBM cases with IDH1-mutated presented lower LOX and LOXL1 expression than GBM cases without IDH1 mutation. Protein expression levels of lysyl oxidase family members were also higher in glioblastoma samples, with both nuclear and cytoplasmic localization, and also endothelium staining. Interestingly, a glioblastoma case with IDH1-mutated had lower LOX expression, including endothelial cells. For functional analysis, LOX knockdown by siRNA and treatment with inhibitor BAPN of U87MG and A172 cell lines affected migration behavior. Furthermore, lower LOX expression affected invasion capacity and anchorage independent growth. Altogether, these results corroborate LOX role in important processes of astrocytoma tumorigenesis. Additionally, LOX expression is influenced by IDH1 mutational status in glioblastomas. Therefore, our work provides new insights for possible therapeutic interventions for patients with astrocytomas

Ependimomas são tumores gliais raros. Podem ser encontrados em qualquer localização do sistema nervoso central e, apesar de histologia similar, parecem apresentar alterações genômicas distintas. As variáveis clínicas são intercorrelacionadas e, geralmente, incapazes de predizer o curso da doença. O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão aumentada de genes e proteínas em ependimomas e correlacionar com dados clínicos dos pacientes. Foram estudados casos de pacientes com ependimoma submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo, no período entre 1996 e 2011 (33 amostras de tecido congelado para análise de expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real e 149 amostras com tecido incluído em parafina, correspondentes a 121 casos devido a recidivas, para análise de proteína por imuno-histoquímica de tissue microarrays). As reações de imuno-histoquímica foram analisadas semiquantitativamente e graduadas com um índice de marcação calculado pelo produto da porcentagem de núcleos marcados pela intensidade de marcação. Oitenta e um casos eram adultos (média de 27,2 anos). Havia 60 casos intracranianos e 61 intramedulares, dos quais 10 eram mixopapilares, 92 grau II e 19 grau III. Ressecção completa foi possível em 62% dos casos e recidiva foi confirmada em 41,1%. Observou-se menor tempo para recidiva em crianças e tumores intracranianos, supratentoriais (p < 0,001 em ambos), histologia anaplásica e ressecções incompletas (p < 0,05 em ambos). Os seguintes genes foram selecionados em dados públicos de SAGE e literatura: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 e RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 e DNALI1 apresentaram maiores níveis de expressão em ependimomas intramedulares (p < 0,05), e FGFRL1, NOTCH1 e CCND1 nos casos supratentoriais (p < 0,01). IGF2 apresentou maiores níveis de expressão em crianças e CHST5 em adultos (p < 0,05 em ambos). Foram observados maiores níveis de expressão de FGFRL1 (p < 0,05), CCND1 e IGF2 (p < 0,01 em ambos) em casos com histologia anaplásica. Nenhum dos genes analisados apresentou impacto no tempo livre de progressão ou na sobrevida. A expressão da proteína codificada por CCND1, ciclina D1, também foi avaliada por imuno-histoquímica, por ser uma proteína com expressão aumentada em diversos tipos de neoplasias e não ter ainda um valor prognóstico bem estabelecido em ependimomas. Houve correlação entre expressão de ciclina D1 a nível de mRNA e da proteína (p < 0,0001). As correlações entre ciclina D1 e histologia anaplásica e localização supratentorial foram confirmadas pela análise proteica (p < 0,0001 em ambos). Adicionalmente, foi também observada maior expressão de ciclina D1 em pacientes mais jovens (p < 0,01). A maior expressão de ciclina D1 em tumores com localização supratentorial foi independente do grau histológico e da idade do paciente. Recidiva foi mais frequente em casos com maiores níveis de expressão de ciclina D1 (p < 0,05), embora uma maior correlação com tempo livre de progressão foi observada apenas em casos com ressecção completa (p < 0,001). Os ependimomas apresentaram expressão gênica diferencial de acordo com idade, localização do tumor e grau histológico nesse estudo. A determinação dos níveis da expressão de ciclina D1 pode ser útil para guiar o seguimento e tratamento dos casos supratentoriais com ressecções completas / Ependymomas are rare glial cell-derived tumors. They can be found in any central nervous system localization and despite the histological similarity, they seem to display distinct genomic abnormalities. Clinical