Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2010. / Title from PDF title page (viewed on June 25, 2010). Includes bibliographical references.

Malignant brain tumors are diseases with poor prognosis and/or severe long-term side effects of treatment. This thesis aimed to discover novel regulators in brain tumor development, based on studying neural stem cell and progenitor cell (NSPC) differentiation and using animal models to introduce new insights to mechanisms of human brain tumors. The enzyme heparanase (HPSE) that degrades heparan sulfate (HS) is active in cell signaling and ECM remodeling. In paper I, we found an enhanced differentiation to oligodendrocytes in ES cell-derived NSPCs overexpressing HPSE. Further analysis suggested that this enhanced formation of oligodendrocytes was associated with alterations in receptor tyrosine kinase signaling, and that HPSE might also exert anti-apoptotic functions. Subsequently, in paper II we studied the involvement of HPSE in glioma development. We observed that high HPSE levels associated with poor survival in glioma patients. In experimental models, we found that HPSE promoted glioma growth, and that an inhibitor of HPSE reduced glioma progression both in vitro and in vivo. We hypothesize that regulators in NSPC differentiation could have a potential role in brain tumor development. In paper III, we explored the function of NRBP2, a pseudokinase that is up-regulated during NSPC differentiation. We found low expression of NRBP2 in brain tumors, in comparison to normal brain. In medulloblastoma, in particular, low NRBP2 expression is linked to poor prognosis. Overexpression of NRBP2 in medulloblastoma cells led to impaired cell growth and migration, concomitant with an increased cell death. In paper IV, we searched for novel glioma susceptibility genes by sequencing dog breeds from the same ancestor but with different glioma incidence. In this way we identified three new glioma-associated genes. Two of these are significantly regulated in human glioma and one of those might have a role in glioblastoma stem cell differentiation.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439149-Texto+Completo-0.pdf: 1490829 bytes, checksum: bd616615ee5265db0a960d6f77c8581d (MD5) Previous issue date: 2012 / Glioblastoma multiforme (GMB) is the most malignant and common type of all astrocytic tumours. Current standard treatment for GBM patients involves maximum surgical resection of the tumour, followed by radiotherapy and chemotherapy, usually containing the alkylating agent Temozolomide (TMZ). Despite this aggressive combination therapy, the survival rate of GBM patients is still low. This work consisted in investigating the cytotoxic effects of Akt-inhibition by MK-2206 with irradiation (RT) and TMZ on in vitro human malignant glioma. Seven malignant glioma cell lines were cultured and tested for clonogenic survival, invasion inhibition, tumour spheroid growth and proliferation. The Akt-inhibitor MK-2206 and TMZ were added at different time treatments and in varying doses. Cultures were irradiated with single dose and with fractionated γ-irradiation. Cellular modulation of Akt and p-Akt were assessed by Western blot analysis. MK-2206 reduced the levels of phospho- Akt key protein in the PI3Kinase-Akt pathway, decreased cell survival, and inhibited invasion, proliferation and cell growth. The combination of MK-2206 and RT lead to enhanced inhibition of cell proliferation and invasion, which is not observed with RT alone. The radioenhancing effect of MK-2206 was most striking in inhibition of spheroid volume growth by fractionated RT; the radiosensitizing effect of MK-2206 was stronger than that of TMZ. MK-2206 enhanced the in vitro effects of RT and TMZ in terms of decreased cell survival, invasion, proliferation and growth in malignant glioma. Effects could be ascribed to inhibition of PI3K-Akt pathway. / O Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais maligno e mais comum de todos tumores astrocíticos. O tratamento atual para pacientes de GBM envolve máxima remoção cirúrgica, seguida de radio e quimioterapia, normalmente com o agente alquilante Temozolamida (TMZ). Apesar da agressividade da terapia combinada, o tempo de sobrevivência dos pacientes ainda é baixo. Este trabalho procurou investigar os efeitos citotóxicos do inibidor de Akt MK-2206 em combinação com irradiação (RT) e TMZ em um painel de células de gliomas humanos. Sete linhagens de glioma foram cultivadas e testadas em ensaio de sobrevivência clonogênica, inibição de invasão, e modelos de proliferação e crescimento de volume em esferóides. O inibidor MK-2206 e TMZ foram adicionados em