O diseleneto de difenila, objeto de estudo desse trabalho é um composto orgânico simples e estável, utilizado como reagente eletrofílico em indústrias de síntese química, com interessantes atividades farmacológicas e vários efeitos tóxicos. O objetivo desse estudo é aumentar o conhecimento a respeito dos efeitos do DPDS em células de mamíferos em cultura, com intuito de investigar novos efeitos farmacológicos e entender os mecanismos envolvidos em sua toxicidade. A abordagem experimental foi realizada em fibroblastos de pulmão de hamster chinês em cultura e em órgãos e tecidos de camundongos, avaliando-se o estado redox celular, citotoxicidade, genotoxicidade e potencial mutagênico. Esse trabalho avaliou os efeitos citotóxicos, pró-oxidantes, genotóxicos e mutagênicos dessa molécula em células V79 (fibroblastos de pulmão de hamster chinês). A citotoxicidade em células V79 foi avaliada por quatro ensaios metabólicos diferentes e observou-se efeito tóxico somente em concentrações acima de 50 μM, em maneira dose e tempo dependente. O ensaio de redução do MTT sugeriu a possível geração de espécies reativas de oxigênio. O tratamento das células por 3h em doses citotóxicas de DPDS aumentou o nível de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e aumentou a sensibilidade ao tratamento com mutágenos oxidativos, indicando um efeito pró-oxidante. Esses efeitos devem-se a redução dos níveis intracelulares de glutationa reduzida sem aumento de taxa de formação de glutationa oxidada, ou seja, a depleção de GSH ocorre por formação de adutos, reforçando os resultados prévios. Utilizando-se o ensaio cometa em condições alcalinas, verificou-se que o tratamento com diseleneto de difenila em altas concentrações é capaz de induzir quebras de cadeias de DNA. O teste de micronúcleos mostra que as lesões geradas pelo composto organoselenado em doses citotóxicas em células V79 não são eficientemente reparadas e fixam-se como quebras cromossômicas. Considerando-se também a proteção conferida pela N-acetilcisteína, um precursor da biosíntese de glutationa, em termos de depleção do tripeptídeo, é compreensível entender o seu potencial protetor observado contra as lesões ao DNA e mutagênese induzida pelo diseleneto de difenila. No ensaio de sobrevivência clonogênica, em concentrações no intervalo 1.62- 12.5 μM, DPDS não foi citotóxico, enquanto em concentrações a partir de 25 μM, essa molécula significativamente reduziu a sobrevivência das células V79. Nesse sentido, investigou-se o efeito antioxidante do DPDS nas concentrações não-citotóxicas em células V79. O potencial antioxidante do diseleneto nas concentrações empregadas aumentou a sobrevivência e bloqueou a genotoxicidade e mutagenecidade de metilmetanosulfonato e radiação ultravioleta de 254 nm, dois mutágenos capazes de causar danos oxidativos à molécula de DNA. Além disso, o tratamento não não impediu os danos ao DNA induzidos por 8-metoxipsoraleno fotoativado, o qual não induz lesões oxidativas. O pré-tratamento das células V79 com a molécula organoselenada em concentrações inferiores a 12,5 μM foi capaz de reduzir os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico após exposição ao peróxido de hidrogênio, MMS e radiação UVC em maneira dose-resposta e aumentou a atividade da glutationa peroxidase das células V79.Dessa maneira, os resultados mostram claramente que DPDS, em baixas concentrações, apresenta propriedades antimutagênicas, as quais devem-se, provavelmente, a sua capacidade antioxidante. Os efeitos genotóxicos do DPDS em diversos órgãos (cérebro, rins, fígado, baço, testículos e bexiga urinária) e tecidos (medula óssea, linfócitos) de camundongos, usando o ensaio cometa in vivo, foi usado para determinar o limiar de dose no qual a molécula exerce efeitos benéficos ou tóxicos em animais. DPDS induziu danos ao DNA em cérebro, fígado, rins e testículos em modo dose-resposta, no espectro de dose 75-200 μmol/Kg em dose única por via intraperitonial, sendo os maiores níveis observados no cérebro. Nossas análises demonstraram uma alta correlação com a redução dos níveis de GSH e um aumento na peroxidação lipídica e dano ao DNA. Dessa forma, esse estudo estabeleceu uma relação entre os efeitospró-oxidantes e genotóxicos para o DPDS em camundongos. DPDS não foi genotóxico e não induziu peroxidação lipídica em nenhum dos órgãos avaliados em doses menores que 50 μmol/kg. O pré-tratamento com N-acetilcisteína foi capaz de impedir os efeitos genotóxicos sistêmicos do composto. Em resumo, cérebro, fígado, rins e testículos são órgãos potenciais para a genotoxicidade sistêmica do DPDS, sendo o cérebro o principal órgão-alvo. Em razão das propriedades genotóxicas observadas, investigou-se o efeito do tratamento com DPDS na manutenção da integridade estrutural do DNA em células de adenocarcinoma mamário humano MCF-7, usando o ensaio cometa alcalino. O efeito genotóxico do DPDS em células MCF-7 foi idêntico àquele verificado em células V79, indicando que os mecanismos operantes na produção das quebras da fita de DNA são semelhantes e possivelmente baseados no efeito pró-oxidante por depleção de glutationa reduzida. Reforçando essa proposição, o pré-tratamento da linhagem MCF- 7 nos mesmos moldes realizados em V79 também potencializou as lesões ao DNA induzidaspelo peróxido de hidrogênio. Esses achados sugerem que os efeitos genotóxicos do DPDS podem ser investigados para o uso na terapia antiproliferativa. / Diphenyl diselenide (DPDS) is an organoselenium compound with interesting pharmacological activities and various toxic effects. As it is an electrophilic reagent, it is used in the synthesis of a variety of pharmacologically active OS compounds. This study aimed at deepening our knowledge on the effects of DPDS on mammalian cultured cells in order to investigate new pharmacological possibilities for its application and the mechanisms underlying its toxicity. These assays were performed in mammalian cultured cells, using a permanent cell line derived of Chinese hamster lung fibroblasts- V79 cells- and mice organs and tissues, focusing on effects of DPDS on cell redox status, cytotoxicity, genotoxicity, and mutagenicity. This work evaluated the cytotoxic, pro-oxidant, genotoxic, and mutagenic properties of this molecule in V79 Chinese lung fibroblast cells. When cells were treated with increasing concentrations of DPDS, its cytotoxic activity, as determined using four cell viability endpoints, occurs in doses up to 50 μM. The MTT reduction was stimulated, which may indicate reactive oxygen species (ROS) generation. Accordingly, the treatment of cells for 3hr with cytotoxic doses of DPDS increased TBARS levels, and sensitized cells to oxidative challenge, indicating a pro-oxidant effect. The measurement of total, reduced, and oxidized glutathione showed that DPDS can lead to lower intracellular glutathione depletion, with no increase in the oxidation rate in a dose- and time-dependent manner. At the higher doses, DPDS generates DNA strand breaks, as observed using the comet assay. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. In addition, the pre-incubation with Nacetylcysteine, this restored GSH to normal levels, annulled DPDS pro-oxidant and genotoxic effects. These findings show that DPDS-induced oxidative stress and toxicity are closely related to intracellular level of reduced glutathione. In the clonal survival assay, at concentrations ranging from 1.62-12.5μM, DPDS was not cytotoxic, while at concentrations up to 25μM, it significantly decreased the survival of V79 cells. In this respect, the treatment with this organoselenium compound at non-cytotoxic dose range increased cell survival after challenge with hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate, and UVC radiation, but did not protect against 8- methoxypsoralen plus UVA-induced cytotoxicity. Moreover, the treatment prevented induced DNA damage, as verified in the comet assay. The mutagenic effect of these genotoxins, as measured by the micronucleus test, similarly attenuated or prevented cytotoxicity and DNA damage. Treatment with DPDS also decreased lipid peroxidation levels after exposure to hydrogen peroxide MMS, and UVC radiation, and increased glutathione peroxidase activity in the extracts. In this manner, the results clearly demonstrate that DPDS at low concentrations presents antimutagenic properties, which are most probably due to its antioxidant properties. The genotoxic effects of DPDS in multiple organs (brain, kidney, liver, spleen, testes and urinary bladder) and tissues (bone marrow, lymphocytes) of mice using in vivo comet assay, was used to determine the threshold of dose at which it has beneficial or toxic effects in animals. DPDS induced DNA damage in brain, liver, kidney and testes in a dose response manner, in a broad dose range at 75-200 μmol/Kg with the brain showing the highest level of damage. Overall, our analysis demonstrated a high correlation among decreased levels of GSH content and an increase in lipid peroxidation and DNA damage. This finding establishes an interrelationship between pro-oxidant and genotoxic effects. In addition, DPDS was not genotoxic and did not increase lipid peroxidation levels in any organs at doses < 50 μmol/kg. Finally, pre-treatment with N-acetyl-cysteine completely prevented DPDSinduced oxidative damage by the maintenance of cellular GSH levels, reinforcing the positive relationship of DPDS-induced GSH depletion and DNA damage. In summary,DPDS induces systemic genotoxicity in mammals as it causes DNA damage in vital organs like brain, liver, kidney and testes. In view of its genotoxic properties, we investigated whether DPDS might be inducing DNA damage in MCF7 cells, a mammary adenocarcinoma cell line, using the in vitro alkaline comet assay. DPDS did not generate significant DNA damage in a dose response manner but the pre-treatment with DPDS potentiates the DNA damage induced by hydrogen peroxide, reinforcing a clear pro-oxidant ability. This finding supports the genotoxic effects of DPDS in mammalian tumor cells and suggests its potential in antiproliferative therapy.

O objetivo desse trabalho é avaliar o efeito fotoprotetor de três espécies de plantas da Antártica - Deschampsia antarctica Desv. , Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. E Polytrichum juniperinum Hedw. Investigou-se a ação do extrato metanólico de cada espécie contra os danos induzidos ao DNA, utilizando a linhagem celular de fibroblasto de pulmão de hamster chinês (células V79) e no molusco Cantareus aspersus utilizando o ensaio cometa em animais alimentados com esses vegetais. O perfil mutagênico e antimutagênco destes extratos também foi avaliado através de linhagens haplóides da levedura Saccharomyces cerevisiae. As concentrações empregadas desses extratos não foram citotóxicas nem mutagênicas em S.cerevisiae. Além disso, o tratamento com todos os extratos melhorou a sobrevivência e diminuiu a taxa de mutagênese induzida por UVC nesse modelo biológico. Os tratamentos empregados diminuíram significativamente os danos ao DNA induzidos pela UVC em células V79, como verificado pelo ensaio cometa. Esses extratos também reduziram a peroxidação lípidica induzida por UVC, mostrando uma clara propriedade antioxidante. Os resultados do ensaio cometa modificado, em células V79, empregando a Endonuclease V, demonstraram uma diminuição na formação de dímeros de ciclobutano piridina após a pré - incubação com estes extratos. O emprego das endonucleases FPG e ENDO III indica um efeito protetor destes extratos contra as lesões oxidativas geradas pelo UVC. Em linhagens de levedura deficientes em fotoliase, o tratamento com os extratos mostrou-se muito menos eficiente na proteção contra os danos citotóxicos da radiação UVC, sugerindo que esta via de reparação do DNA é estimulada por substâncias dos extratos. Em C.aspersus, o tratamento com os vegetais na alimentação dos moluscos, foi capaz de proteger contra os danos induzidos por UVC nas células da hemolinfa. Em conclusão, os extratos de D. antarctica, C. quitensis e P. juniperinum parecem possuir propriedades fotoprotetivas, o que pode ser atribuído a moléculas como flavonóides e carotenóides agindo como moléculas absorventes de UV, antioxidantes e estimulando processos de reparação do DNA. / This study aimed at deepening the knowledge on the photoprotective effects of three Antarctic plant species – Deschampsia antarctica Desv., Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl., and Polytrichum juniperinum Hedw. We investigated the protective effect against UV-induced DNA damage in a permanent lung fibroblast cell line derived from Chinese hamsters (V79 cells), and in the snail Cantareus aspersus, using the comet assay. The protective, mutagenic, and antimutagenic profile of these extracts also was evaluated using haploid strains of Saccharomyces cerevisiae. At the concentration range employed, the extracts were not cytotoxic or mutagenic to S.cerevisiae. In addition, the treatment with these extracts enhanced survival, and decreased induced reverse, frameshift, and forward mutations in a dose-response manner in all UV-C doses employed a. In addition, they did not generate DNA strand breaks in V79 cells, and the treatment significantly decreased DNA damage induced by UVC. These extracts significantly decreased UVC-induced lipid peroxidation in V79 cells, showing a clear antioxidant property. Moreover, results of comet assay cells, employing Fpg, EndoIII, and Endo V endonuclease in these cells, demonstrated significant reduction of UVC-induced DNA damage, oxidative damage, and production of cyclobutane pyrimidine dimers after preincubation with these extracts. The treatment with all tested extracts were much less efficient against UVC-induced cytotoxicity in the yeast strain defective in photolyase as compared to the wild type strain, suggesting that this DNA repair pathway is stimulated by substances present in the extracts. In C. aspersus, the treatment was able to protect against UVC-induced damage. In conclusion, D. antarctica, C. quitensis, and P. juniperinum extracts present photoprotective properties, which can be attributed to molecules, such as flavonoids and carotenoids, which act as UV-sorbing molecules and as antioxidants, as well as stimulate DNA-repair processes.

