Habil.-Schr. Univ. Frankfurt (Main), 2007.

Gene therapy is a promising treatment option for cancer. Ideally, a therapeutic gene is delivered specifically into tumor cells sparing the neighboring normal cells. For this purpose gene delivery vectors are designed that can recognize structures, which are exclusively expressed on tumor cells (i.e. the tumor-associated antigens -TAA-). Retroviral vectors are commonly used for gene therapy by modifying the envelope protein responsible for the recognition of the target cell. The Vesicular Stomatitis Virus G protein (VSV-G) is a well-liked choice for pseudotyping the retroviral vectors since it confers on the viral particle stability to allow concentration to high titers necessary for the clinical applications. However, the main drawback of VSV-G, the ubiquitously expressed receptor and thus the broad target range, hinders the use of this protein for targeted gene therapy. In this thesis, we aimed to modify the VSV-G for targeted gene therapy against Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) -expressing tumors. Therefore we followed two approaches. The first approach comprised of the fusion of a single-chain antibody fragment against PSCA to the N-terminus of VSV-G. In the second approach the VSV-G was modified by insertion of a small epitope. We could demonstrate that two positions in the N-terminal region of VSV-G protein permit insertion of a ten amino acid long epitope. These mutant VSV-G proteins were successfully assembled into retroviral particles. We demonstrated that the mutant retroviral particles can be used for targeting to PSCA-positive cells using nanobeads. The nanobeads were chemically coupled to antibodies against the epitope in the VSV-G protein and PSCA on the tumor cell. These bispecific nanobeads allowed the recruitment of mutant retroviral particles to the PSCApositive cells. Our results point out the potential of these mutant retroviral particles in targeted gene delivery. Further studies will be necessary to assess the efficiency of in vivo targeted gene therapy using these mutant retroviral particles.

Einleitung: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. Bis heute gibt es keine ursächliche Therapie für die Herzinsuffizienz, die die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl von unterschiedlichen kardialen Erkrankungen bildet. Auch die Gentherapie hat in der Kardiologie, anders als in anderen Bereichen, noch keinen großen Fortschritt erzielen können. Das Kalziumsensorprotein S100A1 stellt aber einen vielversprechenden Kandidaten für die kardiale Gentherapie dar, da es als zentraler Regulator der Herzfunktion und des Kalziumsignalwegs innerhalb der Kardiomyozyten identifiziert werden konnte. Ziele der Untersuchungen: Diese translationale Studie sollte dazu beitragen, dem Ziel einer kardialen Gentherapie der kardialen Dysfunktion einen Schritt näher zu kommen. Zum einen sollte hierzu ein auf adeno-assoziierten Viren (AAVs) basierender Vektor (rAAV) des Serotyps 5 in Verbindung mit einem kardiospezifischen Promotor (CMVenh/0,26 kb-MLC) auf seine Anwendbarkeit und Sicherheit für die kardiale Gentherapie untersucht werden. Durch eine umfangreiche Testung auf präexistierende neutralisierende Serumfaktoren (NSF) sollte zudem untersucht werden, ob das Schwein generell ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte präklinische Studien darstellt. Zum anderen sollte in einem endpunktbasierten Studiendesign der Effekt der hS100A1-Gentherapie nach Myokardinfarkt (MI) im humanrelevanten Großtiermodell weiter charakterisiert werden. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden 83 juvenile Schweine aus einem kommerziellen Herkunftsbetrieb verwendet. Vor Versuchsbeginn wurde das Serum von 40 Tieren mittels eines auf Durchflusszytometrie basierenden Zellreporter-Assays auf präexistierende NSF gegen AAV5 untersucht. Für die Hauptstudie wurde bei 8 Tieren eine 2 stündige perkutane Okklusion des Ramus circumflexus der linken Koronararterie (LCX) durchgeführt und so ein ischämischer Myokardinfarkt mit anschließender Reperfusion und resultierender kardialer Dysfunktion induziert. Nach 2 Wochen wurden Infarktgröße und Herzfunktion mittels Kardio-Magnetresonanztomographie (MRT) evaluiert. Die Tiere wurden in die Therapiegruppe (AAV5-hS100A1, 5 Tiere) oder Kontrollgruppe (AAV5-hRluc, 3 Tiere) aufgeteilt. Der Gentransfer (1x1013 virale Genomkopien (vgc)/Tier)) erfolgte per retrograder koronarvenöser Infusion. 