Les amylosaccharases sont des α-transglucosylases catalysant naturellement la synthèse exclusive d’α-1,4-glucanes à partir du saccharose. Ces enzymes produisent également des composés secondaires et, en particulier, des isomères du saccharose tels que le turanose et le tréhalulose.L’objectif de cette thèse a consisté à utiliser un panel de techniques biophysiques et biochimiques afin d’étudier les amylosaccharases de Deinococcus geothermalis (ASDg) et Neisseria polysaccharea (ASNp) afin de comprendre les relations unissant la structure, la flexibilité et la fonction de ces enzymes.La première étude rapporte la caractérisation structurale et biophysique de l’amylosaccharase la plus thermostable connue à ce jour, l’amylosaccharase de Deinococcus geothermalis. La structure tridimensionnelle révèle une organisation dimérique en solution, jamais rapportée pour une amylosaccharase. Grâce à l’analyse de l’interface dimérique et à des travaux d’analyse de séquences, une séquence signature de dimérisation a été identifiée. En rigidifiant la structure de l’ASDg, la structure quaternaire contribue à l’augmentation de la stabilité thermique de la protéine. La spécificité de production des isomères du saccharose par les amylosaccharases a été étudiée. Les résultats décrivent, pour la première fois, les structures de l’ASDg et de l’ASNp en complexe avec le turanose. Dans l’ASNp, les résidus clefs forcent le résidu fructosyle à adopter une conformation linéaire positionnant idéalement le O3’ pour sa glucosylation expliquant la formation préférentielle de turanose par l’enzyme. Ces résidus sont absents ou placés différemment dans l’ASDg. En conséquence, l’ASDg lie principalement les formes furanoses du fructose avec un faible réseau d’interactions. La topologie du sous-site +1 permet donc différents modes de liaison du fructose en accord avec la capacité de l’ASDg à produire une plus grande quantité de tréhalulose par rapport à l’ASNp.Dans la seconde étude, des techniques de mutagenèse à saturation et combinatoire ciblées sur les acides aminés voisins du site actif ont été utilisées pour modifier la spécificité d'accepteur de l’ASNp. Le criblage de trois bibliothèques semi-rationnelles représentant un total de 20 000 variants a permis d’isoler trois doubles mutants montrant une amélioration spectaculaire de spécificité à la fois vis-à-vis du saccharose, le substrat donneur et de l’accepteur α-allyl-N-acetyl-2-désoxy-α-D-glucopyranoside par rapport au type sauvage de l’ASNp. De tels niveaux d'amélioration d'activité n'ont jamais été signalés auparavant pour cette classe d’enzymes actives sur les sucres. L’analyse par cristallographie des rayons X de la structure des meilleures enzymes mutantes suivie par des simulations de dynamique moléculaire ont montré une rigidité locale du sous-site -1 couplée à une flexibilité des boucles impliquées dans la topologie du site actif. Ces faits pourraient être à l’origine des performances catalytiques accrues de ces enzymes mutantes. L'étude démontre l'importance, lors de la conception des bibliothèques de variants, de tenir compte de la conformation locale des résidus catalytiques ainsi que de la dynamique des protéines au cours du processus catalytique / Amylosucrases are sucrose-utilizing α-transglucosylases that naturally catalyze the synthesis of α-glucans, exclusively linked through α-1,4 linkages. Side-products and in particular sucrose isomers such as turanose and trehalulose are also produced by these enzymes.The objective of this thesis concerned the application of biophysical and biochemical techniques to study amylosucrases from Deinococcus geothermalis (DgAS) and Neisseria polysaccharea (NpAS) in order to investigate relationships between structure, flexibility and function of these enzymes.In the first study, we report the first structural and biophysical characterization of the most thermostable amylosucrase identified so far, the amylosucrase from Deinoccocus geothermalis. The 3D-structure revealed a homodimeric quaternary organization, never reported before for other amylosucrases. A sequence signature of dimerization was identified from the analysis of the dimer interface and sequence alignments. By rigidifying DgAS structure, the quaternary organization is likely to participate in the enhanced thermal stability of the protein. Amylosucrase specificity with respect to sucrose isomer formation (turanose or trehalulose) was also investigated. We report the first structures of the DgAS and NpAS in complex with turanose. In NpAS, key residues were found to force the fructosyl moiety to bind in an open state with the