Univ., Diss.--Regensburg, 2004.

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2008.

Universiẗat, Diss., 2004--Bielefeld.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Les glucane-saccharases (GS) de la famille GH70 sont des enzymes produites par certaines bactéries lactiques. A partir de saccharose, substrat renouvelable et peu coûteux, elles sont capables de catalyser la synthèse d’α-glucanes, homopolysaccharides dont les propriétés diffèrent suivant la spécificité de l’enzyme (taille, type de liaisons α-osidiques, degrés de branchement). Les glucanes contenant une très grande majorité de liaisons α-(1,6), appelés dextranes, présentent de nombreuses applications industrielles qui dépendent principalement de leur taille. Cependant, la synthèse directe de dextranes de taille contrôlée (de 1 à plusieurs millions de kg/mol) avec une faible polydispersité et en utilisant une seule enzyme n’est encore pas envisageable. En effet, les mécanismes moléculaires mis en jeu pour le contrôle de la taille des polymères produits n’ont encore été que peu explorés. Dans ce contexte, deux GSs ont été sélectionnées. La première, DSR-M synthétise uniquement des dextranes de faible masse molaire (MM) (28 kg/mol) exclusivement composés de liaisons α-(1,6). A contrario, le second modèle, DSR-OK produit le plus long dextrane décrit à ce jour (>109 g/mol). La caractérisation biochimique et structurale ainsi que la construction de mutants ont permis l’exploration du mode d’action de ces deux candidats. Plusieurs structures 3D de DSR-M2 (forme tronquée de DSR-M) - sans ou en complexe avec son substrat ou ses produits (isomaltotetraose) - ont été résolues. C’est la première fois que de tels complexes sont décrits et l’une de ces structures présente le domaine V le plus complet décrit à ce jour. L’analyse de ces structures couplée au suivi cinétique de la synthèse du polymère ont montré que la spécificité de DSR-M pour la synthèse de dextranes courts s’explique par un mode d’élongation distributif dû à la faible affinité de deux poches à sucre de son domaine V envers la chaîne en cours de synthèse. Des analyses RMN (15N1H – HSQC) – jamais réalisées auparavant sur une protéine si grosse – ont également étayé l’importance de la présence de résidus aromatiques dans le domaine catalytique pour la synthèse de dextranes supérieurs à 2 kg/mol. En comparaison, la synthèse de dextranes de haute MM par DSR-OK est principalement due au plus grand nombre de poches à sucre de son domaine V, permettant d’assurer une meilleure interaction avec la chaîne en cours d’élongation. L’implication de ces poches dans la détermination de la taille du dextrane a été montrée pour les deux candidats. Leur fonctionnalité est fortement liée à la présence d’un résidu aromatique de stacking, et leur répartition le long du domaine V a aussi une influence. L’ensemble de ces résultats démontre la coopération du domaine V avec le domaine catalytique pour l’élongation des dextranes, tout en offrant de nouvelles perspectives pour approfondir la compréhension de ce mécanisme. Ils offrent également des stratégies prometteuses pour l’ingénierie d’enzyme de la famille des GH70 pour la modulation de la taille des glucanes. / Glucansucrases (GS) from glycoside hydrolase family 70 (GH70) are -transglucosylases produced by lactic acid bacteria. From sucrose, an economical and abundant agro resource, they catalyze the polymerization of glucosyl residues. Depending on the enzyme specificity, α-glucans vary in terms of size, types of glucosidic bonds and degree of branching and have found multiple industrial applications mainly related to their molar mass (MM). However synthesizing polymers of controlled size with average MM ranging from 1 kg/mol to several millions g/mol and low polydispersity using one single enzyme remains challenging. Indeed, the molecular mechanisms underpinning the control of polymer size have been scarcely explored. To tackle this question, two GSs producing dextran (glucan composed of a majority of α-(1,6) linkages) were selected, and their mode of action explored via biochemical and structural analyses coupled to mutagenesis. The first enzyme selected, called DSR-M synthesizes only low molar mass (LMM) dextran (28 kg/mol) exclusively composed of -(1→6) linkages without any trace of HMM dextran (105 to 108 g/mol). In contrast, DSR-OK (second model), produces the highest MM dextran (>109 g/mol) described to date. Several 3D crystallographic structures of a truncated form of DSR-M (DSR-M2), either free or in complex with its substrate or product (isomaltotetraose) in the domain V or in the active site were solved. Such complexes were never obtained before. Noteworthy, one structure encompassed the most complete domain V reported to date. Analyses of these structures coupled to dextran synthesis monitoring, showed that the LMM dextran specificity of DSR-M2 is explained by a distributive elongation mode due to the weak affinity of its two sugar binding pockets in the domain V which interact with the growing dextran chains and allow the synthesis of dextran longer than 16 kg/mol. 15N1H NMR analyses (HSQC), for the first time performed with such a big protein, further revealed the crucial role of aromatic residues in the catalytic domain for the production of dextran from 2 to 16 kg/mol. In comparison, synthesis of HMM dextran by DSR-OK was shown to be mainly due to the sugar binding pockets of its domain V, ensuring much stronger interactions with growing dextran chains. The role of these pockets was evidenced for both enzymes, their functionality proposed to be linked to the presence of one aromatic stacking residue. Their positioning along domain V relatively to the active site is also important to promote efficient binding. All these findings highlight the cooperation between domain V and the catalytic domain for dextran elongation, offer new perspectives to acquire a deeper knowledge on this interplay and open promising strategies for GH70 enzyme engineering aiming at modulating glucan size.