variables are intercorrelated and they are usually unable to predict the disease course. We aimed to analyze increased gene and protein expression in ependymomas and to correlate with patients\' clinical data. We studied patients with ependymoma submitted to surgical resections at Hospital das Clinicas, University of São Paulo, from 1996 to 2011 (33 fresh-frozen samples for gene expression analysis by quantitative real-time PCR and 149 formalin-fixed, paraffin-embedded samples, relative to 121 patients due to relapses, for protein analysis by tissue microarray immunohistochemistry). Immunohistochemical reactions were analyzed semi-quantitatively and scored with a labeling index (LI) calculated as the product of the percentage of the positively stained nuclei by the intensity of staining. Eighty-one cases were adults (mean 27.2 years). There were 60 intracranial and 61 spinal cases, of which 10 tumors were myxopapillary, 92 were grade II and 19 were grade III. Gross total resection was achieved in 62% of cases and relapse was confirmed in 41.4% of cases. We observed a shorther time to relapse in children and supratentorial intracranial tumor localization (p<0.001 for both), anaplastic histology and incomplete resections (p<0.05 for both). The following genes were selected based on public SAGE database and literature: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 and RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 and DNALI1 presented higher expression levels in intramedullary ependymomas (p < 0.05) and FGFRL1, NOTCH1 and CCND1 in supratentorial cases (p < 0.01). IGF2 presented higher expression levels in pediatric cases and CHST5 in adults cases (p < 0.05 in both). Higher expression levels of FGFRLI1 (p < 0.05), CCND1 and IGF2 (p < 0.01 for both) were observed in anaplastic histology cases. None of the genes impacted in progression free survival or overall survival of patients. The expression of protein codified by CCND1, cyclin D1, was also evaluated by immunohistochemistry, because its overexpression has been related with several types of neoplasias and its prognostic value has not yet been fully established in ependymomas. There was a correlation of cyclin D1 expression at mRNA and protein levels (p < 0.0001). Correlations between cyclin D1 and anaplastic histology and supratentorial localization were confirmed by protein analyses (p < 0.0001 for both parameters). Additionally, high expression of cyclin D1 was observed in younger patients (p < 0.01). The higher cyclin D1 expression in supratentorial tumor localization was independent of histological grade and age of patient. Relapse was more frequent in cases with higher cyclin D1 expression levels (p < 0.05) although correlation with progression free survival was just observed in gross total resection cases (p < 0.001). Ependymomas presented differential gene expression according to age, tumor localization and histological grade in our study. Determination of cyclin D1 expression levels may be useful to guide follow-up and treatment in supratentorial cases with gross total resection

O uso da cocaína e do crack tornou-se um problema de saúde pública importante no Brasil por conta de prejuízos significativos do ponto de vista médico, psicológico e social que ele acarreta. Estudos de gêmeos e, em famílias, sugerem que a dependência de cocaína é uma doença complexa, com participação importante de fatores genéticos. Os estudos genéticos sobre usuários de cocaína são poucos e padecem de problemas metodológicos, tais como, amostras pequenas, com alto grau de miscigenação populacional e um número limitado de marcadores genéticos pesquisados. Além disto, há pouco sendo feito no sentido de verificar como os genes já associados à dependência de cocaína interagem entre si, ou seja, de investigações sobre a epistasia genética. Com o intuito de aprofundar a investigação dos aspectos biológicos da dependência de cocaína, nós estudamos, através de um estudo casocontrole, uma amostra de inicial de 746 pacientes dependentes de crack/cocaína hospitalizados em clínicas especializadas para o tratamento de dependência química na cidade de São Paulo, que foram comparados a 891 controles normais, sem história prévia de abuso ilegal de substâncias. Os objetivos desta tese foram: 1) verificar a associação de três polimorfismos (rs1803274, rs4263329, rs4680662) para o gene da butirilcolinesterase (BCHE), uma enzima envolvida na metabolização da cocaína no desenho do tipo gene candidato; 2) testar a hipótese