A resistência ao cloreto estanoso (SnCl2) nas células eucarióticas de levedura Saccharomyces cerevisiae é um produto de vários processos metabólicos. O mutante rad52 , deficiente no mecanismo de reparação recombinacional, incapaz de reparar quebras simples e duplas no DNA, foi o mais sensível ao íon metálico Sn²+. A resistência relativa dos mutantes rad e rad4 , deficientes na reparação por excisão de nucleotídeos (NER), mostrou-se significativamente elevada, indicando a participação dessa via na reparação dos danos causados pelo SnCl2. Uma série de mutantes defectivos na via de reparação por excisão de bases (BER), combinada com mutantes defectivos em NER, foi utilizada para determinar indiretamente o tipo de lesão causada pelo SnCl2 ao DNA. A DNA N-glicosilase (Ntg2p) mostrou-se, por sua vez, indispensável à reparação das lesões ao DNA induzidas pelo íon metálico Sn²+. A ausência do fator de transcrição Yap1, responsável pela resposta ao estresse oxidativo em leveduras, ocasionou o aumento da sensibilidade ao íon metálico Sn²+. Além disso, a sensibilidade dos mutantes sod1 e sod2 revelou a importância das enzimas antioxidantes Sod1p e Sod2p na resposta aos danos gerados pelo íon metálico Sn²+. A sensibilidade mais elevada ao SnCl2 foi observada quando as células estavam na fase exponencial de crescimento (fase LOG), o que sugere que há dois sistemas independentes (um mediado pela repressão/desrepressão catabólica, e outro, pela ativação da transcrição de genes envolvidos nas vias de defesa contra espécies reativas de oxigênio (EROs)), que atuam em conjunto e contribuem para a resistência aos danos causados pelo íon metálico Sn²+. Para determinar a concentração do íon metálico Sn²+ captada nas células da levedura S. cerevisiae e correlacioná-la com a toxicidade desse íon metálico, foi determinado o conteúdo de metal intracelular pelo método de Emissão de Raios-X Induzida por Partículas Carregadas, ou Particle Induced XRay Emission (PIXE), desenvolvendo-se um protocolo para as análises. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem diplóide XS2316 captou 60% da quantidade total do íon metálico Sn²+, captada pela linhagem haplóide XV184-14c. Isso indica que a linhagem haplóide capta maior quantidade do íon metálico Sn²+ do que a linhagem diplóide, o que pode explicar a citotoxicidade diferenciada de ambas as linhagens quando tratadas com SnCl2. Por fim, utilizando-se a mesma metodologia, foi realizada uma análise multielementar para avaliar se havia uma interação entre o íon metálico Sn²+ e outros elementos químicos essenciais para a célula. De acordo com as análises por PIXE, após tratamento com SnCl2, a linhagem haplóide XV185-14c apresentou um decréscimo significativo nas quantidades de Mg, Zn, S e Fe, e, por outro lado, um aumento na quantidade de P. Para verificar como o íon metálico Sn²+ é captado, distribuído e destoxificado, foram associadas técnicas moleculares, incluindo ensaios de citotoxicidade e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), com a metodologia do PIXE. Os ensaios de sobrevivência mostraram que Fet4 e Zrt2, ambas proteínas de transporte de baixa afinidade do ferro e zinco, respectivamente, podem internalizar o íon metálico Sn²+. Por sua vez, qRT-PCR mostrou um aumento da expressão gênica de CCH1 e MID1, os quais codificam as proteínas Cch1 e Mid1, envolvidas no transporte de Ca²+ na membrana plasmática, sugerindo que essas duas proteínas também podem estar envolvidas na captação do íon metálico Sn²+. Os resultados indicaram que, uma vez dentro da célula, o íon metálico Sn²+ pode ser armazenado no vacúolo através da ação da proteína P-type ATPase Pmc1 e quelado no citoplasma pela metalotioneína Crs5. Alternativamente, o íon metálico Sn²+ pode gerar EROs, em especial o ânion superóxido (O2 -), o qual pode ser dismutado pela proteína Sod1, formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (.OH). Consequentemente, as EROs podem induzir a transcrição de vários genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, como SOD1, YAP1 e APN1. Para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na genotoxicidade do íon metálico Sn²+, foi avaliada a indução de quebras causadas pelo SnCl2 na presença de formamidopirimidina (FPG) e endonuclease III (ENDO III), bem como a interferência desse íon na reparação das lesões induzidas pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) em células de pulmão de hamster chinês (V79) pelo ensaio cometa. Os resultados mostraram que, em concentrações tóxicas, o íon metálico Sn²+ induziu somente uma limitada elevação nos sítios sensíveis de FPG e ENDO III, sugerindo que o íon metálico Sn²+ preferencialmente não induz lesões oxidativas nas bases nitrogenadas. Embora a concentração de 50 μM de SnCl2 não tenha produzido um aumento significativo na quantidade de danos ao DNA, ela foi capaz de inibir a reparação dos danos provocados pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) durante o período de pós-tratamento de 24h. Os resultados demonstraram o efeito genotóxico e comutagênico do SnCl2 em células V79. O efeito inibitório do íon metálico Sn²+ na reparação dos danos induzidos pelo MMS no DNA sugeriu que esse metal também pode interferir em sistemas de reparação do DNA, que contribuem para o aumento de mutações pela alteração do equilíbrio entre o processo de reparação livre de erro e o sujeito a erro. / Resistance to stannous chloride (SnCl2) of the yeast Saccharomyces cerevisiae is a product of several metabolic pathways of this unicellular eukaryote. The recombination deficient rad52 mutant, unable to repair DNA single and double strand breaks was the most sensitive. The relative resistance of mutant strains rad2 e rad, deficient in nucleotide excision repair (NER), was rather high, indicating a minor but significant contribution to repair of Sn²+ -induced DNA lesions by this repair pathway. A series of mutants defective in different base excision repair (BER) pathway, combined with NER were used to indirectly determine the type of SnCl2-produced DNA lesion. The Ntg2p DNA N-glycosylase seems to be indispensable for repair of Sn²+ -induced DNA lesions. Lack