O3' ideally positioned to explain the preferential formation of turanose by NpAS. Such residues are either not present or not similarly placed in DgAS. As a consequence, DgAS binds the furanose tautomers of fructose through a weak network of interactions to enable turanose formation. Such topology at subsite +1 is likely favoring other possible fructose binding modes in agreement with the higher amount of trehalulose formed by DgAS.In the second study, iterative saturation mutagenesis and combinatorial active site saturation focused on vicinal amino acids were used to alter the acceptor specificity of NpAS and sort out improved variants. From the screening of three semi-rational sub-libraries accounting in total for 20,000 variants, we report here the isolation of three double-mutants displaying a spectacular specificity enhancement towards both sucrose, the donor substrate, and the α-ally-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside acceptor compared to wild-type N. polysaccharea amylosucrase. Such levels of activity improvement have never been reported before for this class of carbohydrate-active enzymes. X-ray structural analysis of the best performing enzymes followed by Molecular Dynamics simulations showed both local rigidity of the -1 subsite and flexibility of loops involved in active site topology which both account for the enhanced catalytic performances of the mutants. The study well illustrates the importance when designing enzyme libraries of taking into account the local conformation of catalytic residues as well as protein dynamics during the catalytic process

Le genre Pneumocystis désigne un groupe de champignons opportunistes présentant une étroite spécificité d'hôte. Il détermine lors d'immunodépression sévère une infection pulmonaire grave, la pneumonie à Pneumocystis (PPC). La transmission de Pneumocystis par voie aérienne d'un hôte développant une PPC à un hôte susceptible a été démontrée à l'aide des modèles murins. Les travaux menés chez la souris ont montré également que des sujets immunocompétents colonisés par Pneumocystis murina peuvent transmettre le champignon à des souris immunodéprimées qui développeront une PPC ultérieurement. Les individus colonisés par Pneumocystis sp., ainsi que ceux développant une PPC, participeraient au réservoir du champignon. La survenue de cas groupés de PPC en milieu hospitalier est en faveur de la transmission interindividuelle de Pneumocystis jirovecii (P.jirovecii) chez l’homme. La détection de l'ADN de P.jirovecii dans l'air exhalé par les patients développant une PPC suggère que cette transmission se fait par voie aérienne. La caractérisation des populations infectées par P.jirovecii et la caractérisation génotypique du champignon au sein de son réservoir humain constituent la base de ce travail de recherche. Nous avons montré que la prévalence de la colonisation par P.jirovecii est faible chez les patients atteints de mucoviscidose et suivis dans notre CHU. La participation de ces patients au réservoir de P.jirovecii à Brest serait donc marginale. Cette faible prévalence pourrait être le reflet d'une faible circulation du champignon dans les communautés humaines dans notre région. Nous avons évalué le dosage du ß-1,3-D glucane sérique pour dépister les populations infectées. Ce dosage couplé à la détection de P.jirovecii dans les prélèvements respiratoires par la microscopie et la PCR, permet de différencier les patients développant une PPC et les patients présentant une colonisation pulmonaire par P.jirovecii. De plus, les premières données sur le ß-1,3-D glucane au cours de la primo-infection chez le nourrisson ont été obtenues.En termes de caractérisation de P.jirovecii dans notre région, l'analyse du locus dihydropteroate synthase (DHPS) a montré que: i) le lieu habituel de résidence plutôt que le lieu de diagnostic de l’infection à P.jirovecii serait un facteur prédictif d’infection par un mutant, ii) P.jirovecii pourrait circuler en France d’une région à une autre via des voyageurs infectés, iii) la prévalence de mutants potentiellement résistants chez les patients vivant effectivement à Brest était de 0%. L'analyse des séquences des "internal transcribed spacers" (ITS) 1 et 2 de P. jirovecii conforte l'hypothèse que les patients développant une PPC et les patients colonisés sont infectés par des populations fongiques présentant des caractéristiques identiques. Tous les patients, quelle que soit la présentation clinique de leur infection, constitueraient un réservoir unique et commun de P.jirovecii. Les travaux de génotypage ont constitué l'étape préalable nécessaire à