de interação entre o marcador funcional Val158Met do gene para a enzima catecol-O-metiltransferase (COMT) e os marcadores do tipo VNTR das regiões 3´UTR e Intron8 do gene do transportador da dopamina (DAT1) e; 3) numa análise de caráter exploratório, verificar a interação gene-gene de 40 polimorfismos em 12 genes com plausibilidade biológica para a dependência da cocaína. A análise estatística fez uso de modelos de regressão logística para a interação de marcadores nos dois genes, COMT e DAT1 e, do programa Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) para a análise multivariada. A análise envolvendo os marcadores para o gene BCHE não se mostraram associados ao fenótipo da dependência de cocaína porém, encontrou-se uma associação do marcador funcional rs1803274 (p=0,001; OR=5,83; IC95%=2,10 - 16,16) nos usuários exclusivos de crack, a forma cheirada da cocaína quando comparados aos grupos de uso exclusivo da cocaína na forma cheirada ou, de uso das duas formas de administração. Os marcadores do tipo VNTR da DAT1 não interagiram em um modelo de regressão logística com o marcador Val158Met da COMT. Finalmente, os modelos construídos pelo programa MDR não forneceram interações gene-gene que tivessem uma previsibilidade além do acaso. Dentro de uma perspectiva genética, os estudos futuros para a dependência de cocaína devem aprimorar a caracterização fenotípica, por meio de subgrupos divididos por sintomas clínicos e pelo uso de fenótipos intermediários, fazer um rastreio minucioso dos marcadores ao longo dos genes de interesse e, usar de métodos analíticos para as interações gene-gene e gene-ambiente / The use of crack/cocaine has become a major public health problem in Brazil due to its manifold problems in the medical, psychological and social realms. Twin and family studies have documented the role played by genetic factors and environment in cocaine addiction. Genetic association studies in cocaine addiction are few and have methodological problems: small sample size, population stratification and a paucity of genetic markers have been studied so far. There is also a lack of knowledge on how the genes already shown to be associated with cocaine addiction interact, that is, genetic epistasis. In order to advance the knowledge of biological factors in cocaine addiction we investigated, by means of a case-control study, 746 patients with crack/cocaine dependence admitted to specialized clinics for the treatment of drug addiction in the city of São Paulo. They were compared to 891 control subjects with no previous history of illegal drug abuse. The objectives of this thesis were: 1) investigate the association of three SNPs (rs1803274, rs4263329, rs4680662) in the butirilcholinesterase gene (BCHE) that encodes an enzyme involved in cocaine metabolism; 2) test the hypothesis of an interaction between the functional marker Val158Met of the catechol-o-metiltransferase enzyme (COMT) gene and two VNTRs markers, 3´UTR and Intron8, of the dopamine transporter gene (DAT1) and, 3) in an exploratory analysis, investigate the gene-gene interaction of 40 polymorphisms in 12 genes with a biological plausibility for cocaine addiction. Logistic regression was used to assess COMT*DAT1 gene-gene interaction and, the Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) program was used for the other multivariate analysis. Genetic variants for the BCHE gene were not associated with cocaine addiction but, an association was found between the functional marker rs1803274 (p=0,001; OR=5,83; IC95%=2,10 - 16,16) and crack users compared to those that snorted cocaine or used both forms of administration. The DAT1 VNTRs did not interact with the COMT Val158Met marker. Finally, the models generated by the MDR program did not provided any predictive gene-gene interaction better than chance. Future studies investigating genetic risk factors for cocaine dependence should improve phenotype characterization (clinically derived subgroups and use of endophenotypes) and should also make a thorough scan of the genetic markers along the genes of interest including gene-gene and gene-environment analysis