of transcription factor Yap1p, responsible for the oxidative stress response in yeast, led to increase in Sn²+ -sensitivity. In addition, sensitivity of the superoxide dismutase mutants sod1 and sod2 revealed the importance of these anti-oxidative defence enzymes against Sn²+ -imposed DNA damage. The highest SnCl2 -sensitivity, however, was observed in glucose-repressed pre-diauxic shift exponentially growing cells (LOG cells). It has been suggested that two independently acting anti-ROS protective systems (one mediated by glucose repression/de-repression, the other via ROS-inducible transcription activators) are working together, and that both contribute to Sn²+ -resistance. To determine the concentration of Sn²+ ions cells of the S. cerevisiae and to correlate their quantity with the toxicity, the intracellular metal content of yeast cells was determined by Particle Induced X-ray emission (PIXE). A thick target protocol was developed for PIXE analysis. The PIXE analysis suggested that diploid (XS2316) cells absorbed about 60% of the total amount of Sn²+ absorbed by the haploid (XV185-14c) yeast cells. This indicates that Sn²+ absorption is better in haploid yeast cells and agrees well with published toxicity results. Finally, we performed a screening in order to know the putative interactions between Sn²+ and other essential elements. According to PIXE analysis, the results for XV185-14c yeast cells indicate a significant loss of intracellular elements such as Mg, Zn, S, Fe and an increase of P levels after 1 h exposure to 25 mM SnCl2 in STAT phase. In order to verify how Sn²+ is uptaken, distributed and detoxified, we associated molecular techniques including survival assay and quantitative real time PCR (qRT-PCR) with PIXE. The survival assay showed that Fet4p and Zrt2p both low-affinity iron and zinc transporters, respectively, may internalize Sn²+. By its turn, qRT-PCR showed an increased in CCH1 and MID1 gene expression, which encode for the cytoplasmic transmembrane Ca²+ transporters Cch1p and Mid1p, suggesting that both proteins may also take up Sn²+. Our data also indicated that once inside the cell, Sn²+ may be taken up from the cytosol by a P-type ATPase to the vacuole (Pmc1p) or may be chelated by Crs5p metallothionein in the cytosol. Alternatively, Sn²+ may generate reactive oxygen species (ROS), especially O2 - which can be dismutate to form H2O2 and the highly reactive OH. In consequence, ROS can induce cellular injury and stress-generated activation of many genes, e.g., SOD1, YAP1, and APN1. In order to clarify the molecular mechanisms of Sn²+ genotoxicity, we evaluated the induction of strand breaks, FPG and ENDO III sensitive sites, and the interference with the repair of MMS-caused DNA damage in V79 Chinese hamster lung fibroblasts exposed to stannous chloride by comet assay. Our results demonstrated that Sn²+ induced only a limited elevation in FPG and ENDO III sensitive sites in toxic concentrations. This suggests that stannous ion does not preferentially induce base modifications that are the substrate of FPG and ENDO III enzymes in V79 cells. Although 50 µM SnCl2 concentration did not increase significantly the DNA migration by itself in comet assay, it was capable to inhibit the repair of MMSinduced DNA damage during the pos-treatment period of 24h. Our results demonstrate the genotoxic and comutagenic effects of stannous chloride in V79 cells. The inhibitory effect of Sn²+ on repair of MMS-induced DNA damage suggests that this metal can also interfere in DNA repair systems thus contributing to increased mutation by shifting the balance from error-free to error-prone repair processes.

A composição química dos extratos e frações de B. trinervis do Brasil e da Colômbia foi analisada. 13 compostos foram descritos pela primeira vez em B. trinervis, 8 deles foram identificados por HRMS-ESI-MS e 5 foram descritos por HPLC. Os compostos identificados por HPLC encontram-se em maior concentração no extrato aquoso da Colômbia em relação ao extrato aquoso de Brasil, adicionalmente, a luteolina foi identificada unicamente no extrato aquoso de Colômbia. Após exposição aos extratos e frações de B. trinervis foram observados efeitos doses dependentes na sobrevivência celular e indução de genotoxicidade avaliados pelo teste MTT, ensaio clonogênico e cometa alcalino respectivamente. As frações acetato de etila de ambos os países apresentaram maior atividade citotóxica e genotóxica quando comparadas com as outras frações, sendo mais evidente na fração acetato de etila de Colômbia. Este efeito pode ser explicado pela capacidade pró-oxidante dos compostos umbeliferona, diterpenos labdano, rutina, ácido elágico, ácido cafeico, ácido rosmarínico e luteolina e seu efeito sinérgico na mistura complexa da fração. A redução dos danos induzidos pelo peroxido de hidrogênio evidenciado pelo cometa alcalino com e sem enzimas de reparo de DNA (FPG e ENDO III) demonstra o efeito antigenotóxico dos extratos e frações de B. trinervis do Brasil e da Colômbia. Os extratos aquosos e as frações acetato de etila de ambos os países evidenciaram efeito protetor contra os danos oxidativos induzidos pelos peroxido de hidrogênio, por capacidade antioxidante. Os efeitos citotóxicos, genotóxicos, antigenotóxicose antioxidantes dos extratos e frações de B. trinervis do Brasil e da Colômbia podem ser explicados pela presença de umbeliferona, diterpenos labdano, rutina, ácido elágico, ácido cafeico, ácido rosmarínico e luteolina. Estes compostos podem agir como pró-oxidantes ou antioxidantes dependendo da concentração. / The chemical composition of extracts and fractions of B. trinervis from Brazil and Colombia was analyzed. Thirteen compounds were described for the first time in B. trinervis using two methods, by HRMS-ESI-MS were identified eight compounds and, by HPLC five compounds. Thirteen compounds were described for the first time in B. trinervis by HRMS-ESI-MS (eight compounds) and HPLC (five compounds). In relation to the compounds identified by HPLC, the aqueous extract of Colombian B. trinervis had highest concentration than the Brazilian