l'analyse de cas groupés d'infections à P.jirovecii survenus chez des patients transplantés rénaux au CHU de Brest. Nous avons apporté des données originales sur le rôle des patients colonisés en tant que source potentielle de P. jirovecii dans un contexte d'acquisition et de transmission nosocomiales du champignon. Par ailleurs, la concordance partielle ou complète des génotypes ITS et DHPS dans les couples "prélèvements d'air–LBA" réalisés chez des patients développant une PPC est compatible avec l’exhalation du champignon et sa diffusion aérienne dans l’environnement hospitalier. Ces données apportent des arguments pour l'application de mesures de prévention des infections nosocomiales à P. jirovecii. Les précautions "gouttelettes" recommandées par la Société Française d'Hygiène Hospitalière devraient être appliquées a minima aux patients développant une PPC. Nous proposons leur extension aux patients colonisés par le champignon. / The genus Pneumocystis represents a group of opportunistic fungi that show strong host specificity. It is the cause of severe pneumonia (Pneumocystis Pneumonia [PCP]) in immunocompromised subjects. Pneumocystis transmission from a host with PCP to another susceptible host via the airborne route has been demonstrated in rodent models. Moreover, it has been established that Pneumocystis murina can be transmitted from immunocompetent mice, transiently colonized by the fungus, to immunocompromised susceptible mice that subsequently develop PCP. Colonized subjects and those developing PCP may be part of the fungus reservoir. Reports of PCP case cluster in hospital strongly suggest that Pneumocystis jirovecii (P.jirovecii) transmission in humans may also occur. P.jirovecii DNA detection in the air surrounding PCP patients is consistent with the transmission of P.jirovecii via the airborne route.Our goals were to characterize human populations infected with P.jirovecii and to characterize P.jirovecii within its human reservoir. We showed that P.jirovecii was rarely involved in pulmonary colonization in patients with cystic fibrosis monitored in the Brest Hospital. Thus this patient population was not part of the human reservoir of the fungus in our region (Brittany, Western France). This low prevalence of colonization may reflect a low level of P.jirovecii circulation within human communities in Brittany. In order to improve the identification of patients infected with P.jirovecii, we evaluated ß-1,3-D glucan detection in serum samples. We showed that serum ß-1,3-D glucan levels combined with P.jirovecii detection in pulmonary samples using microscopic examination and a PCR assay make it possible to distinguish between PCP and pulmonary colonization. Moreover the first data on ß-1,3-D glucan levels during primary infection were obtained.In order to characterize P.jirovecii in our region, we performed the typing of P.jirovecii isolates from infected patients monitored at Brest hospital, using the dihydropteroate synthase (DHPS) and the internal transcribed spacer (ITS) 1 and 2 locus analysis. DHPS typing showed that i) the usual city of patient residence rather that the city in which the diagnosis of P.jirovecii infection has been made is a predictor of mutants, ii) mutants can be imported from one region to another through infected visitors, iii) the prevalence of mutants potentially resistant to sulfonamides was 0% in patients who effectively lived in the Brest geographic area. Results of ITS analysis in PCP patients and colonized patients are consistent with the hypothesis that these 2 patient groups are infected with similar P.jirovecii populations. All infected patients, whatever their clinical presentation, may be part of a common and unique reservoir of the fungus. We investigated an outbreak of P.jirovecii infections in 18 renal transplant recipients using the same typing method combined with patient encounter analysis. The results provided evidence of the role of colonized patients as potential sources of P.jirovecii. The same typing method was applied to pairs of pulmonary samples and room air samples of PCP patients. Full or partial matches of P.jirovecii types in pulmonary and air sample pairs were observed. These results are consistent with P.jirovecii exhalation by PCP patients in their close environment. These data support arguments for applying droplet precautions, at least to PCP patients, to prevent P.jirovecii transmission, as recommended by the "Société française d'hygiène hospitalière". We suggest extending droplet precautions to colonized patients to achieve the prevention of P.jirovecii nosocomial infections.