O uso da cocaína e do crack tornou-se um problema de saúde pública importante no Brasil por conta de prejuízos significativos do ponto de vista médico, psicológico e social que ele acarreta. Estudos de gêmeos e, em famílias, sugerem que a dependência de cocaína é uma doença complexa, com participação importante de fatores genéticos. Os estudos genéticos sobre usuários de cocaína são poucos e padecem de problemas metodológicos, tais como, amostras pequenas, com alto grau de miscigenação populacional e um número limitado de marcadores genéticos pesquisados. Além disto, há pouco sendo feito no sentido de verificar como os genes já associados à dependência de cocaína interagem entre si, ou seja, de investigações sobre a epistasia genética. Com o intuito de aprofundar a investigação dos aspectos biológicos da dependência de cocaína, nós estudamos, através de um estudo casocontrole, uma amostra de inicial de 746 pacientes dependentes de crack/cocaína hospitalizados em clínicas especializadas para o tratamento de dependência química na cidade de São Paulo, que foram comparados a 891 controles normais, sem história prévia de abuso ilegal de substâncias. Os objetivos desta tese foram: 1) verificar a associação de três polimorfismos (rs1803274, rs4263329, rs4680662) para o gene da butirilcolinesterase (BCHE), uma enzima envolvida na metabolização da cocaína no desenho do tipo gene candidato; 2) testar a hipótese de interação entre o marcador funcional Val158Met do gene para a enzima catecol-O-metiltransferase (COMT) e os marcadores do tipo VNTR das regiões 3´UTR e Intron8 do gene do transportador da dopamina (DAT1) e; 3) numa análise de caráter exploratório, verificar a interação gene-gene de 40 polimorfismos em 12 genes com plausibilidade biológica para a dependência da cocaína. A análise estatística fez uso de modelos de regressão logística para a interação de marcadores nos dois genes, COMT e DAT1 e, do programa Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) para a análise multivariada. A análise envolvendo os marcadores para o gene BCHE não se mostraram associados ao fenótipo da dependência de cocaína porém, encontrou-se uma associação do marcador funcional rs1803274 (p=0,001; OR=5,83; IC95%=2,10 - 16,16) nos usuários exclusivos de crack, a forma cheirada da cocaína quando comparados aos grupos de uso exclusivo da cocaína na forma cheirada ou, de uso das duas formas de administração. Os marcadores do tipo VNTR da DAT1 não interagiram em um modelo de regressão logística com o marcador Val158Met da COMT. Finalmente, os modelos construídos pelo programa MDR não forneceram interações gene-gene que tivessem uma previsibilidade além do acaso. Dentro de uma perspectiva genética, os estudos futuros para a dependência de cocaína devem aprimorar a caracterização fenotípica, por meio de subgrupos divididos por sintomas clínicos e pelo uso de fenótipos intermediários, fazer um rastreio minucioso dos marcadores ao longo dos genes de interesse e, usar de métodos analíticos para as interações gene-gene e gene-ambiente / The use of crack/cocaine has become a major public health problem in Brazil due to its manifold problems in the medical, psychological and social realms. Twin and family studies have documented the role played by genetic factors and environment in cocaine addiction. Genetic association studies in cocaine addiction are few and have methodological problems: small sample size, population stratification and a paucity of genetic markers have been studied so far. There is also a lack of knowledge on how the genes already shown to be associated with cocaine addiction interact, that is, genetic epistasis. In order to advance the knowledge of biological factors in cocaine addiction we investigated, by means of a case-control study, 746 patients with crack/cocaine dependence admitted to specialized clinics for the treatment of drug addiction in the city of São Paulo. They were compared to 891 control subjects with no previous history of illegal drug abuse. The objectives of this thesis were: 1) investigate the association of three SNPs (rs1803274, rs4263329, rs4680662) in the butirilcholinesterase gene (BCHE) that encodes an enzyme involved in cocaine metabolism; 2) test the hypothesis of an interaction between the functional marker Val158Met of the catechol-o-metiltransferase enzyme (COMT) gene and two VNTRs markers, 3´UTR and Intron8, of the dopamine transporter gene (DAT1) and, 3) in an exploratory analysis, investigate the gene-gene interaction of 40 polymorphisms in 12 genes with a biological plausibility for cocaine addiction. Logistic regression was used to assess COMT*DAT1 gene-gene interaction and, the Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) program was used for the other multivariate analysis. Genetic variants for the BCHE gene were not associated with cocaine addiction but, an association was found between the functional marker rs1803274 (p=0,001; OR=5,83; IC95%=2,10 - 16,16) and crack users compared to those that snorted cocaine or used both forms of administration. The DAT1 VNTRs did not interact with the COMT Val158Met marker. Finally, the models generated by the MDR program did not provided any predictive gene-gene interaction better than chance. Future studies investigating genetic risk factors for cocaine dependence should improve phenotype characterization (clinically derived subgroups and use of endophenotypes) and should also make a thorough scan of the genetic markers along the genes of interest including gene-gene and gene-environment analysis