counterpart; additionally, Luteolin was identified only in Colombian aqueous extract. Chinese hamster ovary (CHO) cells were treated with extracts and fractions of B. trinervis from Brazil and Colombia. Doses dependent effects in cell survival and induction of genotoxicity were observed in the MTT, cloning ability forming, and alkaline comet assays. Ethyl acetate fractions from both countries had highest cytotoxic and genotoxic activity than the other fractions; the ethyl acetate fraction of Colombian B. trinervis showed highest cytotoxic activity. This effect can be explained by the pro-oxidant capacity of umbelliferone, rutin, ellagic acid, caffeic acid, rosmarinic acid, luteolin, and labdane type diterpens and their synergistic effect on fraction complex mixture.The reduction of DNA damage induced by hydrogen peroxide was evidenced by alkaline comet assay with and without DNA repair enzymes (FPG and ENDO III) evidencing the antigenotoxic effect of extracts and fractions of B. trinervis from both countries. Aqueous extracts and ethyl acetate fractions from both countries showed highest protective effects against oxidative damage induced by hydrogen peroxide due to the antioxidant capacity. Cytotoxic, genotoxic, antigenotoxic and antioxidant effects of extracts and fractions of B. trinervis can be explained by the presence of umbelliferone, labdane type diterpens, rutin, ellagic acid, caffeic acid, rosmarinic acid and Luteolin. These compounds can act as antioxidants or pro-oxidant depending on their concentrations.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T12:08:34Z No. of bitstreams: 2 TESE Jeanne Cristina Lapenda Lins Gantalice.pdf: 5843613 bytes, checksum: 7a0d4c576fb77e7f12a07cfcb1758e30 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T12:08:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Jeanne Cristina Lapenda Lins Gantalice.pdf: 5843613 bytes, checksum: 7a0d4c576fb77e7f12a07cfcb1758e30 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / CNPq; CAPES / A prodigiosina, pigmento vermelho natural, é um alcaloide produzido por Serratia marcescens e pertencente à família das prodigininas cujos pigmentos apresentam em sua estrutura química três anéis cíclicos pirrólicos. Este pigmento tem despertado, nos últimos anos, um crescente interesse das diversas áreas como médica, farmacêutica e industrial pela inúmeras atividades biológicas descritas como antimicrobianas, antimalárica e antitumoral. Este trabalho tem por objetivo avaliar a atividade antimicrobiana da prodigiosina frente a micro-organismos Grampositivos e Gram-negativos patogênicos, avaliar a atividade citotóxica do pigmento em linhagens de células tumorais e seus os efeitos genotóxicos. O pigmento vermelho foi isolado e identificado a partir da biomassa de Serratia marcescens UFPEDA 398 cujas as frações foram separadas e purificadas por cromatografia em coluna TLC, identificadas por cromatografia em camada delgada CCD e caracterizadas por cromatografia de massa GCMS sendo em seguida os dados obtidos comparados com a biblioteca computadorizada de valores em massa / elétrons (m / e) onde o pigmento vermelho caracterizado correspondeu a prodigiosina com máxima absorção em 534 nm e peso molecular de 323. Para avaliar a atividade antimicrobiana da prodigiosina foram realizados testes de difusão em discos frente aos micro-organismos Escherichia coli UFPEDA 224, Pseudomonas aeruginosa UFPEDA 39, Staphylococcus aureus UFPEDA 01, Enterococcus faecalis UFPEDA 138, Streptococcus pyogenes UFPEDA 07, Acinetobacter sp UFPEDA 994 e a determinação da concentração mínima inibitória e mínima bactericida (CMI e CMB) frente a 20 linhagens de Staphylococcus aureus oxacilina resistente (ORSA). Os antibióticos padrões utilizados nos testes em discos foram ampicilina, cloranfenicol, gentamicina (10 g). Os testes de difusão em discos demostraram significativos halos inibitórios para Staphylococcus aureus (35 ± 0.6), Enterococcus faecalis (22 ± 1.0) e Streptococcus pyogenes (14 ± 0.6) sugerindo sensibilidade destes micro-organismos a prodigiosina. Contudo, o mesmo resultado não foi observado para Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter não sendo observados formação de halos inibitórios significativos e portanto, sugerindo resistencia dos mesmos ao pigmento. As CMI’s encontradas para Staphylococcus aureus variaram de 1 a 4 g / mL, enquanto as CMB’s entre 2 e 16 g / mL. Estes resultados demostram ser bastante promissores quando comparados com o antibiótico padrão oxacilina (CMI 128 g / mL e CMB ≥ 128 g / mL). Os efeitos citotóxicos da prodigiodiosina frente as linhagens tumorais NCHI 292, Hep 2, MCF 7 e HL 60 foram bastante significativos destacando maio efeito citotóxico para alinhagem tumoral Hep 2 (IC50 3,4 g / mL).Contudo a linhagem MCF 7 apresentou leve resistência ao pigmento (IC50 5,1 g / mL). Foi observado também que o pigmento induziu apoptose para as linhagens tumorais em 90%. Foram observados para a prodigiosina efeitos genotóxicos estatisticamente significativos em células mononucledas de sangue periférico humano como também em linhagens tumorais demonstranto que o pigmento age resultando em danificação genômica com efeito genotóxico superior a doxorrubicina e que não apresenta alvo de ação específico. Neste sentido, com base nos dados encontrados neste trabalho a Serratia marcescens UFPEDA 398 apresentou promissora atividade antimicrobiana, citótoxicidade e genotóxica para linhagens de células tumorais e ainda, efeitos genotóxicos em células normais demonstrando a sua ação não seletiva. Desta forma o pigmento prodigiosina ainda não pode ser empregado nas terapias antineoplásicas, uma vez que por apresentar alvo de ação não específico induz graves danificações as células normais que podem causar morte celular ou mutações que são as principais causas da tumorigênese.