Les glucane-saccharases sont des transglucosidases de la famille 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d’alpha -glucanes, polymères de haute masse molaire formés d’unités glucosyle. Elles sont aussi capables de synthétiser des oligosaccharides ou glucoconjugués par réaction de transglucosylation sur des accepteurs exogènes de natures variées. De par la diversité de leurs spécificités, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées [alpha (1→2) ; alpha (1→3) ; alpha (1→4) ou alpha (1→6)] que de l’organisation de ces liaisons au sein des produits formés, ces biocatalyseurs peuvent être mis à profit pour produire des hydrates de carbones d'intérêt pour les secteurs de l'alimentation, de la santé et de l'environnement. L'objectif de ces travaux de thèse était de générer par ingénierie enzymatique de nouvelles glucane-saccharases capables de synthétiser des alpha -glucanes et des gluco-oligosaccharides de structures et propriétés innovantes, afin d’élargir le panel d'applications de ces molécules. Sur le plan fondamental, l'enjeu était aussi d'améliorer la compréhension des relations entre structure et spécificité des glucane-saccharases. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisé une stratégie d'ingénierie combinatoire de la dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, qui catalyse la synthèse d’un dextrane formé à 95 % de liaisons alpha (1→6) et 5 % alpha (1→3). Le travail a tout d'abord consisté à développer une méthode de criblage multi-étapes et à haut-débit, pour isoler et trier les variants de spécificités de liaisons variées. La stratégie comprend une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivie d’un criblage par RMN 1D 1H automatisé au format microplaque. Il s'agit de la première méthode de criblage à haut-débit de la spécificité de liaison des transglucosidases et glycosyltransferases. Cette stratégie a ensuite été appliquée au criblage de deux banques de variants de la DSR-S, totalisant plus de 36 000 clones obtenus par mutagénèse de saturation et recombinaison simultanée de 8 résidus du domaine catalytique. Au total, 82 mutants capables de synthétiser entre 2 et 8 fois plus de liaisons alpha (1→3) par rapport à l’enzyme parentale ont été isolés. La caractérisation des propriétés catalytiques de sept mutants représentatifs de la diversité de spécificité générée a permis d’identifier un nouveau motif peptidique 460DYVHT464 impliqué dans la spécificité de DSR-S. Enfin, la caractérisation de la structure et des propriétés rhéologiques et mécaniques des dextranes synthétisés par ces 7 mutants a mis en évidence les différences de taille et de conformation de ces macromolécules en solution et révélé l’aptitude du polymère synthétisé par le variant H463R/T464V/S512T à former des films bio-sourcés innovants, dont les propriétés mécaniques sont remarquables en comparaison de celles d'autres biopolymères extraits de plantes ou produits par fermentation / Glucansucrases are transglucosidases from glycoside hydrolase family 70. From sucrose, these enzymes catalyse the synthesis of alpha -glucans, high molecular weight polymers formed of glucosyl units. Glucansucrases are also able to synthesize oligosaccharides or glucoconjugates by transglucosylation reaction onto various exogenous acceptors. Due to the large specificity, in terms of osidic linkages synthesized [alpha (1→2); alpha (1→3); alpha (1→4) or alpha (1→6)] and their organization within the formed products, these biocatalysts can be used to produce carbohydrates of interest in food, health and environment fields. The aim of this research work was to generate, by enzyme engineering, new glucansucrases able to synthesize alpha -glucans and gluco-oligosaccharides with novel structures and properties, to enlarge applications of these molecules. At fundamental level, the work was to improve the understanding of the relationships between structure and specificity of glucansucrases. To reach our objectives, we used a combinatorial engineering strategy on the dextransucrase DSR-S of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, which catalyses the synthesis of a dextran formed by 95 % of alpha (1→6) and 5 % alpha (1→3) linkages. The work consisted first in the development of a multi-step high throughput screening methodology to sort out and isolate variants with altered linkage specificities. The strategy includes a first stage of in vivo selection on solid medium followed by an automated 1D 1H NMR-based screening using microplates. To date, this is the first high-throughput screening method for linkage specificity determination of transglucosidases and glycosyltransferases. This strategy was applied to the screening of two DSR-S variants libraries, totalizing more than 36,000 clones obtained by saturation mutagenesis and simultaneous recombination of 8 residues from the catalytic domain. Eighty two mutants able of synthesize 2 to 8 times more alpha (1→3) linkages compared to the parental enzyme were isolated. The characterization of the catalytic properties of 7 representative mutants enabled the identification of a new peptide motif 460DYVHT464, involved in DSR-S specificity. Finally, the characterization of structural, rheological and mechanical properties of dextrans synthetized by these 7 mutants highlighted the differences in size and conformation of these macromolecules in solution and revealed the capacity of the polymer synthesized by H463R/T464V/S512T variant to form biofilms, whose mechanical properties are remarkable in comparison to those of other biopolymers extracted from plants or produced by fermentation.