The glycine riboswitch is a structured RNA found upstream of genes in mRNA transcripts in many bacteria, functioning as a biofeedback gene regulator. Upon binding glycine, a complete RNA transcript including gene sequences is transcribed, effectively turning on gene expression. In an effort to understand the intricacies of its functioning, many mutants of the riboswitch were made and characterized during Ph. D. work, resulting in discovery of a P0 duplex/kink-turn motif involving a few nucleotides upstream of the established glycine riboswitch sequence which changed its ligand binding characteristics (Chapter 1). Previously, the two aptamers of the riboswitch were thought to cooperatively bind glycine, but with the inclusion of this leader sequence which forms a kink turn motif with the linker between the two aptamers, glycine binding in one aptamer no longer requires glycine binding in the other. Furthermore, the Kd from three species tested are now a similar, lower value of about 5 µM, indicating authenticity of this new consensus sequence. Glycine binding and interaptamer interaction both enhanced one another in trans aptamer assays. Another discovery from this was a shortened construct including all of aptamer II but only part of aptamer I in which a few specific nucleotides prevented glycine binding in aptamer II (Chapter 2). This may provide insight into the nature of interaptamer interactions in the full switch; addition of an oligonucleotide complimentary to these nucleotides restored glycine binding ability to aptamer II. With future development, this could also be a useful molecular biology tool, using two signals, glycine and an oligonucleotide, to allow gene expression. To precisely understand how any macromolecule functions, a 3D structure, obtainable by x-ray crystallography, is vital. A new technique to accomplish that for RNA, precedented in the protein world, is Fab chaperoned crystallography, which has advantages compared to RNA alone. A phage displayed library of Fabs with reduced codon diversity designed for RNA was created, the YSGR Min library (Chapter 3). Its Fabs had specificities and affinities equal to or greater than previous libraries which were originally created for phage displayed selection against proteins. Fab chaperoned RNA crystallography is currently in progress for the glycine riboswitch; the best resolution thus far is 5.3 … (Chapter 4). In addition to providing molecular insight into its gene regulation mechanism, a structure of the glycine riboswitch could be applied for use in structure based drug design of novel antibiotics targeting the riboswitch to disrupt important downstream carbon cycle genes in pathogenic bacteria.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agroindustriais do Brasil, sendo amplamente cultivada para a produção de açúcar e etanol. Esta cultura se torna a cada dia mais importante no cenário mundial, devido à busca constante por fontes de energia alternativas e mais sustentáveis. Para atender a crescente demanda, é necessária a liberação frequente de novas variedades, mais adaptadas às regiões de cultivo e tolerantes às alterações ambientais. Assim, o estabelecimento da metodologia de transformação genética além de contribuir para o estudo funcional de genes de interesse é uma metodologia alternativa para obtenção de novas variedades. O processo de obtenção de transgênicos é dependente de um eficiente protocolo de regeneração de plantas in vitro, que geralmente envolve uma fase de formação de células indiferenciadas (calos). A indução e a manutenção dos calos são favoráveis ao aumento da atividade de elementos de transposição (ETs) os quais são muito freqüentes no genoma de cana e podem acarretar variabilidade no genoma vegetal pela alteração dos padrões e funções gênicas devido a essa mobilização, afrontando a fidelidade genética dos cultivares transgênicos obtidos. Baseando-se na importância de reduzir o período de cultura de tecidos e controlar a atividade dos ETs durante o desenvolvimento in vitro, o objetivo desse trabalho foi buscar alternativas no controle e na redução do tempo para regeneração de plantas, inclusive com a aplicação de peptídeos hormonais, assim como de transformar geneticamente as variedades RB835089 e RB835486 com o gene Ddm1 de Arabidopsis, visando o silenciamento dos elementos de transposição em cana-de-açúcar. Para isso, foram analisados os meios de cultura MS3c e ML1G1 e o efeito da água de coco na indução e formação de calos como também na regeneração de plantas. Foram testados os meios de regeneração de plantas MSAc, SRM, ML1R3 e ML1R4, obtendo-se em média 5,2 plantas por explante no meio MSAc, que foi superior aos demais meios. Este meio foi utilizado para testar o efeito individual dos peptídeos hormonais CLV3 e PSK- em calos embriogênicos, os quais apresentaram acréscimo na regeneração de plantas para 9,3 plantas por explantes com doses de 30 µM de PSK-a. A transformação genética por biolística através da cotransformação dos genes neo e AtDdm1 resultou em 34 plantas transgênicas. O estudo da mobilização dos ETs durante o desenvolvimento in vitro foi realizado para quatro retrotransposons. A expressão heteróloga do gene AtDdm1 em cana-de-açúcar mostrou atuar no controle da expressão do retroelemento TE010. O