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:57:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10672_Dissertação Final Thammyres de Assis Alves20170605-150928.pdf: 2091612 bytes, checksum: ac1e81c6cbce93b1fd0710992bab6e48 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / O uso dos agrotóxicos traz muitos benefícios econômicos para a agricultura, no entanto, sua nocividade ao meio ambiente e à saúde humana são debatidos. Os herbicidas têm se destacado entre os agroquímicos mais aplicados no campo, tendo como objetivo o controle de plantas daninhas. Porém, existem vários relatos de plantas resistentes à determinados herbicidas, se fazendo necessário, uma constante busca por novos herbicidas e por métodos de controle alternativo. Nesse sentido, os metabólitos secundários com efeito alelopático, têm grande potencial para serem usados como bioherbicidas, bem como, podem servir de estruturas modelo na obtenção de semissintéticos, com a introdução de grupos químicos que estão presentes nas estruturas de herbicidas comerciais já estabelecidos. Dentre os diferentes compostos alelopáticos de baixa massa molecular, que são de fácil obtenção, por serem comercializados na forma pura, estão o timol, carvacrol, guaiacol e eugenol. Para análise do potencial de moléculas para uso como herbicidas são realizados diversos testes de toxicidade, tais como: análises fitotóxicas, que avaliam o desenvolvimento inicial de plântulas; citotóxicas, que avaliavam o ciclo celular e os cromossomos; e genotóxicas que analisam o DNA dos indivíduos expostos ao componente teste. Assim, esse trabalho objetivou avaliar o efeito, em baixa concentração (0; 0,375; 0,750; 1,50 e 3 mmol.L-1), das moléculas naturais eugenol, guaiacol, timol e carvacrol e dos seus respectivos ácidos fenoxiacéticos semissintéticos através de bioensaios vegetais. Para tanto realizou-se testes de germinação e desenvolvimento inicial de plântulas de Lactuca sativa e Sorghum bicolor, avaliação de alterações no ciclo mitótico de células meristemáticas de raizes de L. sativa, além dos efeitos do carvacrol e do ácido carvacroxiacético (3mmol.L-1) no DNA de L. sativa e S. bicolor. Observou-se redução nos parâmetros de fitotoxicidade e no índice mitótico nas maiores concentrações testadas, além de aumento nas alterações nucleares e cromossômicas, quando comparados ao controle negativo. Os resultados moleculares demonstraram que o carvacrol e o ácido carvacroxiacético são tão tóxicos quanto o herbicida 2,4-D. Indicando dessa forma, a fito, cito e genotoxicidade das moléculas para sementes de S. bicolor e L. sativa.

Corantes são utilizados na coloração de diferentes substratos, incluindo papel, couro e plásticos, mas o uso mais importante é o têxtil e 1 a 5% destes corantes podem ser descartados no ambiente. Em geral, os corantes do tipo azo são tóxicos para os organismos aquáticos e alguns tipos de corantes podem ser mais tóxicos que outros. Mas, embora estes compostos e seus produtos de transformação reduzidos e/ou clorados podem ser encontrados no ecossistema aquáticos, não existem dados sobre genotoxicidade em organismos aquáticos até o momento. Muitos estudos têm demonstrado que avaliar danos ao DNA representa um biomarcador de exposição muito sensível em espécies aquáticas, que pode ser estudado utilizando ensaios in vivo e in vitro, como no caso das linhagens de células de peixe. Os objetivos deste trabalho foram: avaliar a ocorrência de corantes dispersos em amostras ambientais; avaliar a mutagenicidade dessas amostras utilizando o ensaio de Salmonella/microssoma com as linhagens TA98 e YG1041, e a genotoxicidade com o ensaio do cometa em culturas celulares de peixe RTL-W1. HPLC-MS/MS foi utilizada para verificar a ocorrência de corantes em amostras do Rio Piracicaba à montante e à jusante do Ribeirão Quilombo e do descarte de uma Estação de Tratamento de Efluentes (ETE), localizados no Estado de São Paulo, Brasil. Foram detectados seis corantes dispersos nas amostras de águas superficiais e efluentes. O corante Disperse Red 1 foi o composto mais frequente, detectado em 8 das 16 amostras, porém sua contribuição para a mutagenicidade total foi baixa; os corantes Disperse Blue 373 e Disperse Violet 93 foram os que mais contribuíram. A genotoxicidade do Rio Piracicaba, avaliada pelo ensaio de Salmonella/microssoma e ensaio do cometa, aumentou após o lançamento do Ribeirão Quilombo e do efluente ETE, mostrando uma possível contribuição destes na genotoxicidade do Rio Piracicaba. / Dyes are used in the coloration of different substrates, including paper, leather and plastics, but the most important use is on textiles and 1 to 5% of these dyes might be lost into the environment. Azo dyes are the most important class, accounting for over 50% of all commercial dyes, and this class has been the most studied. In general, azo dyes are toxic to aquatic organisms and some types of dyes are more toxic than others. But although these compounds as well as their reduced/chlorinated transformation products can be found in aquatic ecosystems, no mutagenicity data are available until now in aquatic organisms. This remark remains of value, as well, regarding genotoxicity potential of such dyes towards aquatic organisms. Many studies have demonstrated that DNA damage measurement represents a very sensitive biomarker of exposure in aquatic species that can be studied both in vivo and in vitro using for example fish cell lines. The objectives of this work were evaluate the occurrence of disperse dyes in environmental samples; evaluate the mutagenicity of this samples using the Salmonella/microsome assay with strains TA98 and YG1041; evaluate the genotoxicity using the comet assay with fish cell lines RTL-W1. HPLC-MS/MS was used to verify the occurrence of dyes in samples of Piracicaba River upstream and downstream the discharge of Quilombo River and Wastewater Treatment Plant (WWTP) effluent, located in São Paulo State, Brazil. Six dyes were detected in samples of water and effluents. Disperse Red 1 dye was detected in 8 of 16 samples, but its contribution for the mutagenicity was low. Disperse Blue 373 and Disperse Violet 93 were the major contributors for the mutagenicity found in the samples. The genotoxicity of Piracicaba River, evaluated with Salmonella/microsome assay and comet assay, increased after the discharges of Quilombo River and the effluent of WWTP, showing a contribution of this discharges on the river genotoxicity.