Ependimomas são tumores gliais raros. Podem ser encontrados em qualquer localização do sistema nervoso central e, apesar de histologia similar, parecem apresentar alterações genômicas distintas. As variáveis clínicas são intercorrelacionadas e, geralmente, incapazes de predizer o curso da doença. O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão aumentada de genes e proteínas em ependimomas e correlacionar com dados clínicos dos pacientes. Foram estudados casos de pacientes com ependimoma submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo, no período entre 1996 e 2011 (33 amostras de tecido congelado para análise de expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real e 149 amostras com tecido incluído em parafina, correspondentes a 121 casos devido a recidivas, para análise de proteína por imuno-histoquímica de tissue microarrays). As reações de imuno-histoquímica foram analisadas semiquantitativamente e graduadas com um índice de marcação calculado pelo produto da porcentagem de núcleos marcados pela intensidade de marcação. Oitenta e um casos eram adultos (média de 27,2 anos). Havia 60 casos intracranianos e 61 intramedulares, dos quais 10 eram mixopapilares, 92 grau II e 19 grau III. Ressecção completa foi possível em 62% dos casos e recidiva foi confirmada em 41,1%. Observou-se menor tempo para recidiva em crianças e tumores intracranianos, supratentoriais (p < 0,001 em ambos), histologia anaplásica e ressecções incompletas (p < 0,05 em ambos). Os seguintes genes foram selecionados em dados públicos de SAGE e literatura: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 e RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 e DNALI1 apresentaram maiores níveis de expressão em ependimomas intramedulares (p < 0,05), e FGFRL1, NOTCH1 e CCND1 nos casos supratentoriais (p < 0,01). IGF2 apresentou maiores níveis de expressão em crianças e CHST5 em adultos (p < 0,05 em ambos). Foram observados maiores níveis de expressão de FGFRL1 (p < 0,05), CCND1 e IGF2 (p < 0,01 em ambos) em casos com histologia anaplásica. Nenhum dos genes analisados apresentou impacto no tempo livre de progressão ou na sobrevida. A expressão da proteína codificada por CCND1, ciclina D1, também foi avaliada por imuno-histoquímica, por ser uma proteína com expressão aumentada em diversos tipos de neoplasias e não ter ainda um valor prognóstico bem estabelecido em ependimomas. Houve correlação entre expressão de ciclina D1 a nível de mRNA e da proteína (p < 0,0001). As correlações entre ciclina D1 e histologia anaplásica e localização supratentorial foram confirmadas pela análise proteica (p < 0,0001 em ambos). Adicionalmente, foi também observada maior expressão de ciclina D1 em pacientes mais jovens (p < 0,01). A maior expressão de ciclina D1 em tumores com localização supratentorial foi independente do grau histológico e da idade do paciente. Recidiva foi mais frequente em casos com maiores níveis de expressão de ciclina D1 (p < 0,05), embora uma maior correlação com tempo livre de progressão foi observada apenas em casos com ressecção completa (p < 0,001). Os ependimomas apresentaram expressão gênica diferencial de acordo com idade, localização do tumor e grau histológico nesse estudo. A determinação dos níveis da expressão de ciclina D1 pode ser útil para guiar o seguimento e tratamento dos casos supratentoriais com ressecções completas / Ependymomas are rare glial cell-derived tumors. They can be found in any central nervous system localization and despite the histological similarity, they seem to display distinct genomic abnormalities. Clinical variables are intercorrelated and they are usually unable to predict the disease course. We aimed to analyze increased gene and protein expression in ependymomas and to correlate with patients\' clinical data. We studied patients with ependymoma submitted to surgical