diferentes tempos de tratamento e diferentes doses. As culturas foram irradiadas com doses únicas ou em terapias fracionadas com irradiação γ. A modulação celular de Akt e fosfo-Akt foi checada via Western Blot. O composto MK-2206 reduziu a fosforilação da proteína chave Akt na via PI3K, diminuindo a sobrevivência celular e inibindo invasão, proliferação e crescimento celular. A combinação de MK-2206 com RT levou a uma maior inibição de invasão e proliferação, o que não é observado somente com a RT. O efeito radiosensível de MK-2206 foi ainda maior na inibição do volume dos esferóides em terapia combinada com RT fracionada, sendo ainda maior do que o efeito combinado com TMZ. MK-2206 aumentou os efeitos in vitro de RT e TMZ em termos de redução de sobrevivência celular, invasão, proliferação e crescimento celular em gliomas malignos. Os efeitos podem ser atribuídos a inibição da via PI3KAkt.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000436876-Texto+Completo-0.pdf: 1707187 bytes, checksum: a5856afc9a54d87e34f88e782140d450 (MD5) Previous issue date: 2011 / Gliomas are the most common and devastating tumors of the central nervous system (CNS). Among the gliomas group, the GBM is the most prevalent, aggressive and deadly malignant. Many pieces of evidence point out the relevance of natural compounds for cancer therapy and prevention, including chalcones. Chalcones are group of natural precursors of flavonoid and display a wide variety of biological and pharmacological proprieties that include anti-proliferative and anti-cancer activities. This study aimed at evaluating the in vitro anti-proliferative activity and cell viability inhibition of nine quinoxaline derived chalcones, structurally based on the selective PI3Ky inhibitor AS605240. These synthetic compounds were tested at different time-periods of incubation (24, 48 e 72 h) and concentrations (0,1; 0,1; 1; 5 e 10 μg/mL) in glioma cell lines from human and rat origin (U-138 MG and C6, respectively).The results showed by MTT assay and cell couting revealed that four chalcones (compounds N2, N9, N10 and N12), displayed higher efficacies and potencies, being able to inhibit either cell proliferation or viability, in a time- and concentration dependent manner. These four compounds which present methoxy groups at A-ring and their efficacy was greater than that seen for the positive control compound AS605240. Flow cytometry analysis demonstrated that incubation of C6 cells with chalcone N9 led to G1 phase arrest, likely indicating an interference with apoptosis. Furthermore, chalcone N9 was able to visibly inhibit AKT activation, allied to the stimulation of ERK 1/2 MAP-kinase. The chalcones tested herein, especially those displaying a methoxy substituent at A-ring, might well represent promising molecules for the treatment of gliomas. / Os gliomas são os tumores do SNC mais comuns e devastadores. Dentre os gliomas, o GBM é o mais prevalente, agressivo, maligno e apresenta um mau prognóstico. A relevância dos compostos naturais, incluindo as chalconas, no tratamento e na prevenção do câncer está sendo muito evidenciada. As chalconas formam um grupo de compostos naturais derivados dos flavonóides que apresentam diferentes propriedades biológicas e farmacológicas, incluindo as atividades anti-proliferativas e anti-tumorais. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação anti-proliferativa e a capacidade de inibição da viabilidade celular in vitro de nove chalconas derivadas da quinoxalina, baseadas estruturalmente no inibidor seletivo de PI3Ky, o AS605240. Estes compostos sintéticos foram testados em diferentes tempos de incubação (24, 48 e 72 h) e concentrações (0,1; 0,1; 1; 5 e 10 μg/mL) em linhagens de glioma humano e de rato (U-138 MG e C6, respectivamente). Os resultados observados nos experimentos de MTT e na contagem celular revelaram que quatros chalconas (compostos N2, N9, N10 e N12), apresentaram grande eficácia e potência, sendo capazes de inibir a proliferação e a viabilidade celular, de maneira tempo e concentração dependente. Estes quatro compostos que possuem radicais metóxi no anel A de sua estrutura demonstraram uma eficácia superior àquela do composto AS605240, usado como controle positivo. Os resultados da citometria de fluxo demonstraram que a incubação das células C6 com a chalcona N9 levaram a um bloqueio celular na fase G1, possivelmente indicando interferência com a apoptose. Além disto, a chalcona N9 foi capaz de inibir visivelmente a ativação da AKT, aliada à estimulação de ERK 1/2 MAP-quinase. As chalconas estudadas neste projeto, especialmente as que apresentam o radical metoxi no anel A, representam promissoras moléculas