12 Wochen nach Gentransfer wurde eine erneute Kardio-MRT Untersuchung durchgeführt. Zur Überprüfung der pharmakologischen Sicherheit wurden während des Versuchs serielle Blut und Elektrokardiogramm (EKG) Untersuchungen durchgeführt. Am Versuchsende wurden die Tiere schmerzfrei getötet und ihre Organe für weitere molekularbiologische Untersuchungen entnommen. Zur Untersuchung der Verteilung und Transkriptionseffizienz der vgc wurde aus den Gewebeproben DNA und RNA isoliert und anschließend eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine Next-Generation Sequenzierung der myokardialen RNA, die mit einer gewichteten Gen Co-Expressionsanalyse (WGCNA) und anschließender Anreicherungsanalyse untersucht wurde. Zur Reduktion der Tierzahl wurde die Studie Endpunkt orientiert durchgeführt: sobald die beiden Gruppen signifikant unterschiedliche Ergebnisse in den Endpunkten (EF und Infarktausweitung) erzielten, wurde die Studie beendet. Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigen eine niedrige anti-AAV5-Seroprävalenz in der Hausschweinpopulation. Die AAV5-hS100A1-Gentherapie führte nach 12 Wochen zu einer signifikanten Verringerung der Infarktausweitung und zu einer signifikant höheren EF im Vergleich zur Kontrollgruppe (ungepaarter zweiseitiger Student t-Test, p < 0,05). Die EKG- und Blutuntersuchungen ergaben keine Hinweise auf Toxizität. Die Transkriptomanalyse der Myokardproben lieferte mit der EF und Infarktausweitung signifikant und stark negativ korrelierende pathophysiologisch relevante Signalwege. Dabei scheint u.a. eine antiinflammatorische Wirkung von AAV5-hS100A1 von großer Bedeutung zu sein. Erstmals konnte auch eine Interaktion zwischen S100A1 und der kardioprotektiven Retinsäure gezeigt werden. In einer aufgrund der hohen Mortalität während der MI-Induktion eingeschobene Versuchsreihe mit 72 Tieren konnte durch den Wechsel des Narkosegases von Isofluran auf Sevofluran die Mortalität signifikant gesenkt werden (einseitiger Fisher’s exact test, p < 0,05). Schlussfolgerungen: Das Schwein stellt ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte Versuchsvorhaben dar. Das zu testende Konstrukt AAV5-hS100A1 mit CMVenh/0,26 kb-MLC Promotor zeigte bei einer hohen pharmakologischen Sicherheit eine robuste und weitestgehend kardiospezifische Expression des Transgens 12 Wochen nach Gentransfer. Es verfügt somit über ein großes therapeutisches Potenzial. Die Studie konnte dazu beigetragen, neue Signalwege zu identifizieren, die für den Wirkmechanismus von S100A1 relevant sein könnten. Durch die Änderung des Narkosegases konnte die Mortalität bei der MI-Induktion gesenkt werden. In zukünftigen MI-Studien sollte daher die Aufrechterhaltung der Inhalationsanästhesie bevorzugt mittels Sevofluran erfolgen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung / Introduction: Cardiovascular diseases are the prevailing cause of death worldwide. To date, there is no causal therapy for heart failure, which represents the common endpoint of a large number of different cardiac diseases. Even the promising gene therapy approach has not yet been able to achieve relevant progress in this field. Identified as a central regulator of cardiac activity and calcium signaling in cardiomyocytes, the calcium-sensor protein S100A1 represents a highly suitable candidate for cardiac gene therapy. Objective: The overall goal of this translational study is to advance the field of gene therapy for cardiac dysfunction. On the one hand, the on adeno-associated viruses (AAVs) based vector (rAAV) of serotype 5 was tested in combination with a cardiac-specific promotor (cmvenh/0,26 kb-mlc) for its applicability and safety for cardiac gene therapy. Beforehand, extensive testing for preexisting neutralizing serum factors (nsf) was performed to decipher whether the pig is a suitable model for AAV5-based preclinical studies. On the other hand, the effect of the hS100A1 gene therapy after myocardial infarction (MI) was further characterized in a clinically relevant large animal model with an endpoint-based study design. Animals, materials and methods: A total of 83 juvenile farm pigs were used. Before starting the experiment, we analyzed