Objectifs : Le gène SHANK3 code pour une protéine dite d’« échafaudage » localisée dans les synapses des neurones glutamatergiques. Elle est nécessaire au bon assemblage des protéines de la densité postsynaptique et est cruciale pour une transmission synaptique efficace. Des anomalies génétiques conduisant à la diminution de la protéine SHANK3 sont impliquées dans plusieurs maladies psychiatriques, incluant des formes génétiques de troubles du spectre autistique ainsi que la schizophrénie. Les mutations étant hétérozygotes, il serait théoriquement possible d’augmenter l’expression de la protéine SHANK3 en augmentant la transcription de l’allèle sain par des traitements chimiques. Cependant, la régulation transcriptionnelle du gène SHANK3 est très peu connue dans les neurones humains par manque de modèles cellulaires pertinents. L’objectif de mon travail de thèse a été de tirer avantage des propriétés d’autorenouvellement et de pluripotence des cellules souches pluripotentes humaines (Human Pluripotent Stem Cells, hPSC) pour produire une grande quantité de neurones humains glutamatergiques in vitro puis de les utiliser comme ressource cellulaire pour développer une technique de criblage à haut débit afin d’identifier des modulateurs de la transcription du gène SHANK3. Résultats : Des précurseurs neuronaux ont été dérivés à partir d’une lignée de cellules souches embryonnaires humaines (SA001, 46 XY, Cellartis, Suède) puis différenciés pendant 14 jours, dans des plaques 384 puits, afin d’obtenir une population composée d’au moins 70 % de neurones corticaux glutamatergiques. Une méthode à haut débit automatisée et miniaturisée basée sur la technique FastLane (Qiagen) a été développée pour extraire les ARNm directement à partir des plaques 384 puits. Les variations d’ARNm de SHANK3 induites par les différents traitements ont ensuite été quantifiées par qPCR Taqman en duplex, en normalisant avec le gène de ménage Cyclophiline A, et en rapportant aux niveaux d’ARNm de neurones non traités (Méthode de 2-ΔΔCt). Un criblage sur 205 composés, incluant des inhibiteurs de kinase, des régulateurs épigénétiques et des médicaments repositionnables, a été réalisé et 28 hits augmentant de plus de 30 % l’ARNm de SHANK3 ont été découverts. Seize composés ont été confirmés par des expériences de dose réponses sur l’ARNm de SHANK3. Des expériences d’immunofluorescence par imagerie à haut contenu ont confirmées que 4 composés augmentaient de façon significative les niveaux de la protéine SHANK3 dans le réseau neuritique, incluant des inhibiteurs de la kinase cycline dépendante 5 (Cdk5) avec la roscovitine et le lithium (régulateur d’humeur), l’antiépileptique acide valproïque et l’antipsychotique fluoxétine. Des mesures fonctionnelles de flux calcique ont validé l’effet du lithium et de l’acide valproïque sur la force synaptique glutamatergique. Enfin, le potentiel de ces composés a également été exploré sur des neurones différenciés à partir de cellules souches induites à la pluripotence (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC) d’individus autistes portant une mutation sur le gène SHANK3. Conclusion : Cette étude démontre qu’il est possible d’identifier des voies de régulation de protéines clés synaptiques, comme SHANK3, par méthode de criblage à haut débit en utilisant des neurones humains dérivés d’hPSC, incluant des neurones représentatifs d’individus autistes avec la technologie iPSC. Cette nouvelle approche devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsable de l’autisme et la découverte de nouveaux composés thérapeutiques, personnalisables à de sous-groupes de sujets autistes classifiés en fonction du gène ou de la voie de signalisation à corriger plutôt qu’en fonction de leurs symptômes cliniques hétérogènes. / Aims: The SHANK3 gene codes for a scaffold protein located in synapses of glutamatergic neurons. It plays a crucial role in the postsynaptic density assembly and in controlling glutamatergic synaptic transmission. Genetic anomalies leading to a decrease in SHANK3 protein expression are implicated in several psychiatric conditions, including genetic forms of autism spectrum disorders and schizophrenia. Mutations being heterozygous, treatments that increase SHANK3 protein through transcriptional regulation may be therapeutically useful. However, little is known about SHANK3 gene transcriptional regulation in human neurons because of the lack of a relevant cellular model. Here I took advantage of the self-renewing and pluripotency properties of human pluripotent stem cells (hPSC) to produce a large amount of human glutamatergic neurons in vitro and use them as a cellular resource to develop a large-scale screening strategy to identify SHANK3 gene transcription modulators. Results: Neuronal precursors were differentiated from one human embryonic stem cell line (SA001, 46 XY, Cellartis, Sweden). Cultures containing more than 70% of neurons with a cortical glutamatergic phenotype were reproducibly obtained in 384-well plates upon 14 days of precursor differentiation. Automated and high-throughput mRNA extraction was performed using Fastlane technology (Qiagen) in 384-well plates. SHANK3 mRNA levels were quantified using duplex Taqman qPCR, normalized to Cyclophilin A mRNA levels, then to SHANK3 mRNA levels of vehicle-treated cells in order to determine SHANK3 mRNA variations induced by the compound treatment (2-ΔΔCt method). A screening assay was conducted on 205 compounds, including kinase inhibitors, epigenetic regulators and repositionable marketed drugs, and 28 compounds successfully passed the hit selection