La promiscuité des enzymes joue un rôle primordial pour l’évolution des protéines et la divergence des fonctions catalytiques. Comprendre les déterminants moléculaires qui régissent cette promiscuité enzymatique représente un enjeu scientifique majeur pour identifier les trajectoires évolutives pouvant entrainer l’émergence de nouvelles fonctions. L’objectif de cette thèse a consisté d’une part à sonder la promiscuité catalytique de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, une transglucosidase d’intérêt biotechnologique majeur, dans le but d’identifier des substrats alternatifs et d’autre part à étendre ses capacités naturelles par des techniques d’évolution moléculaire. Une trentaine de molécules ont été testées et ont permis de mettre en évidence la forte spécificité de l’enzyme pour son substrat donneur ainsi que sa large promiscuité vers les substrats accepteurs. Le rôle des résidus impliqués dans la reconnaissance des substrats a par la suite été considéré au travers d’une stratégie rationnelle basée sur des prévisions de stabilité thermodynamique. Deux histidines (H187 et H392), ont ainsi été ciblées par mutagénèse à saturation. La stabilité de ces mutants a été étudiée ainsi que ainsi que leur activité envers différents substrats. Des enzymes à la stabilité améliorée ou montrant des changements de spécificité de produits ont ainsi été identifiées. Afin d’étudier plus amplement la promiscuité de cette amylosaccharase, une deuxième stratégie d’ingénierie a été menée pour mimer in vitro les mécanismes moléculaires de la dérive génétique neutre. Ce phénomène dit de “Neutral-Drift” a préalablement été décrit comme un facteur impliqué dans les changements de promiscuité catalytique. Quatre cycles de mutagénèse ont ainsi été réalisés et 440 clones ont été sélectionnés pour avoir conservé leur fonction originelle (i.e. leur activité sur saccharose). Des variants aux propriétés catalytiques améliorées envers des substrats alternatifs ont été caractérisés et des groupes de positions corrélées ont été identifiés. L’effet des mutations neutres sur la thermostabilité a également été étudié. Enfin, de façon remarquable, une nouvelle activité envers un substrat non reconnu par l’enzyme native, le méthyl-α-L-rhamnopyranoside, a été détectée. Ce variant possédant quatre substitutions a été caractérisé et la résolution de sa structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons-X permettra d’approfondir les relations unissant séquence, structure et activité de l’enzyme / Investigation of substrate promiscuity is of prime interest to understand the way enzymes evolve. Understanding the molecular determinants involved in substrate promiscuity is challenging to determine the evolutionary trajectories that lead to the emergence of catalytic functions and to take further advantage of their evolvability to develop original biocatalysts. The objective of this thesis aimed to investigate the substrate promiscuity of the amylosucrase from Neisseria polysaccharea, a transglucosidase of prime biotechnological interest, to identify alternative donor and acceptor molecules and further extend its catalytic properties through enzyme engineering. About thirty molecules were assayed and the strong specificity for the natural donor sucrose was emphasized, as well as the broad acceptor promiscuity. The rational engineering of active site residues responsible for substrate recognition was undertaken through thermodynamic stability predictions. Two residues, namely H187 and H392, were rationally targeted for site-directed mutagenesis. The stability of these variants was investigated as well as their activity toward both natural and promiscuous substrates. Variants with enhanced stability or altered product distribution were identified. These results highlighted that mutations responsible for stability changes may also lead to substrate promiscuity or product specificity changes. To further investigate the promiscuity of amylosucrase, we considered another engineering strategy to mimic in vitro the neutral enzyme evolution. Neutral genetic drift was previously shown to be related to promiscuity changes. On this basis, four repeated round of mutagenesis were performed and 440 clones were selected because they maintained the protein original function (i.e. the activity on sucrose). Variants with enhanced properties towards promiscuous donors and acceptors were characterized and clusters of correlated amino acid substitutions were identified. The impact of neutral mutations on thermodynamic stability was also discussed. Remarkably, a totally new activity towards methyl-α-L-rhamnopyranoside, an acceptor not recognized by the parental wild-type enzyme, was detected. The variant harboring four amino acid substitutions was characterized and the determination of its three-dimensional structure by X-ray crystallography will be useful to further investigate the structure-sequence-activity relationships of this enzyme