serum from 40 animals for preexisting nsf against AAV5 using a flow cytometry-based cell reporter assay. For the main study, we used 8 animals in which we induced an ischemic myocardial infarction with subsequent reperfusion by occluding percutaneously the ramus circumflexus of the left coronary artery (LCX) for 2 hours to generate cardiac dysfunction. After 2 weeks, we evaluated infarct size and cardiac function with cardiac magnetic resonance imaging (MRI). Animals were divided into the treatment group (AAV5-hS100A1, 5 animals) and the control group (AAV5-hRluc, 3 animals). We applied gene transfer (1x1013 viral genome copies (vgc)/animal) using retrograde coronary venous infusion. We repeated the cardiac MRI 12 weeks after gene transfer. Serial blood and electrocardiogram (ECG) tests were performed during the experiment to verify pharmacological safety. At the end of the study, the animals were euthanized and their organs were collected for further molecular analyses. To investigate the distribution and transcriptional efficiency of the vectors, we isolated DNA and RNA from the tissue samples and performed real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In addition, a next-generation sequencing of myocardial RNA was conducted and analyzed with weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) and subsequent enrichment analysis. To reduce the number of animals, the study was end point oriented: When reaching significant differences in the primary end points (ejection fraction (EF) and infarct extension), the study was terminated. Results: The results demonstrate a low anti-AAV5 seroprevalence in the farm pig population. After 12 weeks, the AAV5-hS100A1 gene therapy resulted in a significant reduction of infarct extension and a significantly higher EF compared to the control group (unpaired two-sided Student t-Test, p < 0.05). ECG and blood tests did not show any indications of toxicity. The transcriptome analysis of the myocardial samples provided a significant negative correlation between relevant pathological signaling pathways and EF/infarct extension, thus giving clues to underlying mechanisms. Among these, an anti-inflammatory effect of AAV5-hS100A1 appears to be of major importance. For the first time, we could also demonstrate an interaction between S100A1 and the cardioprotective retinoic acid. Due to the high mortality during MI-induction, we incorporated a test series with 72 animals. By changing the anesthetic gas from isoflurane to sevoflurane, we could significantly reduce the mortality (one-sided Fisher's exact test, p < 0.05). Conclusions: The pig represents a suitable model for AAV5-based studies. 12 weeks after gene transfer, the construct AAV5-hS100A1 with cmvenh/0.26 kb-mlc promoter showed a robust and mostly cardiospecific expression of the transgene accompanied by high pharmacological safety. Thus, it provides great therapeutical potential. The study contributed to identify novel signaling pathways that may be relevant for S100A1’s therapeutic actions. By changing the anesthetic gas, we could reduce the mortality during infarct induction. Therefore, in future MI studies, sevoflurane should be used preferably to maintain inhalation anesthesia.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung

High transduction rates of viral vectors in gene therapies (GT) and experimental hematopoiesis ensure a high frequency of gene delivery, although multiple integration events can occur in the same cell. Therefore, tracing of integration sites (IS) leads to mis-quantification of the true clonal spectrum and limits safety considerations in GT. Hence, we use correlations between repeated measurements of IS abundances to estimate their mutual similarity and identify clusters of co-occurring IS, for which we assume a clonal origin. We evaluate the performance, robustness and specificity of our methodology using clonal simulations. The reconstruction methods, implemented and provided as an R-package, are further applied to experimental clonal mixes and preclinical models of hematopoietic GT. Our results demonstrate that clonal reconstruction from IS data allows to overcome systematic biases in the clonal quantification as an essential prerequisite for the assessment of safety and long-term efficacy of GT involving integrative vectors.