criteria yielding SHANK3 mRNA increases of at least 30% from mean control values with a statistical cut-off of 2 standard deviation. Sixteen compounds were confirmed by dose-response experiments on SHANK3 mRNA. Further immunofluorescence studies using high content imaging confirmed that 4 compounds increased levels of SHANK3 protein in the neuritic network. Thus, this screening identified as SHANK3 regulators 2 Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) inhibitors the lead molecule, roscovitine and the mood regulator, lithium; the antiepileptic drug valproïc acid and the antipsychotic fluoxetine. In addition, functional calcium flux experiments validated lithium and valproïc acid effect on glutamatergic synaptic strength. Finally, the compounds were also tested on neurons differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSC) of autistic patients bearing SHANK3 mutation. Conclusion: This study demonstrates that cellular pathways regulating a key synaptic protein, SHANK3, can be explored on a large scale using hPSC-derived neurons, including autistic individuals neurons using iPSC technology. This approach should help improving knowledge of the molecular mechanisms responsible of autism and promote the discovery of new therapeutic compounds, personalized to autistic subgroups of individuals stratified according to gene or pathway dysfunction rather than according to clinical heterogeneous symptoms.

.Les récepteurs AMPA, NMDA et mGluR5 sont responsables de la majeure partie des courants excitateurs dans la transmission synaptique glutamatergique. Le contrôle de la dynamique et de l’organisation de ces récepteurs dans la synapse, via une combinaison de diffusion latérale et d’endo/exocytose, est essentiel à la régulation de l’intensité de la transmission synaptique. Les protéines de la densité post-synaptique, telles que Homer, Shank et GKAP, régulent la diffusion de ces derniers, contrôlent leur nombre et leur organisation à la post-synapse. Mon travail de thèse a consisté à étudier la co-organisation nanoscopique des récepteurs AMPA, NMDA et mGluR5 à la post-synapse. Dans un premier temps, grâce au développement de différents outils méthodologiques, j’ai caractérisé les propriétés individuelles d’organisation et de dynamique des récepteurs glutamatergiques, ainsi que leurs propriétés de co-organisation au sein de la post-synapse. Dans un second temps, j’ai cherché à explorer l’impact d’une modification structurelle de la densité post-synaptique sur leur nano-organisation. L’utilisation d’un modèle de troubles du spectre autistique, basé sur la variation d’expression de la protéine d’échafaudage Shank3, a permis d’étudier la désorganisation fonctionnelle des récepteurs au glutamate induite par une perturbation structurelle de la densité post-synaptique. Mes travaux démontrent une organisation clusterisée des récepteurs AMPA et NMDA à la post-synapse, et une distribution homogène des mGluR5 à leur périphérie. Les nanodomaines des AMPARs et des NMDARs ne sont pas co-localisés mais co-organisés, avec une tendance pour les NMDARs à occuper une place centrale dans la post-synapse. Les propriétés individuelles d’organisation des récepteurs AMPA ne sont pas affectées par une variation d’expression de la protéine Shank3, alors que les NMDARs et les mGluR5 voient leurs pools synaptiques affectés dans ce modèle de troubles du spectre autistique. Ces résultats apportent de nouveaux éléments de compréhension des bases moléculaires de la transmission synaptique glutamatergique en conditions physiologique et pathologique, et proposent une nouvelle vision de l’utilisation du glutamate par les synapses. / AMPA, NMDA and mGluR5 receptors are responsible of the majority of excitatory currents in glutamatergic synaptic transmission. Controlling the organization and the mobility of these receptors in the synapse, via a combination of lateral diffusion and endo/exocytosis, is essential for the regulation of synaptic transmission intensity. The proteins of the post-synaptic density, such as Homer, Shank and GKAP, regulate the diffusion of these receptors and control their number and organization at the post-synapse. My PhD work consisted of studying the nanoscale organization of AMPA, NMDA and mGluR5 receptors at the post-synapse. As a first step, thanks to the development of different methodological tools, I characterized the organization and dynamic properties of glutamatergic receptors, together with their co-organization within the post-synapse. As a second step, I explored the impact of structural modification of the post-synaptic density on the nano-organization of these receptors. The use of a model of autism spectrum disorder, based on a variation of the scaffold protein Shank3, enabled the study of functional disorganization of glutamate receptors induced by a structural disturbance of the post-synaptic density. This work shows a clustered organization of AMPA and NMDA receptors at the post-synapse, and a homogenous distribution of mGluR5 at their periphery. The AMPARs and NMDARs nanodomains are not co-localized but co-organized, with a tendency for the NMDARs to occupy a central place at the post-synapse. The individual organizational properties of AMPA receptors are not affected by the variation of Shank3 expression, whereas NMDARs and mGluR5 see their synaptic pool affected in this model of autism spectrum disorder. These results provide new evidence on the molecular bases of glutamatergic synaptic transmission in physiological and pathological conditions and propose a new vision of the use of glutamate by synapses.