L’alternane-saccharase (ASR) de Leuconostoc citreum NRRL B-1355 est une glucane-saccharase appartenant à la famille 70 des glycoside hydrolases (GH70). Cette α-transglucosylase utilise le saccharose, substrat peu coûteux et abondant, pour catalyser la formation d’un polymère d’α-glucane composé de liaisons osidiques α-1,6 et α-1,3 alternées dans la chaîne principale et appelé alternane. Avec une température optimale de 45°C, l’ASR est parmi les glucane-saccharases les plus stables. Afin d’avoir une meilleure compréhension des déterminants de la spécificité de liaison, de la polymérisation et de la plus haute stabilité de l’ASR, nous avons résolu la structure de cette enzyme. Notre étude par mutagénèse dirigée combinée à du docking moléculaire suggère que la spécificité de liaison est contrôlée par le positionnement de l’accepteur dans l’un ou l’autre des sous-sites +2 ou +2’. Des complexes de l’ASR avec différents ligands ont également mis en évidence un site signature de l’enzyme. Ce site est impliqué dans la formation du polymère d’alternane et pourrait servir de pont facilitant l’élongation processive de l’alternane. Enfin, nos travaux préliminaires indiquent que le domaine C pourrait être impliqué dans la stabilité de ces enzymes. Nos résultats ouvrent des nouvelles pistes d’investigation concernant l’étude des relations structure-fonction des glucane-saccharases et la conception de polymères de structure et propriétés physico-chimiques contrôlées. / The alternansucrase (ASR) from Leuconostoc citreum NRRL B-1355 is a glucansucrase belonging to the family 70 of glycoside hydrolases (GH70). This α-transglucosylase uses a cheap and abundant molecule, sucrose, to catalyze the formation of a unique α-glucan polymer made of alternating α-1,6 and α-1,3 linkages in the main chain, called alternan. With a 45°C optimum temperature, ASR is among the most stable glucansucrases to date. To get a deeper insight in ASR determinants involved in linkage specificity, polymerization and stability, we have solved the unliganded 3D structure of this enzyme at 2.8 Å. Coupled to mutagenesis and molecular docking, our results suggest the alternance to be governed by the acceptor positioning in either +2 or +2’ subsite, and the key contributions of Trp675 or Asp772 residue, respectively. Complexes of ASR with various sugar ligands were also obtained and highlighted a site never identified in any other GH70 enzymes. This site is uniquely found in alternansucrase and could act as a bridge between the domain V and the active site facilitating alternan processive elongation. Finally, the construction and characterization of chimera enzymes suggested domain C to be involved in enzyme stability. Overall, our results improved our knowledge on the structure-function relationship of ASR and open new paths for the conception of polymers with controlled structures and physicochemical properties

Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de décès dans le monde et elles sont souvent causées par l’athérosclérose coronarienne caractérisée par l’accumulation de plaques dans la paroi des artères menant à leur rétrécissement et à la réduction ou l’abolition de l’apport sanguin régional au muscle cardiaque. Les anomalies du métabolisme des lipides, incluant l’élévation du cholestérol dans les lipoprotéines de basse densité (LDL-cholestérol) contribuent au processus d’athérosclérose. Plusieurs traitements existent pour réduire les taux de lipides plasmatiques chez les sujets à risque, dont le principal est les statines. Cependant, les statines ne permettent pas toujours d’atteindre les cibles thérapeutiques, ce qui justifie la recherche de nouveaux traitements pouvant modifier les lipides plasmatiques. Une avenue potentielle de traitement à explorer est le beta-glucane, une fibre soluble contenue dans l’avoine pour laquelle certaines données suggèrent un effet hypolipidémiant. L’objectif de ce mémoire était d’évaluer l’efficacité d’un supplément de beta-glucane dans la réduction des taux plasmatiques de LDL-C chez les patients atteints de dyslipidémie à travers le Canada. Pour ce faire, nous avons effectué un essai clinique randomisé en double aveugle contrôlé par placebo dans une population de 264 sujets atteints d’hyperlipidémie qui ont reçus aléatoirement des traitements de beta-glucane à doses de 1.5 g, 3 g et 6 g ou un placebo durant 12 semaines. Tout au long du traitement, des mesures du taux plasmatique de LDL-C ont été effectuées et des analyses statistiques de covariance (ANCOVA) ont été faites pour comparer ces taux entre les groupes actifs et placebos afin d’observer s’il y avait des changements significatifs. La mesure d’efficacité établie était une réduction du taux de LDL-C d’au moins 0.30 mmol/L. Nos résultats suggèrent que le supplément