Als häufige genetisch bedingte neurodegenerative Erkrankung ist die Huntington-Krankheit eine Modellerkrankung – auch für die Gentherapie. Unter den unterschiedlichen Möglichkeiten ist die Entwicklung von Antisense-Oligonukleotiden am weitesten fortgeschritten. Als weitere Optionen auf Ebene der RNA stehen Mikro-RNAs und Modulatoren der RNA-Prozessierung (Spleißen) zur Verfügung, auf DNA-Ebene Zink-Finger-Proteine. Mehrere Produkte befinden sich in der klinischen Prüfung. Diese unterscheiden sich in Applikationsform und systemischer Verfügbarkeit, aber auch in der genauen Wirkung. Ein wichtiger Unterschied könnte darin liegen, ob alle Formen des Huntingtin-Proteins gleichermaßen von der Therapie angesprochen werden, oder ob sich die Therapie präferentiell gegen besonders toxische Formen wie das Exon1-Protein richtet. Die Ergebnisse der kürzlich abgebrochenen GENERATION HD1 Studie waren etwas ernüchternd, am ehesten aufgrund der nebenwirkungsbedingten Liquorzirkulationsstörung. Sie sind daher nur ein Schritt in der Entwicklung zu einer wirksamen Gentherapie gegen die Huntington-Krankheit. / Being one of the most common genetic neurodegenerative disease, Huntington’s disease has been a model disease – also for gene therapy. Among the various options, the development of antisense oligonucleotides is the most advanced. Further options at the RNA level include micro-RNAs and modulators of RNA processing (splicing), at the DNA level zinc finger proteins. Several products are in clinical trials. These differ in their mode of application and in the extent of systemic availability. Another important difference between therapeutic strategies could be whether all forms of the huntingtin protein are targeted in the same extent, or whether a therapy preferentially targets particular toxic forms such as the exon1 protein. The results of the recently terminated GENERATION HD1 trial were somewhat sobering, most likely due to the side effect-related hydrocephalus. Therefore they represent just one step towards the development of an effective gene therapy against Huntington’s disease.

T-Zellrezeptor (TZR)-Gentherapie zeigte erste Erfolge in klinischen Studien, jedoch wurden gleichzeitig Risikofaktoren deutlich. Ein Risikofaktor ist das falsche Paaren der transferierten TZR-Ketten mit den endogenen, was zu TZR-Molekülen von unbekannter Spezifität führt und die Oberflächenexpression und somit auch die Funktionalität des transgenen TZR reduziert. Dieser Aspekt wurde in generierten T-Zellklonen mit einer konstitutiven/endogenen TZR-Expression sowie einer zweiten induzierbaren/transgenen TZR-Expression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass nach Induktion der transgenen TZR-Expression der endogene TZR seine Funktionalität verlor, obwohl er noch auf der Oberfläche detektierbar war. Als Ursachen wurden neben einer reduzierten Oberflächenexpression des endogenen TZR auch falsch gepaarte TZR-Moleküle, die mit Hilfe der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Methode detektiert wurden, gefunden. Die Modifikation des TZR durch den Einbau einer zweiten Cystein-Brücke, was das Paaren der korrespondierenden TZR-Ketten stabilisieren soll, führte in den T-Zellklonen zu keiner Reduktion der falsch-paarenden TZR-Moleküle. In primären Wildtyp-T-Zellen verbesserte sich das richtige Paaren des transgenen TZR leicht und konnte durch Codon-Optimierung der TZR-Gene weiter verbessert werden. Der zweite untersuchte Risikofaktor ist die Insertionsmutagenese durch den retroviralen Vektor. Die sichere Verwendbarkeit von differenzierten T-Zellen für die TZR-Gentherapie wurde in einem Tiermodel mit wiederholter T-Zellstimulierung, um weitere Mutationen während der Zellteilung zu provozieren, analysiert. Im Laufe der Zeit reicherten sich die transferierten T-Zellen in den Tieren dramatisch an, aber entwickelten sich nicht zu T-Zelllymphomen. Die