Le système de l’immunité innée cérébrale module le fonctionnement du cerveau et les processus comportementaux tout au long de la vie d'un individu. Parmi les différents protagonistes de ce système de l'immunité innée cérébrale, les cellules gliales jouent un rôle majeur notamment en régulant la synthèse de facteurs inflammatoires tels que les cytokines. Ces dernières, outre leur rôle dans la coordination de l'action des différents partenaires cellulaires de ce système, modifient l'activité neuronale. Lors d'un épisode inflammatoire, le système de l'immunité innée s'active et l'ensemble des signaux mis en place par les processus immunitaires est regroupé sous le terme de neuroinflammation. Plus particulièrement, les cytokines proinflammatoires et l’ATP libérés dans ce cadre ont été décrits comme étant capables de moduler la plasticité synaptique d'une part et les capacités d’apprentissages et de mémorisation d'autre part. Cependant, la compréhension de l’impact d’un épisode inflammatoire sur le système nerveux central et les capacités d’apprentissage n’est pas totale. Une cible potentielle de ces facteurs est le système de neurotransmission glutamatergique. En effet, les facteurs proinflammatoires peuvent augmenter ou diminuer l’expression ou l’activité de certaines sous-unités des récepteurs glutamatergiques. Mon objectif a été de déterminer dans quelle mesure la transmission glutamatergique est altérée en condition neuroinflammatoire et comment cela pouvait induire des altérations des capacités d’apprentissage chez le rongeur. Pour cela nous avons choisi comme tâche comportementale l’aversion gustative conditionnée, dont les mécanismes moléculaires nécessaire à sa mise en place sont connus et reposent sur la transmission glutamatergique dans une structure corticale particulière chez les rongeurs: le cortex insulaire. Notre étude visait à déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels une inflammation localisée à ce cortex peut induire des modifications comportementales et biochimiques. Nous avons pu montrer que l’infusion de lipopolysaccharide, un puissant agent inflammatoire, dans le cortex insulaire induisait une augmentation de l'aversion conditionnée. Ceci était corrélé à une augmentation d’expression des récepteurs AMPA au glutamate dans cette structure, plus particulièrement dans le compartiment synaptique. Nous avons également pu montrer que l’infusion de LPS dans le cortex insulaire induisait la synthèse et la libération de cytokines proinflammatoires localement, sans stimuler le système de l’immunité périphérique. Même si ces cytokines sont connues comme étant des agents modulateurs de la neurotransmission glutamatergique, leur infusion dans le cortex insulaire n’a pas reproduit dans notre cas les effets de l’infusion du LPS. Par contre, nous avons montré que l’ATP était impliqué dans les effets du LPS sur l’apprentissage aversif, puisque le blocage des récepteurs purinergiques dans le cortex insulaire a permis de reverser les effets du LPS sur l’acquisition de l’aversion gustative. En conclusion, nos résultats suggèrent qu'une inflammation localisée dans le cortex insulaire conduit à la libération et à l'action d’ATP sur les cellules gliales et/ou neuronales, aboutissant à une hausse de l’acquisition de l’aversion gustative conditionnée. / The cerebral innate immune system is activated under pathophysiological conditions and can consequently modulate brain functioning and cognitive processes. This modulation is exerted by signals produced by immune-like processes grouped under the term of neuroinflammation and involving neuro-glial communication within the brain. In particular, proinflammatory cytokines and ATP, all produced during this immune system activation have been directly linked to modulation of synaptic plasticity and/or learning and memory functions in animals models. However, the cellular mechanisms by which neuroinflammation modulates neural plasticity and cognitive processes are still unclear. One candidate is the glutamatergic system. Indeed, pro-inflammatory factors can increase or decrease glutamatergic receptors expression and/or activity. Our study was dedicated at deciphering to what extent glutamatergic transmission is altered under neuroinflammation and how this may lead to learning and memory alteration. To this aim, we used the conditioned taste aversion, a task highly dependent on glutamatergic transmission into the insular cortex. Indeed, blockade of NMDA or AMPA receptors in this cortical area before acquisition greatly impairs conditioned taste aversion. The aim of our study was thus to investigate the behavioral and cellular impact of an inflammation restricted to the insular cortex on glutamatergic receptors expression and CTA memory formation. Here we show that a cortical inflammation, induced by LPS infusion into the insular cortex, prior to CTA acquisition enhances the aversion strength presumably through LPS-induced increase of glutamatergic AMPA, but not NMDA, receptor expression/trafficking at the insular synapses. Moreover, we show that ATP release, but not pro-inflammatory cytokines, is responsible for LPS-induced CTA enhancement. In conclusion we propose that inflammation restricted to the insular cortex enhances CTA acquisition through an ATP-dependent mechanism presumably involving an increase of glutamatergic AMPA receptor expression at the neuronal synapses.