para o tratamento dos gliomas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438124-Texto+Completo-0.pdf: 1241897 bytes, checksum: 68c450ddba15c588f04067f7bd75dae9 (MD5) Previous issue date: 2012 / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive tumor of the CNS and most deadly primary tumors. Despite the malignant gliomas are generally treated with radiotherapy, often they exhibit a significant radioresistance that limits the treatment success. It can be postulated that molecular changes commonly observed in these tumors contribute to this resistance. The nucleotide ATP is an important signaling molecule in CNS and it is a selective P2X7 purinergic receptor (P2X7R) ligand at high concentrations. Some studies have reported that P2X7R is responsible for ATP-induced cell death in various cell types, but some human glioma cells were resistant to death induced by ATP. In addition to ATP resistance, patients with GBM develop spontaneous antitumor immune responses. These studies show the requirement for an exogenous induction of the immune system to generate an antitumor response. IL-17 is a pro-inflammatory cytokine and its role in cancer is already unknown. Herein, we first aimed to characterize a radiosensitive human glioma cell line for sensitivity to ATP and to investigate whether activation of the P2X7R could be involved in the death of this cell line. Furthermore, aimed to elucidate the IL-17 receptor susceptibility to irradiation, as well as, elucidate the effect of IL-17 and a possible interaction between this cytokine and P2X7R in human glioma cells. The human glioma cell lines U-138 MG and U-251 MG were resistant to death when treated with either ATP (5 mM) or BzATP (100 μM), a selective P2X7R agonist, whereas in the radiosensitive M059J glioma cell line, the high ATP (5 mM) or BzATP (100 μM), significantly diminished the cell viability (32. 4% ± 4. 1 and 24. 6% ± 4. 0, respectively).The M059J lineage expresses significantly higher P2X7R levels when compared to the U-138 MG and U-251 cell lines (0. 40 ± 0. 00; 0. 28 ± 0. 01 and 0. 31 ± 0. 01, respectively) and irradiation upregulated P2X7R expression in all lineages. Additionally, the selective P2X7R antagonist A740003 (10 µM) significantly decreased the cell death caused by irradiation. We provided novel evidence indicating that M059J human glioma cell line is ATP-P2X7R sensitive, pointing out the relevance of the purinergic P2X7R in glioma radiosensitivity. The IL-17 receptor was significantly more expressed after irradiation (2 Gy), showing a possible participation of the IL-17/R on the irradiation susceptibility. The treatment with IL-17 (10 ng/ml) diminished approximately 62% the human glioma cell lines viability. Other preliminary result showed that the P2X7R antagonist was able to partially reverse the toxicity caused by IL-17 in these cell lines. Our data show an antitumor role of this cytokine and corroborate to the idea of a possible interaction between IL-17/P2X7R. This work prospects for studies to be conducted to better understanding the action of IL-17 in gliomas and interaction IL-17/P2X7R. / O glioblastoma multiforma (GBM) é considerado o mais agressivo tumor do sistema nervoso central (SNC), e o mais letal entre os tumores primários. Apesar dos gliomas malignos serem geralmente tratados com radioterapia, muitas vezes estes exibem uma significativa radioresistência que limita o sucesso do tratamento. Pode-se postular que mudanças moleculares comuns observadas nestes tumores contribuem para essa resistência. O nucleotídeo ATP é uma importante molécula de sinalização no SNC e um ligante seletivo do receptor purinérgico P2X7 (P2X7R) em altas concentrações. Estudos mostram que o P2X7R é responsável pela morte induzida pelo ATP em vários tipos de células, porém, algumas células de glioma humano mostram-se resistentes à morte induzida pelo ATP. Além da resistência ao ATP, pacientes com GBM espontaneamente desenvolvem resistência a respostas imunes antitumorais. Estudos levantam a necessidade de uma indução exógena do sistema imunológico a fim de gerar uma resposta antitumoral. A IL-17 é um citocina pró-inflamatória e seu papel no câncer ainda é desconhecido. O presente trabalho primeiramente objetivou caracterizar uma linhagem de glioma humano radiossensível quanto à sensibilidade ao ATP e investigar se a ativação do P2X7R poderia estar envolvida na morte destas células. Além disso, visou elucidar a susceptibilidade do receptor da IL-17 à radioterapia, bem como, o efeito da IL-17 e uma possível interação entre esta citocina e o P2X7R em células de glioma humano. As linhagens celulares de glioma humano U-138 MG e U-251 MG mostraram-se resistentes à morte, quando tratadas com ATP (5 mM) ou BzATP (100 µM), agonista seletivo do P2X7R. Na linhagem de glioma radiossensível M059J, o tratamento com alta concentração de ATP (5 mM) ou com BzATP (100 µM), diminuiram significativamente a viabilidade celular (32,4% ± 4,1 e 24,6 ± 4,0%, respectivamente).A linhagem M059J expressou níveis significativamente maiores do P2X7R quando comparada com as linhagens celulares U-138 MG e U-251 MG (0. 