Proliferationskapazität und die Funktionalität der transferierten T-Zellen wurden bestätigt. Die Polyklonalität der TZR-gen-modifizierten T-Zellen wurde mit Hilfe der linear-amplifizierten Polymerasekettenreaktion nachgewiesen. / T cell receptor (TCR) gene therapy is a new therapy for cancer which showed first clinical success but at the same time risk factors evolved. One risk factor is the mispairing of the TCR chains with the endogenous TCR chains which leads to TCRs with unknown specificities and to a reduced expression and functionality of the transferred TCR. This aspect was analyzed in dual TCR T cell clones which had one constitutive/endogenous TCR expression as well as a second inducible/transgenic TCR expression. It could be shown that the endogenous TCR lost its functionality after induction of the transgenic TCR expression although it was still detectable on the cell surface. The reason was found in the lower surface expression level of the endogenous TCR as well as in mispaired TCR dimers detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique. Modification of the TCR by insertion of a second cysteine bridge which should stabilize the pairing of the corresponding TCR chains did not reduce the TCR mispairing in the T cell clones. In primary wild-type cells, the pairing of the transgenic TCR improved slightly and could be further improved by codon-optimization of the TCR genes. The second analyzed possible side effect of TCR gene therapy is the insertional mutagenesis by the retroviral vector. The safety of differentiated T cells for TCR gene therapy was analyzed in an animal model with a repetitive T cell stimulation to provide the opportunity for mutations to occur during cell division. Over time, transferred T cells increased dramatically in the recipient mice, but did not lead to T cell lymphomas. The proliferative capacity and the functionality of transferred T cells were confirmed. The polyclonality of the TCR gene-modified T cells could be confirmed by linear amplification-mediated polymerase-chain reaction.

Das Induzieren und Aufrechterhalten einer tumor-protektiven Immunität sind wesentliche Ziele in der Immuntherapie des Neuroblastoms. Eine Erhöhung der Anzahl von tumor-infiltrierenden Leukozyten könnte ein Weg sein, um dieses Ziel zu erreichen. Fractalkine ist ein besonderes TH1 CX3C Chemokin, welches sowohl Adhäsion und Migration von Leukozyten vermittelt. Gerichtetes IL-2 (ch14.18-IL-2) wurde durch eine genetische Fusion von anti-GD2 Antikörper mit IL-2 hergestellt, damit IL-2 spezifisch in das Mikromilieu von Neuroblastomen gebracht werden kann. In dieser Arbeit habe ich die Hypothese getestet, dass Gentherapie mit dem Chemokin Fractalkine (FKN) eine wirksame Antineuroblastom-Immunantwort induziert, welche durch gerichtetes IL-2 amplifiziert wird. Zu diesem Zweck wurden NXS2-Zellen genetisch verändert, damit sie murines FKN produzieren (NXS2-FKN). Transkription und Expression des mFKN Gens konnte in NXS2-FKN Zellen und Tumorgewebe gezeigt werden. Die chemotaktische Eigenschaft von FKN wurde sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt. FKN zeigte eine Reduktion des Primärtumorwachstums, welches durch gerichtetes IL-2 mit nicht-kurativen Dosen von ch14.18-IL-2 deutlich verbessert wurde. Ferner wurden experimentelle Lebermetastasen nur in den Mäusen komplett eradiziert, welche die Kombinationstherapie erhalten haben. Die Mechanismen, welche an dieser Antitumorantwort beteiligt sind, schließen eine wirksame T-Zell-Aktivierung (Hochregulation von CD69, CD25, und von TNF-alpha und INF-gamma), sowie eine Erhöhung der tumorspezifischen CTL-Aktivität mitein. Die Depletion von CD4+ und CD8+ T-Zellen in vivo hat diesen therapeutischen Effekt aufgehoben, was die essentielle Rolle von T-Zellen in diesem immuntherapeutischen Ansatz unterstreicht. Zusammenfassend konnte ich zum ersten Mal