La maladie d’Alzheimer (MA) constitue la forme la plus commune de démence associée à une perte de mémoire et caractérisée par l’accumulation de plaques extracellulaires contenant des peptides bêta-amyloïdes (Aβ). Des études ont révélé une perte plus importante de synapses que ne peut l’expliquer la mort neuronale, suggérant qu’un déficit synaptique serait présent dès les stades initiaux de la maladie. Bien que le peptide Aβ fût identifié comme un composé des plaques amyloïdes extracellulaires dans les années 1980, des études plus récentes ont mis en évidence la présence intracellulaire de ce peptide. L’accumulation d’Aβ intracellulaire serait un événement antérieur à la formation des plaques séniles dans la pathogenèse de la MA et corrèlerait mieux avec les perturbations de mémoire et d’apprentissage caractéristiques de cette maladie. De plus, des données mettent en évidence la responsabilité des formes oligomériques solubles d’Aβ (Aβo) dans les évènements précoces de la MA. Ce projet vise à mieux comprendre et caractériser l’impact extracellulaire et intracellulaire des peptides Aβo et le lien fonctionnel de leurs effets sur les mécanismes moléculaires impliqués dans les processus mnésiques affectés dans la maladie d’Alzheimer. Dans ce contexte, il nous a paru essentiel d’étudier l’impact extracellulaire et intracellulaire des oligomères d’Aβ sur la transmission synaptique. Ces travaux ont été effectués sur culture primaire de neurones corticaux et sur tranche de cortex de souris par des méthodes d’électrophysiologie via la technique de patch-clamp.Nous avons analysé la fréquence et l’amplitude des courants post-synaptiques excitateurs spontanés (sEPSC) des principaux récepteurs impliqués dans la transmission glutamatergique et dans les mécanismes moléculaires à la base de la mémoire et de l’apprentissage : les récepteurs AMPA et NMDA. Nos données montrent que les peptides Aβo dans le milieu extracellulaire (eAβo) ou dans le milieu intracellulaire (iAβo), affectent spécifiquement les courants associés à l’activation des récepteurs NMDA au niveau postsynaptique sans altérer les courants AMPA. L’application dans le milieu extracellulaire d’Aβo réduit l’amplitude des courants NMDA. Ce phénomène n’est pas lié à la pénétration du peptide Aβo dans les neurones mais à l’activation par l’Aβo de la voie amyloïdogénique induisant une accumulation intrasynaptique d’Aβo responsable de la réduction des courants NMDA.L’ensemble de ces données suggère que l’Aβo perturbe le processing d’APP menant à une production intracellulaire d’Aβo responsable de la réduction de la transmission glutamatergique NMDA-dépendante. Une étape essentielle afin d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires qui sont à la base des altérations synaptiques glutamatergiques dans la MA est d’approfondir le lien fonctionnel entre les effets extracellulaire et intracellulaire des peptides Aβo. / Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia associated with memory loss and characterized by an accumulation of extracellular plaques composed of amyloid-beta peptides (Aβ). Studies have revealed a greater loss of synapses than the neuronal death can explain, suggesting that a synaptic deficit would be present from the early stages of the disease. Although the Aβ peptide has been identified as a component of the extracellular amyloid plaques in the 1980s, recent studies have highlighted the intracellular presence of this peptide. The intracellular accumulation of Aβ precedes the appearance of amyloid plaques in the pathogenesis of AD and seems to be correlated with the memory and learning troubles, characteristic of this disease. Moreover, some data highlight the responsibility of the soluble oligomeric Aβ form (Aβo) in the early events of AD. This project aims to better understand and characterize the extracellular and intracellular impact of Aβo peptides and the functional link of their effects on the molecular mechanisms involved in memory processes affected in AD. In this context, it was essential to study the extracellular and intracellular impact of Aβ oligomers on synaptic