resections at Hospital das Clinicas, University of São Paulo, from 1996 to 2011 (33 fresh-frozen samples for gene expression analysis by quantitative real-time PCR and 149 formalin-fixed, paraffin-embedded samples, relative to 121 patients due to relapses, for protein analysis by tissue microarray immunohistochemistry). Immunohistochemical reactions were analyzed semi-quantitatively and scored with a labeling index (LI) calculated as the product of the percentage of the positively stained nuclei by the intensity of staining. Eighty-one cases were adults (mean 27.2 years). There were 60 intracranial and 61 spinal cases, of which 10 tumors were myxopapillary, 92 were grade II and 19 were grade III. Gross total resection was achieved in 62% of cases and relapse was confirmed in 41.4% of cases. We observed a shorther time to relapse in children and supratentorial intracranial tumor localization (p<0.001 for both), anaplastic histology and incomplete resections (p<0.05 for both). The following genes were selected based on public SAGE database and literature: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 and RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 and DNALI1 presented higher expression levels in intramedullary ependymomas (p < 0.05) and FGFRL1, NOTCH1 and CCND1 in supratentorial cases (p < 0.01). IGF2 presented higher expression levels in pediatric cases and CHST5 in adults cases (p < 0.05 in both). Higher expression levels of FGFRLI1 (p < 0.05), CCND1 and IGF2 (p < 0.01 for both) were observed in anaplastic histology cases. None of the genes impacted in progression free survival or overall survival of patients. The expression of protein codified by CCND1, cyclin D1, was also evaluated by immunohistochemistry, because its overexpression has been related with several types of neoplasias and its prognostic value has not yet been fully established in ependymomas. There was a correlation of cyclin D1 expression at mRNA and protein levels (p < 0.0001). Correlations between cyclin D1 and anaplastic histology and supratentorial localization were confirmed by protein analyses (p < 0.0001 for both parameters). Additionally, high expression of cyclin D1 was observed in younger patients (p < 0.01). The higher cyclin D1 expression in supratentorial tumor localization was independent of histological grade and age of patient. Relapse was more frequent in cases with higher cyclin D1 expression levels (p < 0.05) although correlation with progression free survival was just observed in gross total resection cases (p < 0.001). Ependymomas presented differential gene expression according to age, tumor localization and histological grade in our study. Determination of cyclin D1 expression levels may be useful to guide follow-up and treatment in supratentorial cases with gross total resection

O desenvolvimento e invasão de tumores cerebrais primários são diretamente influenciados pela matriz extracelular. Considerando que lisil oxidase (LOX) e os demais membros da família das lisil oxidases (LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4) apresentam complexidade tanto estrutural quanto funcional e estão envolvidos em processos biológicos vitais, como motilidade celular, sinalização celular e regulação gênica, a desregulação da expressão destas proteínas pode levar à gênese e progressão tumoral. O presente trabalho teve como objetivos avaliar os níveis de expressão dos genes que codificam todos os membros da família das lisil oxidases em astrocitomas de diferentes graus de malignidade e correlacionar com a expressão de BMP1 e HIF1A, mutação de IDH1 e tempo de sobrevida total dos pacientes. Adicionalmente, as expressões das proteínas codificadas por estes genes foram também realizadas, além de um estudo funcional in vitro do papel de LOX em astrocitomas. A análise da expressão dos genes foi realizada por PCR quantitativa em tempo real numa série de 153 astrocitomas e 22 amostras de tecido cerebral não neoplásico. A expressão proteica foi conduzida por imuno-histoquímica em amostras de astrocitomas. O silenciamento da expressão de LOX foi realizado em linhagens celulares de glioblastoma humano U87MG e A172 transfectadas com o siRNA para os ensaios funcionais. A expressão de todos os genes (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4, BMP1 e HIF1A) aumentou com o grau de malignidade dos astrocitomas, com maiores níveis nos casos de glioblastoma. Foi encontrada uma correlação positiva nos valores de expressão dos genes principalmente nos