zeigen, dass Chemokin-Gentherapie mit FKN durch gerichtetes IL-2 amplifiziert wird, was eine Kombination dieser beiden Strategien zur adjuvanten Therapie beim Neuroblastom nahe legt. / Induction and maintenance of tumor-protective immunity are the major goals of neuroblastoma immunotherapy. Enhancing the amount of tumor infiltrating leukocytes might be a way to achieve these goals since they may be associated with residual evidence of the ineffective immune response. Fractalkine is a unique TH1 CX3C chemokine known to induce both adhesion and migration of leukocytes mediated by a membrane-bound and a soluble form, respectively. Targeted IL-2 (ch14.18-IL-2) was constructed by anti-GD2 antibody fused with IL-2 so that IL-2 can be directed into the microenvironment of neuroblastoma tumor. Here, I tested the hypothesis that chemokine gene therapy with fractalkine (FKN) induces an effective anti-neuroblastoma immune response amplified by targeted IL-2. NXS2 cells were engineered to stably produce murine FKN (NXS2-FKN). Transcrip- tion and expression of the mFKN gene in NXS2-FKN cells and tumor tissue were demonstrated. The chemotactic activity of FKN expressed by NXS2 cells was determined both in vitro and in vivo. Importantly, NXS2-FKN exhibited a reduction in primary tumor growth, which was boosted by targeted IL-2 using non-curative doses of ch14.18-IL-2. Furthermore, experimental liver metastases were completely eradicated in mice receiving the combination therapy, demonstrating the induction of a long-lived tumor protective response. The mechanisms involved in antitumor response included effective T cell activation as indicated by the up-regulation of T-cell activation markers (CD69, CD25) and proinflammatory cytokines (TNF-alpha, INF-gamma) as well as the enhancement of tumor specific CTL activity. The depletion of CD4+ and CD8+ T cells in vivo abrogated the therapeutic effect supporting the crucial role of T cells in this immunotherapeutic approach. In summary, I demonstrated for the first time that chemokine gene therapy with FKN is amplified by targeted IL-2 suggesting a combination of both strategies as an adjuvant therapy for neuroblastoma.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem neuartigen proteinbasierten, suizidgentherapeutischen Ansatz zur sicheren und effektiven Behandlung von soliden Tumoren. Verwendet wurden zellpermeable Fusionsproteine auf der Grundlage des bakteriellen Enzyms Cytosin Desaminase, welches spezifisch die Umsetzung der inaktive, nichttoxische Substanz (Prodroge) 5-Fluorcytosin in den hochwirksamen, stark toxischen Wirkstoff 5-Fluoruracil katalysiert. Dieser bewirkt die selektive Zerstörung von Tumorzellen. Durch die Fusion der bakteriellen Cytosin Desaminase (bCD) mit der Sequenz des Zellpermeabilität vermittelnden Peptides HBV-Translokationsmotiv (TLM) des Hepatits B-Virus (HBV) wurden zunächst zellpermeable E.coli Cytosin Desaminase Suizidfusionskonstrukte generiert. Für die bakteriell synthetisierten HBV-TLM-Fusionsproteine konnten eine Hexamerisierung sowie eine spezifische enzymatische Aktivität bei der Umsetzung von Cytosin zu Uracil als strukturelle und funktionelle Voraussetzungen für einen Einsatz in der Suizidgentherapie nachgewiesen werden, die vergleichbar mit dem wt-Protein waren. Bei Versuchen zur Internalisierung der zellpermeablen Fusionsproteine wurde für die Fusionsproteine mit C-terminal fusioniertem HBV-TLM (bCD-HBV-TLM) eine Aufnahme in das Zytoplasma von Hepatomzellen mittels konfokaler Laserscanmikroskopie und differentieller Zellfraktionierung nachgewiesen, nicht jedoch für Fusionsproteine mit N-terminalem HBV-TLM (HBV-TLM-bCD). Die gezeigte Internalisierung des Proteins HBV-TLM-bCD erfolgte effizient und schnell und war unabhängig vom endosomalen Aufnahmeweg. Bei der nachgewiesenen Translokalisation blieb die enzymatische, suizidgentherapeutische Aktivität