transmission. This work was carried out on cultures of primary cortical neurons and mouse cortex slices using electrophysiological methods via the patch-clamp technique.We have recorded the spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSC) frequency and amplitude from the main receptors implicated in the glutamatergic transmission and in the molecular mechanisms underlying memory and learning processes: AMPA and NMDA receptors. Our data show that external or internal application of Aβo peptides affect specifically the currents associated with NMDA receptors at a postsynaptic level without altering the AMPA currents. The external application of Aβo reduces the NMDA current amplitude. This phenomenon is not due to the penetration of the Aβo peptide into the neurons but rather to the activation of the amyloïdogenic pathway by Aβo inducing an intracellular accumulation of Aβo responsible of the NMDA current reduction.All these data suggest that Aβo perturb the processing of APP leading to an intracellular Aβo production responsible of the glutamatergic NMDA-dependent transmission reduction. An essential step in order to improve our understanding of the molecular mechanisms underlying the altered glutamatergic synaptic alterations found in AD is to deepen the functional link between the extracellular and intracellular effects of the Aβo peptides.

Bien que la neurotransmission glutamatergique joue un rôle pivot dans le développement et l’expression de la sensibilisation comportementale aux amphétamines, le rôle spécifique de certaines structures glutamatergiques qui projettent sur l’aire tegmentale ventrale et/ou le noyau accumbens n’est pas encore bien caractérisé. Nous montrons que l’hippocampe dorsal, la partie prélimbique du cortex préfrontal et l’amygdale basolatérale joue un rôle prépondérant dans les réponses locomotrices induites par l’administration aiguë (développement de la sensibilisation) et chronique (expression de la sensibilisation) d’amphétamines, suggérant les réponses locomotrices aux amphétamines impliquent un ensemble de structures glutamatergiques corticolimbiques. Par la suite, nous nous sommes intéressés au rôle de la neurotransmission glutamatergique associée aux récepteurs NMDA dans le noyau accumbens, qui est considéré comme le noyau clé de l’expression de la sensibilisation, sur le développement à court terme de la sensibilisation aux amphétamines. De plus, nous montrons le développement de la sensibilisation à court terme aux amphétamines requiert l’activation concomitante de certains récepteurs NMDA au glutamate et nicotiniques à l’acétylcholine dans le noyau accumbens. De plus, l’activation concomitante de ces récepteurs sous tend également la libération de dopamine induite par les amphétamines dans le noyau accumbens. L’ensemble de ces données montre que la neurotransmission glutamatergique, et les structures glutamatergiques qui projettent sur l’aire tegmentale ventrale et/ou le noyau accumbens, joue un rôle majeur dans la sensibilisation comportementale à court terme aux amphétamines. / Although it is well admitted that the glutamatergic neurotransmission plays a pivotal role in the development and expression of behavioral sensitization to amphetamine, the specific role of glutamatergic structures that project to the ventral tegmental and/or the nucleus accumbens is less well studied. We showed that the dorsal hippocampus, the prelimbic part of the prefrontal cortex and the basolateral amygdala play a critical role in both acute (development of sensitization) and chronic (expression of sensitization) locomotor responses induced by amphetamine, suggesting that behavioral responses to amphetamine are mediated by circuitry of corticolimbic glutamatergic structures. Next, we investigated the role of glutamatergic NMDA receptors contained in the nucleus accumbens, which is seen as the key structure for the expression of sensitization, in the development of short term sensitization to amphetamine. Interestingly, we showed that, contrasting with the current dichotomous thinking that has attributed specialized functions to the ventral tegmental area and the nucleus accumbens, respectively in the development and the expression of behavioral sensitization, concomitant activation of certain types of NMDA and nicotinic receptors in the nucleus accumbens is also required for the development of short term sensitization. Furthermore, we showed that concomitant activation of these receptors sustained the amphetamine-induced dopamine release in the nucleus accumbens. All these data show that glutamatergic neurotransmission, and glutamatergic structures which project onto mésoaccumbens system, plays a major role in short-term behavioral sensitization to amphetamine.