estudo da mobilização dos retrotransposons e do gene Ddm1 endógeno de cana (SsDdm1) durante o desenvolvimento in vitro confirmou que o gene SsDdm1 foi chave no controle da expressão dos retroelementos. A transformação genética com o gene AtDdm1 aliada a rápida regeneração de plantas a partir de discos foliares possibilitam condições que minimizam a expressão dos ETs em cana-de-açúcar. / Sugarcane is one of the major agro-industrial crops of Brazil being widely cultivated for the production of sugar and ethanol. This culture has become increasingly more important on the world stage each day due to the constant search for alternative and sustainable energy sources. In order to meet growing demand, it is necessary to often release new varieties, better adapted to cultivated expansion area and tolerant to environmental changes. Thus, the establishing of genetic transformation methodology beyond of contributing to the functional study of genes of interest and it is an alternative method for obtaining new varieties. The process of obtaining transgenic plants is dependent of an efficient protocol for in vitro plant regeneration, which generally involves a phase of undifferentiated cells (callus). The induction and maintenance of callus are favorable to increase the activity of transposable elements (TEs) which are very frequent in the genome of sugarcane and may cause variability in the plant genome by altering patterns and gene functions due to this mobilization, confronting the genetic fidelity of the transgenic cultivars obtained. Based on the importance of reducing the period of tissue culture and control the activity of TEs during in vitro development, the objective of this work was to seek alternatives to control and reduce the time for plant regeneration, including the use of peptides hormone, as well as to genetically transform sugarcane varieties RB835089 and RB835486 with the Ddm1 Arabidopsis gene to silence the transposable elements in cane sugar. For this, we tested the culture media MS3c and ML1G1and the effect of coconut water in callus induction and growth as well as on plant regeneration. We tested the plant regeneration media MSAc, SRM, ML1R3 and ML1R4, obtaining an average of 5.2 plants per explants using MSAC, superior to other medium tested. It was used to test the individual effect of peptides hormones such as CLV3 and PSK- in embryogenic callus, which showed an increase in plant regeneration to 9.3 plants per explant with doses of 30µM PSK-a. Genetic co-transformation with the neo and AtDdm1 genes by biolistic resulted in 34 transgenic plants. A study of TEs during in vitro development was performed for four retrotransposons. Heterologous expression of the AtDdm1 gene in sugarcane showed to control the expression of the retroelement TE010. The study of mobilization of retrotransposons and the endogenous Ddm1 gene (SsDdm1) during in vitro development confirmed that SsDdm1 was key gene in controlling the expression of retrotransposons. Genetic transformation with the AtDdm1 gene and the fast regeneration of plants provide positive conditions to minimize the expression of ETs in sugarcane.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV11MA037.pdf: 605162 bytes, checksum: 2e3e438ce062ad8ed7349ee5404d8ab1 (MD5) Previous issue date: 2011-02-09 / The aim of this study was to analyze the genetic control of agronomic characteristics of the bean: cycle, plant height, stem diameter, first pod, number of pods per plant and number of grains per pod, to catarina plateau and study the inheritance of the regeneration capacity in vitro and fixed segregating generations. In the first experiment, the F1 seeds obtained from a diallel crossing scheme with six parents: Xan 159, Perola, BAF 63, IPR Uirapuru, BRS Supreme and BRS Valente, were taken to the field in a completely randomized design with two replications. After harvesting were evaluated according to the six agronomic traits. The diallel was analyzed using Griffing Method I that estimates the general ability and specific combining ability and reciprocal effect. One of diallel crosses obtained by (Xan 159 vs Perola) and its reciprocal (Perola vs Xan 159) were selected because of regeneration capacity in vitro than the parent Xan 159 has to study the genetic inheritance of this feature. The seeds F1, F2, F1r and F2r of crossing Xan 159 vs Perola were evaluated for regeneration potential in vitro, according to a binomial distribution in a completely randomized design, with each seed was considered a repetition. The ability of in vitro regeneration was evaluated by calculating the means and variances were estimated and from these genetic components, environmental and phenotypic, heritability and number of genes. The mean F1, F2, F1r and F2r were tested by t. Diallel analysis showed significant values at 5% for general ability and specific combining indicating that genetic effects are additive and not additive involved in the control of those characteristics. For this reciprocal effect the values were significant indicating that there is the presence of cytoplasmic effect and nuclear gene inherited from the female parent in traits indicating how best female parents access BAF 63 and lineage Xan 159 as best male parents BRS Valente and IPR Uirapuru and the access