Submitted by Helena Bejio (helena.bejio@unioeste.br) on 2018-05-09T11:35:29Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Julio Cesar Queiroz.pdf: 2479458 bytes, checksum: 850d67cb918609c58aa963ed68374e58 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-09T11:35:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Julio Cesar Queiroz.pdf: 2479458 bytes, checksum: 850d67cb918609c58aa963ed68374e58 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of this study was to verify the efficiency of the agrochemicals/ contaminants Methyl paration, Cypermethrin, Azadirachtin and Pyroligneous extract in the control of dragonfly naiads (P. flavescens) during the larviculture of the catfish (Rhamdia quelen) as well as to investigate the predation and the possible genotoxic, histopathological and neurotoxic damages that can cause in the larvae. Three trials were performed. In the first, different doses of each product were tested to determine lethal and lethargic doses. For this, 270 naiads were used for each product tested and 9 for control, totaling 1089 animals. The naiads were distributed in aquariums with a total volume of 1L in triplicates. To determine the doses, it started with an overdose (1000 μl / L-1) and then observed the time in which the naiads lead to death. The doses were gradually decreased in 100 μl and below that dose the decrease was in 5μl intervals. In the second trial, the doses determined in test I were used. Predation tests on product exposure were performed in aquaria with a total volume of 1L, arranged in triplicates for each test dose plus control. In each aquarium a nymph of dragonfly and 10 catfish larvae were arranged, observing the amount of larvae consumed in the lethal time of exposure to the product, as determined in the previous test. The design was completely randomized with nine treatments and three replicates, totaling 27 experimental units. The treatments were constituted by the doses of each product. In the third trial were carried out for 30 days the catfish larviculture with exposure to the products. 4000 catfish larvae were used with 120 hours post-hatching (HPE), randomly distributed in 20 tanks with a total volume of 70 l. The doses were applied at intervals of 7 days, simulating the egg laying cycle and hatching of the dragonfly nymphs. The water replacement was done daily at 5% along with cleaning the aquariums. The experimental design was completely randomized with five treatments and four replicates, totaling 20 experimental units. Eight lethal and lethargic doses were planned: 5 μl / L for Methyl paration, 10 μl / L for Cypermethrin, 30, 25 and 20 μl / L for Azadirachtin and 20, 15 and 10 μl / L for the Pyroligneous extract. In the predation tests, the treatment containing Azadirachtin at the doses of 30, 25 and 20 μl / L suggests survival of up to 43% of the larvae, Pyroligneous extract 25.6%, Cypermethrin and Methyl paration 87 and 73%, respectively. In the third trial after the larviculture were not evidenced any index of histopathological damage in liver and gills. The comet assay suggests that Cypermethrin and Methyl paration cause damage to DNA. The enzyme acetylcholinesterase was inhibited only by Methyl paration. The use of nim oil may be a natural alternative to use of agrochemicals in cultivation tanks in catfish larviculture (Rhamdia quelen), considering that it does not present toxicity to animals and predation is significantly reduced. / O objetivo deste estudo foi verificar a eficiência dos agroquímicos/contaminantes Paration metílico, Cipermetrina, Azadiractina e Extrato pirolenhoso no controle de náiades de libélula (P. flavescens) durante a larvicultura do jundiá (Rhamdia quelen), assim como, averiguar a predação e os possíveis danos genotóxicos, histopatológicos e neurotóxicos que podem causar nas larvas. Foram realizados três ensaios. No primeiro foram testadas diferentes doses de cada produto para determinar as doses letais e letárgicas. Para isso, foram utilizados 270 náiades para cada produto testado e 9 para o controle, totalizando 1089 animais. As náiades foram distribuídas em aquários com volume total de 1L em triplicatas. Para determinar as doses, iniciou com uma superdose (1000 µl/L-1) e em seguida foi observado o tempo em que as náiades levam até o óbito. As doses foram diminuídas gradativamente em 100 μl e abaixo dessa dose, a diminuição foi em intervalos de 5μl. No segundo ensaio foram utilizadas as doses determinadas no ensaio I. Testes de predação em exposição aos produtos foram realizados em aquários com volume total de 1L, dispostos em triplicatas para cada dose teste acrescido do controle. Em cada aquário foi disposta uma ninfa de libélula e10 larvas de jundiá, observando a quantidade de larvas consumidas no tempo letal de exposição ao produto, conforme determinado no ensaio anterior. O delineamento foi inteiramente casualizado com nove tratamentos e três repetições, totalizando 27 unidades experimentais. Os tratamentos foram constituídos pelas doses de cada produto. No terceiro ensaio foi realizada a larvicultura do jundiá por 30 dias com exposição aos produtos. Foram utilizadas 4000 larvas de jundiá com 120 horas pós-eclosão (HPE), distribuídas aleatoriamente em 20 aquários com volume total de 70L. As doses foram aplicadas em intervalos de 7 dias, simulando o ciclo de postura dos ovos e eclosão das ninfas de libélula. A substituição de água foi feita diariamente em 5%, juntamente com a limpeza dos aquários. O delineamento desse ensaio foi inteiramente casualizado com cinco tratamentos e quatro repetições, totalizando 20 unidades experimentais. Foram deliberadas oito doses letais e letárgicas: 5µl/L para o Paration metílico, 10 µl/L para a Cipermetrina, 30, 25 e 20 µl/L para a Azadiractina e 20, 15 e 10 µl/L para o Extrato pirolenhoso. Nos testes de predação, o tratamento contendo Azadiractina nas doses de 30, 25 e 20 µl/L sugere sobrevivência de até 43% das larvas, o Extrato pirolenhoso 25,6%, a Cipermetrina e o Paration metílico 87 e 73%, respectivamente. No terceiro ensaio após a larvicultura, não foram evidenciados qualquer índice de possíveis danos histopatológicos em fígado e brânquias. O ensaio cometa sugere que a Cipermetrina e o Paration metílico causam danos ao DNA. A enzima acetilcolinesterase foi inibida somente pelo Paration metílico. A utilização do óleo de nim pode ser uma alternativa natural a utilização de agroquímicos em tanques de cultivo na larvicultura do jundiá cinza (Rhamdia quelen), tendo em vista que não apresenta toxicidade aos animais e a predação é reduzida significativamente.