de beta-glucane à doses de 1.5 g, 3 g et 6 g n’est pas efficace pour réduire les taux de lipides sériques. Il n’y a pas eu de variation significative dans les taux de LDL-C lorsque les groupes actifs ont été comparé au groupe placebo. / Cardiovascular diseases are the principal cause of death in the world, and they are often caused by coronary atherosclerosis characterized by the accumulation of plaques in the wall of arteries leading to their narrowing and reduction or disappearance of regional blood supply to the cardiac muscle. Abnormalities of lipid metabolism, including elevated cholesterol in low-density lipoproteins (LDL-C), contribute to the atherosclerotic process. Several treatments exist to reduce levels of plasma lipids in patients at risk, the main one being statins. However, a substantial number of patients do not reach recommended therapeutic targets while treated with statins which creates the impetus for the search of new lipid-modifying treatments. One potential avenue of treatment worthy of investigation is beta-glucan, a soluble fiber found in oats, for which some data have suggested a lipid-lowering effect. The objective of this thesis was to evaluate the efficacy of a beta-glucan supplement in reducing plasma LDL-C levels in patients with dyslipidemia across Canada. To do this, we conducted a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial in a population of 264 subjects with hyperlipidemia who randomly received beta-glucan treatments at doses of 1.5 g, 3 g and 6 g or a placebo for 12 weeks. Throughout the treatment, LDL-C plasma measurements were taken and statistical analyzes of covariance (ANCOVA) were done to compare these levels between the active and placebo groups to observe if there were any significant changes. The established measure of efficacy was a reduction in LDL-C of at least 0.30 mmol/L. Briefly, our results have shown that beta-glucan in doses of 1.5 g, 3 g and 6 g is not efficacious in reducing plasma lipid levels. There was no significant change in LDL-C levels when the active groups were compared to the placebo group.

Résumé : Chez lorge, la dégradation des polysaccarides des parois cellulaires et de lamidon est de première importance dans le contexte de sa valorisation brassicole. La présente recherche doctorale a été entreprise dans le but didentifier des marqueurs de sélection utilisables lors de lamélioration génétique de lorge de printemps pour ses qualités brassicoles. Des gènes candidats ont dabord été choisis sur base de leur expression dans les tissus de la graine en germination. Leur position cartographique a été déterminée et située par rapport à des marqueurs QTL connus de la qualité brassicole. Exploitant des variétés cultivées de qualités contrastées, une recherche de polymorphismes nucléotidiques au niveau de ces gènes a été réalisée. Tous les gènes savèrent polymorphes, certaines des variations de séquence conduisant à des modifications de la structure primaire de la protéine encodée. Plusieurs caractères technologiques ont été retenus et définis chez les variétés étudiées, en exploitant les données de la littérature : la teneur en extrait, la viscosité, la teneur en β-glucanes du mout, latténuation finale apparente et le pouvoir diastasique. Plusieurs caractères biochimiques ont été étudiés chez ces mêmes variétés et ont ciblé quatre activités enzymatiques impliquées dans la dégradation des polysaccharides pariétaux et de réserve. Le pouvoir discriminant et la simplicité du test dactivité amylase, ainsi que sa relation avec des critères technologiques importants, en font un test prometteur en vue de faciliter la sélection variétale. La relation entre les sites polymorphes de lADN et les caractères technologiques et biochimiques identifient une soixantaine de sites dont les polymorphismes semblent associés à au moins lun des caractères. Sur tous les sites polymorphes, treize sites sont choisis pour leur potentiel en tant que marqueurs de sélection. Ils distinguent en effet un allèle favorable et un allèle défavorable pour plus dun critère brassicole. Ces treize sites sont localisés sur des gènes de (1-3,1-4)-β-glucanase, un gène de (1-3)-β-glucanase, un gène de (1-4)-β-xylan endohydrolase et un gène dα-amylase. La mise en évidence de ces allèles peut être réalisée par des tests PCR simples (« allèles spécifiques ») et relativement peu coûteux, dont six ont été mis au point au terme de la recherche./ Summary: In barley, the degradation of cell wall polysaccharides and starch is of utmost importance for its malting quality. The aim of this thesis is the identification of selection markers useful in the breeding of spring Barley cultivars for improved malting quality. Candidate genes were first chosen based on their expression profile in tissues of germinating seeds. Their mapping positions were determined and compared with known QTLs for malting