BAF 63. With respect to general combining ability the genotype Perola is considered promising for improving desirable traits for common bean in the Catarina Plateau and the best combinations based on specific capacity was Xan 159 vs. BRS Supremo, Xan 159 vs. BRS Valente, Perola vs. BAF 63, BAF 63 vs. IPR Uirapuru and BAF 63 vs. BRS Valente. The analysis on the capacity for regeneration in vitro indicate that the parent had a higher average Xan 159, exceeding all generations evaluated for regeneration. With the average fixed generation was found that the allelic interaction in this regeneration in vitro is not addictive. The components of variance indicated that environment 10 has a major contribution in the phenotype of seeds evaluated in comparison with the genetic variance. The value found for broad-sense heritability was intermediate, demonstrating the contribution of genetic factor in the expression of the trait. The estimated number of genes indicates the influence of at least one gene of major effect on regeneration in vitro. From the evaluation performed in the F1 generations (Xan 159 vs. Perola), F2 (Xan 159 vs. Perola) F1r (Perola vs. Xan 159) and F2r (Perola vs. Xan 159) can be seen the presence of the reciprocal effect on the character acting in vitro regeneration of beans / O objetivo deste trabalho foi analisar o controle genético das características de interesse agronômico do feijão: ciclo, estatura de planta, diâmetro do caule, inserção do primeiro legume, número de legumes por planta e número de grãos por legume, para o Planalto Catarinense e estudar a herança da capacidade de regeneração in vitro em gerações fixas e segregantes. No primeiro experimento as sementes F1 obtidas em um esquema de cruzamento dialélico com seis genitores: Xan 159, Pérola, BAF 63, IPR Uirapuru, BRS Supremo e BRS Valente, foram levadas a campo em um delineamento inteiramente casualizado com duas repetições. Depois de colhidas foram avaliadas de acordo com as seis características de interesse agronômico. O dialelo foi analisado utilizando o Método I de Griffing que estima a capacidade geral e a capacidade específica de combinação e o efeito do recíproco. Um dos cruzamentos obtidos com o dialelo (Xan 159 vs. Pérola) e o seu recíproco (Pérola vs. Xan 159) foram selecionados devido a capacidade de regeneração in vitro que o genitor Xan 159 apresenta, para estudar a herança genética da capacidade de regeneração in vitro. As sementes F1, F2, F1r e F2r do cruzamento Xan 159 vs Pérola foram avaliadas quanto ao potencial de regeneração in vitro, de acordo com uma distribuição binomial em um delineamento inteiramente casualizado, sendo que, cada semente foi considerada uma repetição. A capacidade de regeneração in vitro foi avaliada através de cálculos de médias e variâncias e a partir delas foram estimados os componentes genético, ambiental e fenotípico, a herdabilidade e o número de genes. As médias das gerações F1, F2, F1r e F2r foram testadas pelo teste t. A análise dialélica mostrou valores significativos a 5% para a capacidade geral e específica de combinação indicando que existem efeitos gênicos aditivos e não aditivos envolvidos no controle das características avaliadas. Para o efeito recíproco os valores foram significativos indicando que existe a presença de efeito citoplasmático e de genes nucleares herdados do genitor feminino nos caracteres avaliados indicando como melhores genitores femininos o acesso BAF 63 e a Linhagem Xan 159 e como melhores genitores masculinos as cultivares BRS Valente e IPR Uirapuru e o acesso BAF 63. A capacidade geral de combinação da cultivar Pérola é considerada promissora para melhorar características desejáveis para o feijão no Planalto Catarinense e as melhores combinações com base na capacidade específica foram Xan 159 vs. BRS Supremo, Xan 159 vs. BRS Valente, Pérola vs. BAF 63, BAF 63 vs. IPR Uirapuru e BAF 63 vs. BRS Valente. O genótipo Xan 159 apresenta um bom potencial para 8 regenerar in vitro, superando as demais gerações fixas e segregantes. Com as médias das gerações fixas foi constatado que a interação alélica presente na capacidade de regeneração in vitro é não aditiva. Os componentes da variância indicam que o ambiente possui uma maior contribuição no fenótipo das sementes avaliadas em comparação com a variância genética. O valor encontrado para herdabilidade no sentido amplo foi intermediário, demonstrando a contribuição do fator genético na expressão da característica. A estimativa do número de genes indica a influência de pelo menos um gene de efeito maior sobre a regeneração in vitro. A partir da avaliação realizada nas gerações F1 (Xan 159 vs. Pérola), F2 (Xan 159 vs. Pérola), F1r (Pérola vs. Xan 159) e F2r Pérola vs. Xan 159) pode ser constatado a presença do efeito recíproco atuando sobre o caráter regeneração in vitro do feijão