40 ± 0. 00; 0. 28 ± 0. 01 e 0. 31 ± 0. 01, respectivamente) e a irradiação aumentou a expressão do P2X7R em todas linhagens. Além disso, o antagonista seletivo do P2X7R, A740003 (10 μM), diminuiu significativamente a morte celular causada pela irradiação. Nesta primeira parte do trabalho, fornecemos novas evidências indicando que a linhagem de glioma humano M059J é sensível ao ATP-P2X7R, apontando a relevância do P2X7R na radiossensibilidade do glioma. Na segunda parte deste trabalho, observou-se que o receptor da IL-17 foi significativamente mais expresso após a irradiação (2 Gy) mostrando uma possível participação da via IL-17/R na susceptibilidade à irradiação. O tratamento com a IL-17 (10 ng/ml) diminuiu em aproximadamente 62% a viablidade de linhagens celulares U-138 MG e M059J de glioma humano. Outros resultados preliminares mostraram que o antagonista do P2X7R foi capaz de reverter parcialmente a toxicidade causada pela IL-17 nestas linhagens. Nossos dados demonstram um papel antitumoral desta citocina e corroboram com a idéia de uma possível interação entre a IL-17/P2X7R. Este trabalho deixa perspectivas de estudos a serem realizados para melhor compreender a ação da IL-17 nos gliomas e a interação IL-17/P2X7R.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivo: O diagnóstico de glioma de baixo grau não pode ser baseado exclusivamente em imagens convencionais de RM e, particularmente nos tumores localizados em áreas eloqüentes, a adequada seleção de alvos para biópsias estereotáxicas é crucial, devido ao alto risco de erros de amostragem. Nosso objetivo é utilizar as seqüências de perfusão por RM, com a finalidade de avaliar a microcirculação dos tumores supratentoriais que não apresentam impregnação pelo agente paramagnético no exame de RM convencional. Método: Entre fevereiro de 2001 e fevereiro de 2004 foram incluídos em nosso estudo todos os pacientes adultos com lesão expansiva supratentorial sugestiva de glioma de baixo grau, sem impregnação pelo gadolínio na RM convencional, avaliados no setor de neurooncologia da Disciplina de Neurologia da UNIFESP. Foram realizados estudos pré- operatórios de perfusão por RM da primeira passagem do gadolínio pela rede capilar cerebral utilizando seqüência spin-eco eco-planar. O volume sangüíneo cerebral relativo (rCBV) das lesões foi expresso em relação à substância branca contralateral de aparência normal. Nos pacientes que apresentavam lesões com mapas de perfusão heterogêneos foram realizadas biópsias estereotáxicas dos focos de maior rCBV antes da ressecção cirúrgica da lesão. Resultados: Dos 21 pacientes incluídos (16 homens, média etária de 36 anos; variação de 23 a 60 anos) 10 apresentaram diagnóstico de astrocitoma difuso (grau II da OMS) e 11 foram agrupados como outros gliomas de baixo grau (oligoastrocitomas e oligodendrogliomas) ou gliomas anaplásicos. Nos pacientes com mapas de rCBV heterogêneos os focos de alta perfusão corresponderam a áreas de oligodendroglioma ou astrocitoma anaplásico na biópsia estereotáxica, enquanto a histologia predominante do restante do tumor era de astrocitoma de baixo grau. Os valores de rCBV dos astrocitomas difusos foram significativamente menores do que aqueles observados nos demais grupos (p <0,01). O valor de corte de rCBV que permitiu melhor discriminação entre os astrocitomas difusos e os demais foi de 1,2 (80% sensibilidade e 100% especificidade). Conclusão: A seqüência de perfusão por RM é um método útil, que pode contribuir para minimizar os erros de amostragem nos procedimentos de biópsia estereotáxica em gliomas que não apresentam impregnação pelo gadolínio e pode ser utilizada como critério adicional aos critérios morfológicos anteriormente descritos para a graduação pré-operatória dos tumores gliais. / Object: The diagnosis of low-grade glioma (LGG) cannot be based exclusively on conventional MRI and the target selection for stereotactic biopsy is a crucial issue due to the high risk of sampling errors. We hypothesized that perfusion weighted imaging (PWI) could provide information concerning the microcirculation in presumed supratentorial LGG. Method: From February 2001 to February 2004 all adult patients with supratentorial suspected (nonenhancing) LGG