glioblastomas. Somente a expressão de LOXL3 teve um impacto na sobrevida dos casos com GBM. Pacientes com maior expressão apresentaram maior sobrevida em relação aos com menor expressão de LOXL3. Os casos de astrocitoma grau II com mutação de IDH1 apresentaram menor expressão de LOXL1 e de LOXL4 quando comparados com os casos sem mutação. Os casos de GBM com mutação de IDH1, por sua vez, apresentaram menores níveis de expressão de LOX e de LOXL1 do que os casos sem IDH1 mutado. Os níveis de expressão das proteínas da família das lisil oxidases também estavam maiores nas amostras de glioblastoma, com localização nuclear e citoplamastica das células, além de marcação do endotélio. Interessantemente, um caso de glioblastoma com mutação de IDH1 apresentou menor expressão de LOX, inclusive nas células endoteliais. Nas análises funcionais, o silenciamento de LOX por siRNA e o tratamento com o inibidor BAPN das linhagens celulares U87MG e A172 afetaram a capacidade de migração. Além sito, a menor expressão de LOX afetou a capacidade de invasão e crescimento independente de ancoragem das células. Em conjunto, esses resultados corroboram o papel de LOX em processo importantes da tumorigênese dos astrocitomas. Adicionalmente, a expressão de LOX é influenciada pelo status de mutação de IDH1. Portanto, este trabalho fornece novas informações para as possíveis intervenções terapêuticas para o tratamento dos pacientes com astrocitomas / The development and invasion of primary brain tumors are directly influenced by the extracellular matrix. Considering that lysyl oxidase (LOX) and other lysyl oxidase family members (LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4) have both structural and functional complexity and that they are involved in vital biological processes such as cell motility, cell signaling and gene regulation, a deregulation of these proteins can lead to the genesis and tumor progression. This study aimed to evaluate the expression levels of genes that code for the lysyl oxidase family members in astrocytomas of different malignant grades and to correlate to the expression of BMP1 and HIF1A, IDH1 mutation and overall patients\' survival. Moreover, protein expression coded by these genes was also analyzed, besides an in vitro functional study of LOX role in astrocytomas. Gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR in a series of 153 astrocytomas and 22 samples of non-neoplastic brain. Protein expression was analyzed by immunohistochemistry in astrocytoma samples. LOX knockdown was performed in cells of human glioblastoma U87MG and A172 transfected with siRNA. Expression levels of all genes (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4, BMP1 e HIF1A) increased with the malignant grade of astrocytomas, glioblastomas presenting the higher levels. Positive correlations of gene expression values were observed specially in glioblastomas. Only LOXL3 expression impacted in the overall survival of glioblastoma cases. Patients with higher expression presented longer survival time than those with lower LOXL3 expression. Astrocytoma grade II cases with IDH1 mutation presented lower LOXL1 and LOXL4 expression when compared to those cases with wild type IDH1. On the other hand, GBM cases with IDH1-mutated presented lower LOX and LOXL1 expression than GBM cases without IDH1 mutation. Protein expression levels of lysyl oxidase family members were also higher in glioblastoma samples, with both nuclear and cytoplasmic localization, and also endothelium staining. Interestingly, a glioblastoma case with IDH1-mutated had lower LOX expression, including endothelial cells. For functional analysis, LOX knockdown by siRNA and treatment with inhibitor BAPN of U87MG and A172 cell lines affected migration behavior. Furthermore, lower LOX expression affected invasion capacity and anchorage independent growth. Altogether, these results corroborate LOX role in important processes of astrocytoma tumorigenesis. Additionally, LOX expression is influenced by IDH1 mutational status in glioblastomas. Therefore, our work provides new insights for possible therapeutic interventions for patients with astrocytomas