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agroindustriais do Brasil, sendo amplamente cultivada para a produção de açúcar e etanol. Esta cultura se torna a cada dia mais importante no cenário mundial, devido à busca constante por fontes de energia alternativas e mais sustentáveis. Para atender a crescente demanda, é necessária a liberação frequente de novas variedades, mais adaptadas às regiões de cultivo e tolerantes às alterações ambientais. Assim, o estabelecimento da metodologia de transformação genética além de contribuir para o estudo funcional de genes de interesse é uma metodologia alternativa para obtenção de novas variedades. O processo de obtenção de transgênicos é dependente de um eficiente protocolo de regeneração de plantas in vitro, que geralmente envolve uma fase de formação de células indiferenciadas (calos). A indução e a manutenção dos calos são favoráveis ao aumento da atividade de elementos de transposição (ETs) os quais são muito freqüentes no genoma de cana e podem acarretar variabilidade no genoma vegetal pela alteração dos padrões e funções gênicas devido a essa mobilização, afrontando a fidelidade genética dos cultivares transgênicos obtidos. Baseando-se na importância de reduzir o período de cultura de tecidos e controlar a atividade dos ETs durante o desenvolvimento in vitro, o objetivo desse trabalho foi buscar alternativas no controle e na redução do tempo para regeneração de plantas, inclusive com a aplicação de peptídeos hormonais, assim como de transformar geneticamente as variedades RB835089 e RB835486 com o gene Ddm1 de Arabidopsis, visando o silenciamento dos elementos de transposição em cana-de-açúcar. Para isso, foram analisados os meios de cultura MS3c e ML1G1 e o efeito da água de coco na indução e formação de calos como também na regeneração de plantas. Foram testados os meios de regeneração de plantas MSAc, SRM, ML1R3 e ML1R4, obtendo-se em média 5,2 plantas por explante no meio MSAc, que foi superior aos demais meios. Este meio foi utilizado para testar o efeito individual dos peptídeos hormonais CLV3 e PSK- em calos embriogênicos, os quais apresentaram acréscimo na regeneração de plantas para 9,3 plantas por explantes com doses de 30 µM de PSK-a. A transformação genética por biolística através da cotransformação dos genes neo e AtDdm1 resultou em 34 plantas transgênicas. O estudo da mobilização dos ETs durante o desenvolvimento in vitro foi realizado para quatro retrotransposons. A expressão heteróloga do gene AtDdm1 em cana-de-açúcar mostrou atuar no controle da expressão do retroelemento TE010. O estudo da mobilização dos retrotransposons e do gene Ddm1 endógeno de cana (SsDdm1) durante o desenvolvimento in vitro confirmou que o gene SsDdm1 foi chave no controle da expressão dos retroelementos. A transformação genética com o gene AtDdm1 aliada a rápida regeneração de plantas a partir de discos foliares possibilitam condições que minimizam a expressão dos ETs em cana-de-açúcar. / Sugarcane is one of the major agro-industrial crops of Brazil being widely cultivated for the production of sugar and ethanol. This culture has become increasingly more important on the world stage each day due to the constant search for alternative and sustainable energy sources. In order to meet growing demand, it is necessary to often release new varieties, better adapted to cultivated expansion area and tolerant to environmental changes. Thus, the establishing of genetic transformation methodology beyond of contributing to the functional study of genes of interest and it is an alternative method for obtaining new varieties. The process of obtaining transgenic plants is dependent of an efficient protocol for in vitro plant regeneration, which generally involves a phase of undifferentiated cells (callus). The induction and maintenance of callus are favorable to increase the activity of transposable elements (TEs) which are very frequent in the genome of sugarcane and may cause variability in the plant genome by altering patterns and gene functions due to this mobilization, confronting the genetic fidelity of the transgenic cultivars obtained. Based on the importance of reducing the period of tissue culture and control the activity of TEs during in vitro development, the objective of this work was to seek alternatives to control and reduce the time for plant regeneration, including the use of peptides hormone, as well as to genetically transform sugarcane varieties RB835089 and RB835486 with the Ddm1 Arabidopsis gene to silence the transposable elements in cane sugar. For this, we tested the culture media MS3c and ML1G1and the effect of coconut water in callus induction and growth as well as on plant regeneration. We tested the plant regeneration media MSAc, SRM, ML1R3 and ML1R4, obtaining an average of 5.2 plants per explants using MSAC, superior to other medium tested. It was used to test the individual effect of peptides hormones such as CLV3 and PSK- in embryogenic callus, which showed an increase in plant regeneration to 9.3 plants per explant with doses of 30µM PSK-a. Genetic co-transformation with the neo and AtDdm1 genes by biolistic resulted in 34 transgenic plants. A study of TEs during in vitro development was performed for four retrotransposons. Heterologous expression of the AtDdm1 gene in sugarcane showed to control the expression of the retroelement TE010. The study of mobilization of retrotransposons and the endogenous Ddm1 gene (SsDdm1) during in vitro development confirmed that SsDdm1 was key gene in controlling the expression of retrotransposons. Genetic transformation with the AtDdm1 gene and the fast regeneration of plants provide positive conditions to minimize the expression of ETs in sugarcane.