Les neurones pyramidaux de la région CA3 de l'hippocampe présentent une diversité morphologique, physiologique, biochimique, mais aussi fonctionnelle. Une partie des caractéristiques des neurones étant acquise pendant le développement, nous avons formulé l'hypothèse que la diversité morpho-fonctionnelle des neurones pyramidaux serait déterminée aux stades embryonnaires. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé des souris transgéniques pour lesquelles l'expression d'un marqueur fluorescent (GFP) est conditionnée par la date de neurogenèse des neurones glutamatergiques. Nous avons enregistré l'activité des neurones en imagerie calcique et montré que les neurones pyramidaux nés le plus tôt déchargent pendant la phase d'initiation des activités épileptiformes générées par le blocage pharmacologique de la transmission GABAergique rapide. De plus, nous montrons que ces neurones précoces possèdent des propriétés morpho-physiologiques distinctes. Enfin, nous montrons que la stimulation de neurones pyramidaux nés tôt peut générer des activités épileptiformes à des stades immatures lorsqu'ils sont stimulés en groupe, et à des stades juvéniles lorsqu'ils sont stimulés individuellement. Ainsi nous démontrons qu'il existe un lien entre la date de neurogenèse et les propriétés morpho-fonctionnelles des neurones pyramidaux de CA3. / There is increasing evidence that CA3 pyramidal cells are biochemically, electrophysiologically, morphologically and functionally diverse. As most of these properties are acquired during development, we hypothesized that the heterogeneity of the morphofunctionnal properties of pyramidal cells could be determined at the early stages of life. To test this hypothesis, we used a transgenic mouse line in which we glutamatergic cells are labelled with GFP according to their birth date. Using calcium imaging, we recorded multineuron activity in hippocampal slices and show that early generated pyramidal neurons fire during the build-up phase of epileptiform activities generated in the absence of fast GABAergic transmission. Moreover, we show that early generated pyramidal neurons display distinct morpho-physiological properties. Finally, we demonstrate that early generated neurons can generate epileptiform activities when stimulated as assemblies at immature stages, and when stimulated individually at juvenile stages. Thus we suggest a link between the date of birth and the morpho-functional properties of CA3 pyramidal neurons.

Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) affectent un individu sur 100 en France et sont caractérisés par des déficits de la communication et des interactions sociales ainsi que par la présence d’intérêts restreints et de comportements répétitifs. Le laboratoire a démontré l’implication de protéines synaptiques dans le développement des TSA et en particulier celle des protéines SHANK. Ces protéines sont des protéines d’échafaudage présentes au niveau de la densité post-synaptique (PSD) des neurones glutamatergiques et interagissant avec différents partenaires. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine SHANK3. Des mutations au sein du gène SHANK3 ont été détectées chez environ 1 à 2% des patients, selon le degré de sévérité du retard mental. Un déficit de SHANK3 altère le fonctionnement synaptique. En effet, des analyses sur modèles de souris invalidées pour le gène SHANK3 ont montré une diminution de la densité des épines dendritiques, de la taille de la densité post-synaptique et de l’expression des partenaires protéiques de SHANK3. Mon modèle principal d’analyse a consisté en la reprogrammation de fibroblastes en cellules pluripotentes induites (iPSC « induced pluripotent stem cells »). Les iPSCs ont ensuite été sélectivement dérivées en neurones corticaux. Nos études se sont focalisées sur l’analyse des conséquences fonctionnelles de mutations de novo du gène SHANK3 retrouvées chez 4 patients à l’état hétérozygote et présentes au sein de l’exon 21. Ces mutations conduisent à un codon stop prématuré. En parallèle, nous avons obtenu des cellules de 4 individus témoins ne présentant aucun trouble psychiatrique identifié. L’analyse a porté d’une part sur des aspects morphologiques et d’autre part sur des aspects fonctionnels. Nous avons étudié l’effet des mutations sur la maturation et les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques. Nous avons établi un protocole permettant une analyse détaillée de la morphologie en 3D des épines dendritiques et suivi leur maturation. Un résultat majeur est l’observation d’une diminution de la densité des épines sur les dendrites des neurones pyramidaux issus des patients par rapport aux témoins. Comme attendu, la maturation des épines n’est pas complètement achevée mais varie peu dans son évolution d’un individu à l’autre (témoins vs. patients). Nous avons poursuivi ces études par deux approches fonctionnelles : l’imagerie calcique et des études d’électrophysiologie. Les données électrophysiologiques sont en cours