Abstract Approximately 5.5% of all infants are born preterm (before 37 completed weeks of gestation) in Finland. Preterm birth is the cause of several life-threatening neonatal diseases and long-term morbidity. The most important risk factor for preterm birth is intrauterine infection and inflammation. Approximately 70% of preterm births have a spontaneous onset. Evidence suggests that genetic factors are involved in spontaneous preterm birth (SPTB), but knowledge about the actual genes conferring genetic predisposition is limited. The major aim of this work was to identify genetic factors that predispose to SPTB. Genome-wide linkage analysis was performed to identify genomic regions associating with SPTB in large northern Finnish families recurrently affected by SPTB. Genes near regions with linkage signals were subsequently analyzed in a Finnish case-control population of mothers and infants. Due to their roles in innate immunity, the genes encoding surfactant protein A (SP-A), SP-C, SP-D and mannose-binding lectin (MBL) were also investigated as candidates for SPTB in this population. In addition, expression of SP-C in human and mouse gestational tissues was examined. Linkage signals were detected on chromosome loci 15q26.3, Xq13.1 and Xq21.1 with the phenotype of being born preterm. In subsequent association analyses, the genes encoding the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) located within locus 15q26.3 and the androgen receptor (AR) located near locus Xq13.1 were identified as potential novel fetal SPTB susceptibility genes. These genes did not associate with SPTB in the mothers. An association was found between the Met31Thr polymorphism of the SFTPD gene encoding SP-D and SPTB in the infants. There was no association in the mothers. Polymorphisms of the genes encoding SP-A or MBL did not associate with SPTB. The Thr138Asn polymorphism of the SFTPC gene encoding SP-C did not associate with SPTB. However, this polymorphism associated strongly with the interval between preterm premature rupture of membranes and SPTB in the fetuses. Expression of SP-C was detected in human and mouse fetal membranes and placenta, and in mouse pregnant uterus. Currently, there is no effective method to prevent SPTB. The results of this study may help to clarify some of the biological mechanisms underlying SPTB and finally allow the development of specific treatment strategies for its prevention. / Tiivistelmä Suomessa syntyy noin 5,5&#160;% lapsista ennenaikaisina eli raskauden kestettyä vähemmän kuin 37 täyttä viikkoa. Näillä lapsilla on alttius hengenvaarallisiin sairauksiin, ja osalle heistä jää pysyvä kehitysvamma. Noin 70&#160;% ennenaikaisista syntymistä käynnistyy spontaanisti. Tärkein ennenaikaisen syntymän riskitekijä on kohdunsisäinen tulehdusreaktio. Myös perinnöllisten tekijöiden tiedetään vaikuttavan spontaanin ennenaikaisen syntymän (SEAS) käynnistymiseen, mutta alttiusgeenejä tunnetaan huonosti. Työssä pyrittiin tunnistamaan SEAS:lle altistavia perinnöllisiä tekijöitä. Perimänlaajuista kytkentäanalyysiä käyttäen etsittiin SEAS:ään liittyviä perimän kohtia tutkimalla toistuvasti ennenaikaisia syntymiä kokeneita isoja pohjoissuomalaisia perheitä. Kytkentäsignaalien lähellä olevia geenejä tutkittiin tutkimusaineistossa, joka koostui suomalaisista äideistä ja lapsista. Surfaktanttiproteiini A:ta (SP-A), SP-C:tä, SP-D:tä ja mannoosia sitovaa lektiiniä (MBL) koodaavia geenejä tutkittiin ehdokasgeeneinä SEAS:lle tässä populaatiossa, koska nämä proteiinit osallistuvat elimistön puolustukseen ja voivat siten vaikuttaa SEAS:ään liittyvään tulehdusreaktioon. Lisäksi tutkittiin SP-C:n ilmentymistä ihmisen ja hiiren sikiökalvoilla, istukassa ja kohdussa. Kytkentäsignaaleja havaittiin kromosomikohdissa 15q26.3, Xq13.1 ja Xq21.1, kun tutkittavana ilmiasuna oli ennenaikaisena syntyminen. Lisätutkimukset osoittivat, että sikiön insuliininkaltaisen kasvutekijän 1 reseptoria koodaava IGF1R-geeni (kohta 15q26.3) ja androgeenireseptorigeeni AR (lähellä kohtaa Xq13.1) ovat mahdollisia uusia SEAS:n alttiusgeenejä. Nämä geenit eivät selittäneet SEAS:ää äideissä. Sikiön SP-D:tä koodaavan geenin Met31Thr-polymorfismi tunnistettiin mahdolliseksi riskitekijäksi, mutta tämä polymorfismi ei selittänyt SEAS:ää äideissä. SP-A:ta ja MBL:ää koodaavat geenit eivät liittyneet SEAS:ään. SP-C:tä koodaavan geenin Thr138Asn-polymorfismi ei ollut yhteydessä SEAS:ään. Sikiön Thr138Asn-polymorfismi liittyi kuitenkin vahvasti sikiökalvojen puhkeamisen ja SEAS:n väliseen kestoon. SP-C:n havaittiin ilmentyvän ihmisen ja hiiren sikiökalvoilla ja istukassa sekä raskaana olevan hiiren kohdussa. Tulokset antavat uutta tietoa SEAS:n perinnöllisestä taustasta. Tämä tieto voi auttaa selvittämään sen käynnistymiseen johtavia biologisia mekanismeja ja johtaa lopulta uusiin hoitokeinoihin, joilla pystytään estämään spontaaneja ennenaikaisia syntymiä.