des zellpermeablen Suizidproteins (HBV-TLM-bCD), d.h. die katalytische Wirkung bei der Umsetzung der Prodroge 5-Fluorcytosin vollständig erhalten, so dass sich dieses Fusionsprotein für einen therapeutischen Einsatz in der Suizidgentherapie eignet. Zusätzlich zur antitumoralen Wirkung können durch einen gezielten, lokal begrenzten therapeutischen Einsatz der vorgestellten zellpermeablen bCD-HBV-TLM-Fusionsproteine starke Nebenwirkungen, wie sie bei einer konventionellen Chemotherapie zu beobachten sind, weitgehend vermieden werden. / This work investigates the application of protein based therapeutic suicide enzyme/prodrug approaches providing novel means for both safe and effective local therapeutic regimes in solid tumors. The concept of the used suicide gene therapy system is based mainly on the transfer of the cell permeable bacterial suicide enzyme cytosine deaminase which specifically convert the inactive, non-toxic prodrug 5-fluorocytosine into the toxic metabolite 5-fluorouracil finally executing the efficient destruction of tumor cells. Employing a novel cell permeable peptide, known as the translocation motif (TLM) of hepatitis B virus (HBV), E.coli cytosine deaminase (bCD) suicide fusion proteins were generated. HBV-TLM fusion proteins formed hexamers (as do parental wt bCD) and retained the specific enzymatic activity of cytosine conversion to uracil also being comparable to parental wtbCD protein. However, only bCD-HBV-TLM fusion proteins, but not HBV-TLM-bCD fusion proteins were found to be taken up to the cytoplasm of target hepatoma cells as demonstrated both by confocal laser scanning microscopy and cell fractionation. Uptake of bCD-HBV-TLM worked both efficiently and rapidly and was found to be independent from the endosomal pathway. Since bCD-HBV-TLM fusion proteins completely retained their suicide enzymatic activity in the course of translocation across the plasma membrane their usage as profound inducers of chemo-sensitivity to 5-fluorocytosine strongly is suggested. Future therapeutic local application of cell permeable bCD-HBV-TLM fusion proteins together with a systemic 5-fluorocytosine prodrug application could result in profound antitumor activities without apparent side effects.

Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob der gezielte Einsatz gentherapeutischer Methoden zu einer Verhinderung der Abstoßung allogener Transplantate bzw. zu einer Verhinderung der Induktion des Ischämie-/Reperfusionsschadens in verschiedenen Transplantationsmodellen der Ratte beitragen kann. Dabei wurden zwei Schwerpunkte gesetzt: Zum einen wurde auf den ex-vivo Gentransfer von therapeutischen Molekülen direkt in das Transplantat mit Hilfe von rekombinanten Adenoviren fokussiert. Zum anderen wurde das Potenzial von retroviral modifizierten, allospezifischen T-Zellen als Träger therapeutischer Gene zur Verhinderung der Transplantatrejektion untersucht. Diese Habilitationsschrift umfasst dreizehn Originalartikel in internationalen Zeitschriften, sechs Übersichtsartikel (Reviews) und vier Manuskripte, die bereits zur Veröffentlichung eingereicht sind. / The aim of the research was to investigate, whether the specific use of gene therapeutic methods can play a role in the prevention of allogeneic graft rejection or in the prevention of the induction of ischemia/reperfusion damage in various rat transplantation models. Doing this there were to main focusses: First we concentrated on the ex-vivo gene transfer of therapeutic molecules directly into the graft, which was done using recombinant adenoviruses. Then we investigated the potential of retrovirally modified, allospecific T-cells as carriers for therapeutic genes for the prevention of graft rejection. This publication consists of thirteen original papers in international journals, six reviews and four manuscripts that have been submitted for publication.