quality. Varieties with contrasted malting qualities were searched for DNA polymorphisms for each of these genes. All genes proved to be polymorphic, some of the sequence variations leading to changes in the primary structure of the encoded protein. Technological traits were chosen and used to characterize the varieties based on literature data: extract yield, viscosity, β-glucan content of the wort, final apparent attenuation and diastatic power. Biochemical traits were also investigated on the same varieties and focused on four enzyme activities implicated in cell wall polysaccharides and starch degradation. The Discriminant power and ease of the amylase test, as well as its relation with technological traits, make it a promising selection test in breeding programs. The relationship between the DNA polymorphisms and biochemical and technological traits reveals around sixty polymorphisms displaying apparent relationships with at least one trait. Thirteen out of them were chosen for their potential as selection markers. They are located on (1-3,1-4)-β-glucanase genes, on one (1-3)-β-glucanase gene, on one (1-4)-β-xylan endohydrolase gene and on one α-amylase gene. Detection of these alleles can be achieved by simple and inexpensive PCR tests ( allele specific), and six assay protocols have been set up at the completion of this research.

L’immunothérapie anti-cancéreuse vise à éliminer les cellules tumorales en stimulant les propres cellules du système immunitaire du patient. Dans ce projet, nous avons développé une nouvelle stratégie d’immunothérapie visant à cibler directement des immunostimulants a la surface des cellules tumorales par ligation bio-orthogonale. Nous utilisons, pour marquer spécifiquement les cellules tumorales, leur métabolisme particulier et très actif qui permet d’intégrer à leur surface, dans leurs glycanes, des azido sucres capables de se lier en grand nombre avec divers immunostimulants portant des groupements réactifs adéquats (= glyco-ingénierie métabolique). Pour la ligation aux glycanes, nous employons la chimie bio-orthogonale qui est basée sur l’utilisation de 2 groupements mutuellement réactifs, tous 2 absents des milieux biologiques et qui peuvent se coupler rapidement très sélectivement et donc pratiquement sans réactions secondaires dans des conditions douces compatibles avec une application in vivo. Notre choix d’immunostimulants s’est porte sur les oligonucléotides de type CpG (puissants immunostimulants) et sur les β-glucanes qui, en combinaison avec des anticorps thérapeutiques, stimulent la phagocytose et n’entrainent pas une secretion importante de cytokines. Ainsi, après avoir determiné les meilleures conditions d’incorporation des azido sucres et mis au point le couplage des immunostimulants à différents groupements bioorthogonaux, nous sommes parvenus à montrer in vitro la fixation des immunostimulants à la surface de différentes lignées tumorales. Des tests immunologiques in vitro et une étude in vivo ont ensuite permis de valider l’effet des immunostimulants fixés à la surface des cellules tumorales. Nous avons ainsi observe sur une série de souris, un ralentissement de développement tumoral en présence d’un puissant immunostimulant fixé sur les cellules tumorales. / Cancer immunotherapy uses the patient's own immune system to fight cancer. In this research project, we propose a new strategy for immunotherapy: binding immunostimulants in situ to the tumor cell surface using bio-orthogonal chemistry. For that purpose we use the particular and active metabolism of tumor cells to introduce by metabolic glycoengineering into their cell surface glycans, azido sugars capable of binding many different immunostimulants carrying adequate reactive groups. The biorthogonal chemistry allowing this specific ligation is based on the use of two mutually reactive groups both naturally absent from biological systems and which can be coupled selectively and very quickly in conditions totally compatible with living organisms. Our choice of immunostimulants consists, on one hand, of CpG oligonucleotides (powerful general immunostimulants) and on the other hand of β-glucans (phagocytosis stimulants used in combination with therapeutic antibodies without causing strong cytokine secretion). We determined the best conditions for the introduction of azido sugars into cell glycans of different tumor models and tried different biorthogonal groups and reaction conditions to obtain the best immunostimulant coupling to the surface of various tumor cell lines. Then, we performed in vitro immunological tests and in vivo studies in mice in order to validate the effect of the association between immunostimulants and tumor cells on the immune response against tumors. Thereby, we observed on a group of mice, reduced tumor growth when the strong immunostimulant CpG was fixed onto tumor cell surface.