O ensaio de frequência de micronúcleos é uma técnica importante utilizada para avaliar danos genotóxicos de agentes químicos ou físicos (como radiação ionizante) em células, baseado na quantificação de células contendo micronúcleos, que são fragmentos derivados de DNA danificado com coloração semelhante ao dos núcleos principais, mas com 5 a 30% do seu tamanho. Tradicionalmente, este ensaio é realizado usando microscopia de coloração convencional de acordo com Giemsa, mas atualmente esta técnica está sendo atualizada para uma abordagem automatizada que se baseia na dissolução da membrana plasmática por detergentes levando em conta apenas núcleos e micronúcleos com seu DNA corados por corantes fluorescentes, que pode discriminar núcleos de células viáveis dos das células inviáveis e permite a contagem por citometria de fluxo. Este trabalho avaliou a extensão de dano genotóxico radioinduzido por radiação gama (60Co) em doses entre 0,5 e 16Gy, e o potencial genotóxico de três peptídeos utilizados em medicina nuclear (PSMA-617, PSMA-11 e Ubiquicidina 29-41). As membranas celulares foram lisadas na presença dos corantes SYTOX&reg; Green e EMA, e núcleos marcados com os dois fluorocromos foram considerados provenientes de células inviáveis e, portanto, removidos da análise. As quantidades de micronúcleos (porcentagem de eventos) nas amostras, foram proporcionais às doses de radiação, e puderam ser ajustadas a um modelo linear-quadrático (R2 = 0,993). Somente doses mais altas (8 e 16 Gy) e controles positivos induziram aumentos relevantes nas quantidades de micronúcleos. Os radiofármacos foram testados com concentrações de 0,1x, x, 10x e 100x a concentração utilizada em adultos, e não induziram dano em concentrações praticáveis. / The micronucleus frequency assay is an important technique used to evaluate genotoxic damage of chemical or physical agents (such as ionizing radiation) in cells, based on the quantification of micronucleus-containing cells, which are fragments derived from damaged DNA with similar coloration to of the main nuclei, but with 5 to 30% of its size. Traditionally, this assay is performed using conventional staining microscopy according to Giemsa, but currently this technique is being updated to an automated approach that relies on the dissolution of the plasma membrane by detergents taking into account only nuclei and micronuclei with their DNA stained by dyes fluorescence, which can discriminate nuclei from unviable or living cells and allows counting by flow cytometry. The genotoxic potential of three peptides used in nuclear medicine (PSMA-617, PSMA-11 and Ubiquicidine 29-41) was evaluated by gamma radiation (60Co) at doses in the range among 0.5 and 16Gy. Cell membranes were lysed in the presence of the SYTOX&reg; Green and EMA dyes, and cores labeled with the two fluorochromes were considered to be from non-viable cells and therefore removed from the analysis. The amount of micronucleus (percentage of events) in the samples was proportional to the radiation doses, and could be adjusted to a linear-quadratic model (R2 = 0.993). Only higher doses (8 and 16 Gy) and positive control induced significant increases in micronucleus amounts. Radiopharmaceuticals were tested at concentrations of 0.1x, 1x, 10x, and 100x the concentration used in adults, and did not induce damage at feasible concentrations.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wanessa Fernandes Carvalho.pdf: 6063093 bytes, checksum: 0ea1cba23ab3d2a3ae295a8c03e44030 (MD5) Previous issue date: 2014-02-10 / Os agrotóxicos tem sido alvo de preocupação por parte dos diversos segmentos da sociedade, uma vez que o uso indiscriminado (regido por fatores, como: uso inadequado, alta toxicidade, falta do uso de equipamentos de proteção e precariedade dos mecanismos de vigilância) podem gerar impactos ambientais, sociais e sanitários. A exposição ocupacional de trabalhadores agrícolas ocorre por falta de informação ou recursos técnicos qualificados. Um dos problemas da utilização de agrotóxicos é a genotoxicidade de tais produtos o que pode acarretar danos genéticos. Pouco se sabe sobre a relação entre a genotoxidade e a variação dos polimosfismos genéticos de metabolização de xenobióticos que podem modificar a suscetibilidade individual aos possíveis efeitos genotóxicos dos agrotóxicos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito genotóxico e mutagênico da exposição ocupacional aos agrotóxicos, verificando a variabilidade polimórfica dos genesGSTM1 e GSTT1 em indivíduos expostos a pesticidas, associados à intoxicação, em municípios do estado de Goiás, com intensa atividade agrícola. Foram avaliados 71 trabalhadores rurais com histórico de exposição ocupacional a pesticidas e 68 controles, que apresentaram as mesmas condições socioambientais (idade, fumo, álcool). Os danos no DNA foram avaliados utilizando o teste do micronúcleo e o ensaio cometa. Para estes ensaios foram selecionados os seguintes parâmetros: comprimento da cauda do cometa, porcentagem de DNA na cauda e momento da cauda de Olive. As amostras de DNA foram obtidas a partir de linfócitos de sangue periférico utilizando o kit Ilustra MS ® (GE, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Para a reação da PCR foi utilizado SYBR ® Green PCR Master Mix (AppliedBiosystems ®, EUA). A estimativa de danos genômicos para os trabalhadores que não utilizavam EPI foi de 0,82 + 0,990, para o comprimento do cometa, 0,78 + 0,94 para % de DNA na cauda e 0,20 + 1,06 para momento da cauda de Olive, demostrando assim diferença estatisticamente significativa entre os parâmetros. O estudo demonstrou uma taxa relativamente alta de micronúcleos 5,42 + 7,32 e células binucleadas 10,37 + 8,66, em indivíduos expostos que não usavam equipamentos de proteção individual (EPI), indicando que o uso destes equipamentos pode ter efeito protetor contra os agrotóxicos (p<0,001). A distribuição da frequência de GSTM1 e GSTT1 nulos no grupo exposto foi observada em 43,66% e 21,12% respectivamente, e o grupo controle apresentou deleção de GSTM1 em 39,70% dos indivíduos, e para GSTT1, 29,41% dos indivíduos apresentaram a deleção. No entanto, não houve um aumento no risco de intoxicação para os genótipos nulos.