Photoreceptors are of prime importance for humans, since vision is one of the most important senses for us. In our daily life, where nearly every action is dependent on visual input, an impairment or a loss of eyesight leads to severe disability. With a non-syndromic prevalence of 1:4000, retinitis pigmentosa, a collective term for a group of inherited retinal eye diseases, represents, together with age-related macula degeneration, one of the main causes for visual impairment and blindness in industrialized countries. The dominant reason for vision loss is, in both cases, the irreversible loss of photoreceptor cells located in the outer nuclear layer of the retina. To date, no effective treatment is available to preserve or regain visual function in affected patients. Recent promising strategies for new retinal therapeutical approaches focus on one hand on the development of gene therapies, where an introduced wild-type allele compensates a mutated gene, and on the other hand on cell therapies, where stem or photoreceptor precursor cells (PPCs) are transplanted to the sub-retinal space to replace degenerated host photoreceptors. The current study is subdivided into three parts, addressing the issue of non-reversible photoreceptor cell loss due to retinal degenerative diseases by investigating in the first two parts new qualitative as well as quantitative approaches in the field of retinal cell therapy, while in the third part an ocular gene therapeutical approach targeting prominin-1, a gene involved in retinal degenerative disorders, was investigated. Briefly, this study shows in the first part, a significant enhancement of the integration rate of PPCs in wild-type host retinas, achieved by pre-transplantational sorting, using the recently discovered PPC - specific cell surface marker CD73. This sets another step further towards retinal cell therapy by increasing the effectiveness of such treatment. Next to this quantitative approach, it is also shown that the quality of transplanted photoreceptor precursor cells is comparable to native photoreceptors by demonstrating, that an indispensable prerequisite of every photoreceptor cell, the outer segment, is developed by transplanted PPCs after proper integration. Importantly, transplanted PPCs develop native outer segments even when not integrated in the host tissue but located in the sub-retinal space, as it is predominantly observed after transplantation into severely degenerated retinas. These results substantiate the feasibility of cell therapeutical treatment of severely degenerated retinas. At the end of this part, it is demonstrated, that outer segments are not formed properly by PPCs transplanted to the vitreal side of the retina. This suggests an influence of signaling molecules, presumably secreted by retinal pigment epithelial cells into the sub-retinal space, on transplanted PPC final differentiation. Since intensive research is done to differentiate stem cells into PPCs for cell therapeutical transplantation, these results may contribute significantly to this research by demonstrating, that factors secreted by the retinal pigment epithelium might play a crucial role for successful stem cell to PPC differentiation. The last part of my work investigates a gene therapeutical approach to cure inherited retinal degenerative diseases. One gene, where reported mutations cause retinal degeneration in humans is prominin-1, a protein expressed at cell membrane evaginations in a variety of cell types. Interestingly, the prominin-1 knock-out mouse is characterized exclusively by disorganized photoreceptor outer segment formation and progressive retinal degeneration. Successful delivery of a wild-type form of mouse prominin-1 using adeno-associated viral vector transfer, into the photoreceptors of prominin-1 - deficient mice is demonstrated. The divergent results show on one hand a rescue of the thickness of the photoreceptor outer nuclear layer on a short time period (3 weeks post treatment), and on the other hand long-term data (8-10 weeks post treatment) suggests histologically as well as functionally a negative effect on treated photoreceptors. This might be due to effects caused by an over-expression of prominin-1 and will be investigated in future studies. In conclusion, distinct and important investigations were made which contribute significant puzzle pieces to new cell- as well as gene therapeutical approaches for the treatment of retinal degenerative disorders.