on conventional MRI were included. Preoperative MRI used a dynamic first-pass gadopentate dimeglumine-enhanced spin-echo echoplanar perfusion sequence and the tumors’ relative cerebral blood volume (rCBV) measurements were expressed in relation to the values observed in the contralateral white matter. In heterogeneous tumors we performed a stereotactic biopsy in the higher perfusion areas before surgical resection. Results: Among 21 patients included (16 men, mean age 36 years; range 23 to 60) 10 had diffuse astrocytomas (grade II WHO) and 11 had different diagnosis and were grouped as other LGG and anaplastic gliomas. In patients with heterogeneous tumors on PWI, the higher rCBV focus showed areas of oligodendroglioma or anaplastic astrocytoma on stereotactic biopsy whereas the surgical specimens were astrocytomas. Diffuse astrocytomas presented mean rCBV values significantly lower when compared to the other two groups (p <0.01). The rCBV ratio cutoff value that permitted the better discrimination between diffuse astrocytomas and the other groups was 1.2 (80% sensitivity and 100% specificity). Conclusions: PWI is a feasible method that can potentially reduce the sampling error of histopathologic diagnosis in presumed LGG, particularly improving the selection of targets for stereotactic biopsy. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Glioblastomas são a forma mais comum de tumores cerebrais primários e, apesar do tratamento, os pacientes com estes tumores têm um prognóstico muito ruim. Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e também a adenosina possuem muitas funções importantes em condições fisiológicas e patológicas em vários organismos. O ATP é uma importante molécula sinalizadora no SNC, e os nucleotídeos e nucleosídeos podem induzir a proliferação de linhagens celulares de gliomas. Na invasão dos gliomas dois mecanismos podem liberar ATP: a morte excitotóxica do tecido adjacente e a lesão causada pela ressecção do tumor, que é o tratamento de primeira linha nestes casos. Neste estudo foram observados os efeitos do ATP extracelular na citotoxicidade em linhagens celulares de glioma humano U138 e na linhagem C6 de ratos, comparado com culturas organotícias de hipocampo. A citotoxicidade do ATP (0.1mM, 0.5mM, 5mM) foi medida usando os ensaios de incorporação de iodeto de propídeo e ensaio da lactato desidrogenase. O ensaio de caspases foi realizado para identificar à morte apoptótica. Os resultados mostraram que as células de gliomas apresentam resistência a morte induzida pelo ATP quando comparados com o tecido normal. Altas concentrações de ATP (5mM) induziram à morte celular após 24 h de tratamento em culturas organotípicas, mas não nas linhagens de gliomas estudados. Os nucleotídeos são hidrolisados muito lentamente pelas linhagens de gliomas, o que foi confirmado pela baixa expressão das enzimas NTPDases quando comparado com astrócitos. Portanto, para testar o papel do ATP extracelular no mecanismo de implante e crescimento dos gliomas, um milhão destas células de gliomas foram injetadas em 3µl de DMEM no estriado direito de ratos Wistar, e foi testada a co-injeção da enzima apirase no tratamento dos gliomas implantados. Após 20 dias, os ratos foram mortos e o cérebro foi seccionado e corado com hematoxilina e eosina. Nossos resultados mostraram que os ratos que sofreram co-injeção de apirase tiveram uma redução significativa no tamanho do tumor e menor índice mitótico (p<0,05), bem como menor imunodetecção para Ki67, VEGF e CD31 quando comparado com os grupos controle e controle apirase. A medida da hidrólise enzimática dos nucleotídeos no soro pode contribuir no diagnóstico de lesão celular em muitas condições patológicas. Com o objetivo de avaliar a atividade enzimática da ATPase, ADPase e AMPase in vivo, amostras de soro foram coletadas vinte dias após o implante dos gliomas em ratos. Os ratos com indução de gliomas mostraram um aumento significativo na hidrólise de ATP, ADP e AMP quando comparado com os respectivos controles. O tratamento com o fármaco temozolomida e com 10% dimetil sulfoxida diminuiu a hidrólise dos nucleotídeos. Nenhum dos animais incluídos neste trabalho apresentaram alterações significativas na atividade das enzimas alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e fosfatase alcalina. Nossos dados indicam que o ATP pode ter uma função importante no crescimento do glioma, pois quando liberado pode induzir a morte celular do tecido normal ao redor do tumor, abrindo espaço para o rápido crescimento e invasão do tumor. As avaliações da hidrólise dos nucleotídeos da adenina no soro podem ajudar no acompanhamento da progressão dos tumores cerebrais.

Gliomas são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. Nucleotídeos extracelulares estão envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Os níveis dos nucleotídeos da adenina podem ser controlados por hidrólise através da ação de vários membros da família das ectonucleotidases. O AMP formado pelas NTPDases é hidrolizado até adenosina por ação da ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT). A enzima ciclooxigenase (COX) está surgindo como um novo alvo na prevenção e no tratamento do câncer, sendo que substanciais evidências epidemiológicas, experimentais e clínicas sugerem que os antiinflamatórios não-esteróides (AINEs) possuem propriedades anticâncer. Vários estudos têm demonstrado que certos AINEs causam efeitos antiproliferativos independentes da atividade da COX. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos AINEs em linhagens celulares de gliomas e os possíveis mecanismos envolvidos neste efeito e avaliar a influência da indometacina na cascata de enzimas que catalisam a interconversão dos nucleotídeos. Indometacina, acetaminofeno, sulfeto de sulindaco e NS-398 induziram uma inibição da proliferação celular de modo tempo e dose dependente. Indometacina causou uma redução significativa na viabilidade celular. Nenhum dos AINEs testados induziu ativação de caspase 3/7. O tratamento com indometacina diminuiu a percentagem de células na fase S, com um aumento relativo nas fases G0/G1 e/ou G2/M, indicando uma parada na progressão do ciclo celular. A exposição de células de glioma à indometacina causou um aumento nas hidrólises de AMP e ATP. Um aumento significativo nos níveis de mRNA da ecto-5’-NT/CD73 foi observado após tratamento com indometacina Estes resultados suportam a hipótese que o aumento na atividade da ecto-5’-NT está relacionado com a superexpressão do mRNA com possíveis alterações no catabolismo das purinas extracelulares. Os dados sugerem ainda que o receptor A3 e a enzima ecto-5’-NT estão envolvidos no efeito antiproliferativo da indometacina nas linhagens celulares de gliomas. Considerando que a via das ectonucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna dos gliomas, os AINEs podem ser clinicamente importantes na intervenção farmacológica deste tipo de tumor.

Os gliomas são os tumores primários mais comuns no sistema nervoso central. Apesar dos progressos recentes no tratamento do glioblastoma, a sobrevida média dos pacientes ainda permanece em 15 meses. A cinesina KSP tem sido relatada como um alvo interessante para terapia do câncer. Seguidos pelo primeiro inibidor específico da KSP, monastrol, vários outros análogos estruturais também têm sido estudados. Aqui nós descrevemos o efeito do LaSOM 65, um composto derivado do monastrol, em gliomas. LaSOM 65 foi capaz de diminuir o crescimento celular e a viabilidade das células gliomas, mas, em contraste com monastrol, a molécula não causou bloqueio no ciclo celular em G2/M. Análises por citometria de fluxo mostraram que o LaSOM 65 leva as células à necrose e "apoptose tardia", após 24h e 48h de tratamento. Nós também investigamos o efeito do LaSOM 65 sobre a atividade da ecto-5'NT, uma enzima cuja expressão está associada com nível de invasão neovascularização e metástase dos tumores. O tratamento não alterou a atividade da enzima em comparação com as células controle. Experimentos in vivo mostraram que LaSOM 65 não foi capaz de diminuir o tamanho do tumor em modelo de gliomas de rato. Mais estudos são necessários para compreender os mecanismos pelos quais LaSOM 65 exerce seus efeitos citotóxicos. / Gliomas are the most common primary cancer in the central nervous system. Despite recent progress in the treatment of glioblastoma, the median survival of the patients still remains at 15 months. Kinesin Spindle Protein (KSP) has been reported as an interesting target for cancer therapy. Followed by the first specific KSP inhibitor, Monastrol, several other structural analogues have also been studied. Here we describe the effect of LaSOM 65, a monastrol derivated compound, against glioma. LaSOM 65 was able to decrease cell growth and cell viability of gliomas cells, but, in contrast with monastrol, the molecule did not cause blockage in the cell cycle on G2/M phase. Analysis by flow cytometry showed that LaSOM 65 leads cells to necrosis and “late apoptosis” after 24h and 48h of treatment. We also investigate the effect of LaSOM 65 on ecto-5'NT activity, an enzyme whose expression level is associated with neovascularization, invasiveness and metastasis of tumors. The treatment did not alter the enzyme activity compared to control cells. Experiments in vivo shown that LaSOM 65 was not able to decrease the tumor size in rat gliomas model. More studies are necessary to understand the mechanisms by which LaSOM 65 is exerting its cytotoxic effects.

A linhagem de glioma de rato C6 tem sido amplamente utilizada para investigar vários aspectos da biologia celular. Esta linhagem apresenta variações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas de acordo com o número de passagens em cultivo. Segundo a literatura, culturas de passagens recentes apresentam características similares a glioblastomas, enquanto que culturas de passagens tardias assemelham-se à astroglia madura. Devido a isso, muitos estudos têm utilizado a linhagem C6 como modelo celular de glioblastoma e de astrócitos para investigar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico, como por exemplo, captação de glutamato. Entretanto, até o presente momento a caracterização e comparação desses parâmetros entre as culturas da linhagem C6 de passagens recentes e tardias ainda não foram avaliadas. O objetivo desta dissertação foi investigar e comparar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico entre as culturas de C6 com passagens recentes e tardias. As passagens recentes apresentaram um conteúdo intracelular de [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu 55% maior quando comparadas às passagens tardias e ambas as culturas atingiram o platô a partir dos 120min de incubação. Além disso, ambas as culturas apresentaram, após incubação com glutamato, os mesmos níveis de incorporação de iodeto de propídeo. Este resultado indica que o menor nível intracelular de [3H] observado nas culturas de passagens tardias não se deve a uma alteração na permeabilidade ou integridade de membrana dessas células. Ambas as culturas expressam somente o transportador Na+ dependente de alta afinidade EAAC1 (carreador de aminoácido excitatórios 1), sendo que sua expressão total foi similar tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias. Para verificar se a captação de L-[3H]-Glu estava ocorrendo através de outro sistema de transporte, as culturas foram incubadas na presença ou ausência de PDC (L-trans-2,4--trans-Pyrrolidine-2,4-dicarboxylic acid ) ou TBOA (DL-threo-β-Benzyloxyaspartic acid). O tratamento com os inibidores reduziu de forma similar a captação de L-[3H]-Glu tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias, indicando que este aminoácido é captado principalmente através do transportador de alta afinidade EAAC1. Com relação à liberação de glutamato, observou-se que 50% da radioatividade incorporada na forma de L-[3H]-Glu foi liberada para o meio extracelular tanto nas passagens recentes quanto nas tardias após 2h de incubação. Este resultado pode estar relacionado com o estabelecimento do platô do conteúdo intracelular de [3H] observado após 120 min de captação de L-[3H]-Glu. Para investigar se a liberação de L-[3H]-Glu ocorreu via transporte reverso dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade, ambas as culturas foram incubadas na presença do inibidor não transportável TBOA. Não foi observada alteração no perfil de liberação de radioatividade intracelular nas culturas após incubação com TBOA. Para verificar se a metabolização do L-[3H]-Glu estaria relacionado com a diferença nos níveis intracelulares de [3H], ambas as culturas foram incubadas com o análogo não-metabolizável D-[3H]-Asp. Tanto as passagens recentes como as tardias apresentaram um aumento tempo-dependente do conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp, não atingindo o platô. Além disso, o bloqueio dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade por PDC ou TBOA reduziu a captação de D-[3H]-Asp em ambas as culturas, indicando que sua captação ocorreu principalmente através deste tipo de transporte. Além disso, diferentemente do observado com L-[3H]-Glu, apenas 10% do D-[3H]-Asp captado é liberado após 2h de incubação em ambas as culturas. Este resultado, juntamente com a não inibição por TBOA da liberação da radioatividade captada na forma de L-[3H]-Glu, indica que possivelmente o que está sendo liberado para o meio extracelular é um metabólito marcado com [3H] e não o próprio L-[3H]-Glu. Além disso, nas passagens tardias, o conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp foi menor quando comparado com as passagens recentes aos 60 e 120 min de incubação, sugerindo que as passagens recentes possuem intrinsecamente uma maior capacidade de transporte tanto de L-[3H]-Glu quanto de D-[3H]-Asp quando comparadas às passagens tardias. Os resultados dessa dissertação demonstram que as passagens recentes e tardias da linhagem de glioma C6 diferem na sua capacidade de acumular o [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu. A maior capacidade das passagens recentes da linhagem C6 em acumular a radioatividade não está relacionada a uma maior expressão dos transportadores de glutamato e nem a uma reduzida liberação de L-[3H]-Glu para o meio extracelular. Como conclusão, os resultados obtidos nesta dissertação indicam que o número de passagens deve ser considerado em futuros estudos que pretendam avaliar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico utilizando a linhagem C6 como modelo celular. / Rat C6 lineage has been widely used to investigate several aspects of cell biology. This lineage presents morphological, biochemical and physiological variations according to number of passages in culture. Early passage cells exhibit characteristics similar to glioblastomas, whereas later passage cells resemble mature astroglia. Thus, many studies have been using C6 lineage as astroglial and glioma model to investigate several parameters related to glutamatergic system, such as glutamate uptake. However, the characterization and comparison of these parameters between C6 cultures at early and late passages have not been evaluated. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare some glutamatergic system parameters between early and late passage C6 cells in cultures. Early passages have an L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H] 55% higher when compared to later passages and both cultures reached plateau at 120 min. In addition, after incubation with glutamate, both cultures showed the same levels of propidium iodide incorporation. This result indicates that lower levels of intracellular [3H] in later passages are not due to an alteration of cellular membrane permeability. Both cultures expressed only the higher affinity Na+ dependent transporter EAAC1, and its total expression was similar in early and later passage cultures. To verify if L-[3H]-Glu uptake occurred through another kind of glutamate transport system, the cultures were incubated in the presence or absence of PDC or TBOA. Treatment with this inhibitors reduced the L-[3H]-Glu uptake in both cultures at same levels, indicating that glutamate is taken up mainly by the higher affinity transporter system. Regarding the release of glutamate, it was observed that 50% of the radioactivity incorporated as L-[3H]-Glu was released to extracellular medium in both early and late passages after 2 h of incubation. This result could be related to the establishment of the plateau observed after 120 min for intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake. To investigate if the release of L-[3H]-Glu occurred trough reverse transport, both cultures were incubated in the presence of non-transportable inhibitor TBOA. There was no alteration of intracellular radioactivity release in cultures after incubation with TBOA. In order to verify if the metabolism of L-[3H]-Glu could be related to the differences in intracellular levels of [3H], both cultures were incubated with the non-metabolizable analogue D-[3H]-Asp. Early and late passage C6 cells showed a time-dependent increase in intracellular content of [3H] derived from D-[3H]-Asp uptake, without reaching the plateau. Moreover, blockade of Na+ dependent transporters of high affinity by PDC or TBOA reduced D-[3H]-Asp uptake in both cultures, indicating that uptake occurred mainly through EAAC1. Moreover, differently from L-[3H]-Glu, only 10% of D-[3H]-Asp captured is released after 2 h of incubation in both cultures. This result, taken together with the fact that TBOA did not inhibit the release of radioactivity captured as L-[3H]-Glu, indicates that a [3H]-metabolite is being released to extracellular medium and not L-[3H]-Glu itself. Moreover, in later passages, D-[3H]-Asp-derived intracellular content of [3H] was lower when compared to early passages at 60 and 120 min of incubation, suggesting that early passage C6 cells intrinsically have a greater capacity to transport both L-[3H]-Glu and D-[3H]-Asp when compared to later passages. This study demonstrates that early and late passage C6 cells differ in their ability to accumulate L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H]. From 60 min of incubation, early passages have an intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake 55% higher in relation to later passages. This increased capacity is not related to a higher expression of glutamate transporters nether nor by reduced release of L-[3H]-Glu to extracellular medium. In conclusion, our results indicate that the number of passages should be considered in future studies that intent to evaluate parameters relating to glutamatergic system using Rat C6 lineage as cell model.