d’analyse. En conclusion, nous avons pu obtenir des cultures de neurones corticaux glutamatergiques et les maintenir en culture durant 40 jours pour effectuer différentes analyses à un stade de maturation suffisant pour la mise en évidence de phénotypes morphologiques et fonctionnels. Nous avons principalement observé une diminution de des densités synaptiques et de maturation des épines dendritiques au sein des neurones issus de patients liée à des altérations d’oscillations calciques spontanées. / Autism Spectrum Disorders (ASD) is a neurodevelopmental disorder affecting 1% of population ; characterised by impairments in social interaction and reciprocal communication as well as repetitive and stereotyped behaviors. The work of the laboratory lead to the identification of several genes associated with ASD, among which genes of the synaptic pathway such as SHANK. The SHANK proteins are scaffolding proteins of the post-synaptic density (PSD) of glutamatergic neurons and interact with several partners. In my thesis project, we were particularly interested in SHANK3 mutations. First, Shank3 mutations represent up to 2.12% of ASD cases with moderate to high ID. A SHANK3 deficit leads to the alteration of the synaptic functioning. Indeed, studies of mice KO for SHANK3 gene showed a decrease of the dendritic spines density, of the PSD size and of the expression of SHANK3 partners. My principal model of analysis consisted in the reprogrammation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSCs). Then, the iPSCs were selectively derived into cortical neurons. Our studies were focus on the analysis of functional consequences of SHANK3 de novo mutations found within 4 patients. These mutations are heterozygous and within the exon 21. They result in a premature stop codon. In parallel, we obtained cells from 4 healthy individuals. The work was about the morphological and functional aspects. We analysed the mutations effects on the maturation and morphological caracteristics of the dendritic spines. We finalized a protocol that enabled a detailed analysis of the spine dendritic 3D morphology and their maturation follow-up. A important result was the observation of a decrease of the spine density on pyramidal neurons dendrites from patients compared to those from controls. Moreover, spines maturation was not fully accomplished but was not much different in its evolution between individuals (controls vs patients). Then, we used two functional skills : calcium imaging and electrophysiological experiments. The electrophysiological data are in progress. To conclude, we succeeded in the obtention of glutamatergic cortical neurons and to maintain them in culture during 40 days in order to realize some analysis at a sufficient maturation stage to observe morphological and functional phenotypes. We mainly observed a decrease of the dendritic spines density and maturation for the neurons from patients, with alterations of the spontaneous calcium oscillations.

La moelle épinière assure la transmission des messages nerveux entre l’encéphale et le reste du corps et assure la coordination des mouvements rythmiques de la locomotion. Elle est constituée d’un grand nombre de types différents d’interneurones et de neurones moteurs, organisés en circuits neuronaux. Les circuits impliqués dans la transmission des informations sensorielles et dans les mouvements des membres sont localisés respectivement dans les parties dorsale et ventrale de la moelle épinière. Les mécanismes moléculaires contrôlant la spécification de ces différents types de neurones dans la moelle épinière restent actuellement mal connus. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à la famille des gènes Prdm (PR Domain containing methyltransferase). Ces gènes sont conservés évolutivement. Ils codent pour des facteurs de transcription jouant des rôles importants dans le développement embryonnaire et sont fréquemment impliqués dans des maladies chez l’Homme. Ces facteurs sont caractérisés par la présence d’un domaine PR semblable au domaine SET trouvé dans des protéines à activité histone méthyltransférase et d’un nombre variable de doigts à zinc. Je me suis focalisée essentiellement sur les gènes Prdm12 et Prdm13, des gènes exprimés de manière précoce et localisés dans le système nerveux en développement et dont la fonction était totalement inconnue. Nos résultats ont montré que l’expression de Prdm12 dans la partie ventrale de la moelle épinière est dépendante de l’acide rétinoïque et du facteur de transcription Pax6 et que Prdm12 est restreint au domaine p1 via l’action répressive des facteurs de transcription Dbx1 et Nkx6 exprimés dans les domaines de progéniteurs adjacents. Prdm12 fonctionne comme déterminant de la destinée des interneurones V1, des interneurones impliqués dans le contrôle des mouvements de la locomotion et essentiels à la survie des neurones moteurs. Prdm12 agirait en réprimant, probablement directement, l’expression des gènes Dbx1 et Nkx6.1/2, ses domaines PR et ZnF étant tous deux requis pour son activité. Nos données indiquent aussi que Prdm13, qui est exprimé dans la partie dorsale de la moelle épinière, constitue une cible directe du complexe Ptf1a-Rbpj et qu’il est requis en aval de Ptf1a pour une balance correcte des neurones glutamatergiques et GABAergiques. Elles suggèrent que Prdm13 fonctionnerait, au moins en partie, en bloquant l’activité d’autres facteurs proneuraux tels que Ngn2 (Neurog2) ou Ascl1 (Mash1) présents dans la partie dorsale de la moelle épinière et qui induisent une destinée excitatrice glutamatergique. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’objectif premier de notre projet était d’établir un modèle animal de douleur chronique orofaciale, lequel pourrait imiter la sensibilité retrouvée chez les patients souffrant de douleur orofaciale myalgique. Nous avons procédé à des injections intramusculaires de saline acide (2 injections à 2 jours d’intervalle pH 4.0) pour induire une sensibilisation mécanique des mucles massétérins. La réponse nocifensive a été mesurée à l’aide de filaments de von Frey avant et après ces injections dans des rats Sprague-Dawley. Par la suite, le potentiel analgésique de différents antagonistes des récepteurs glutamatergiques fût évalué par l’injection intramusculaire de ces antagonistes à différents moments. Nos résultats suggèrent que deux injections de saline acide, produisent une hypersensibilité mécanique signalée par l’augmentation du nombre de réponses à l’application de filaments de von Frey. Cet effet dure plusieurs semaines et est bilatéral, même lorsque les injections sont unilatérales, indiquant qu’une composante centrale est forcément impliquée. Toutefois, une composante périphérique impliquant les récepteurs glutamatergiques semble présider le tout puisque les antagonistes glutamatergiques, appliqués de façon préventive empêchent le développement de l’hypersensibilité. Cependant, le maintien de cette hypersensibilité doit dépendre de mécanismes centraux puisque l’application d’antagonistes une fois la sensibilisation induite, ne diminue en rien le nombre de réponses obtenues. Ce modèle semble approprié pour reproduire une hypersensibilité musculaire durable de bas niveau. Nos données indiquent que les récepteurs glutamatergiques périphériques participent à l’induction de cette hypersensibilité de longue durée. Nous croyons que ce modèle pourra éventuellement contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine des myalgies faciales persistantes. / The first objective of this project was to establish an animal model of chronic orofacial pain, which could mimic symptoms of patients suffering from orofacial myalgia. We used acidic saline injections (2 injections, 2 days apart at pH 4.0) in masseteric muscles to induce mechanical hypersensitivity. Nocifensive behavior was measured before and after the injections using von Frey filaments in male Sprague Dawley rats. Later, the potential analgesic effect of glutamate receptors antagonists was measured by intramuscular administration of these antagonists at different times. Our results suggest that two injections of acidic saline produce a mechanical hypersensitivity as reflected by the increased number of responses to applications of von Frey filaments. This effect lasts several weeks and is bilateral, even when the injections are unilateral, indicating that a central component must be involved. However, the initial stage of induction of this hypersensitivity involves peripheral glutamate receptors since injection of their antagonists before the second acidic saline injection prevents development of the nocifensive response, whereas their injection at later times is ineffective in blocking development of the response. This model based on a double injection of acidic saline seems appropriate to reproduce low intensity, long-lasting muscle pain. Our data suggests that peripheral glutamate receptors are involved in the induction of this long-term hypersensitivity. We believe that this model may contribute to a better understanding of the mechanisms behind persistent orofacial muscle pain.

L’objectif premier de notre projet était d’établir un modèle animal de douleur chronique orofaciale, lequel pourrait imiter la sensibilité retrouvée chez les patients souffrant de douleur orofaciale myalgique. Nous avons procédé à des injections intramusculaires de saline acide (2 injections à 2 jours d’intervalle pH 4.0) pour induire une sensibilisation mécanique des mucles massétérins. La réponse nocifensive a été mesurée à l’aide de filaments de von Frey avant et après ces injections dans des rats Sprague-Dawley. Par la suite, le potentiel analgésique de différents antagonistes des récepteurs glutamatergiques fût évalué par l’injection intramusculaire de ces antagonistes à différents moments. Nos résultats suggèrent que deux injections de saline acide, produisent une hypersensibilité mécanique signalée par l’augmentation du nombre de réponses à l’application de filaments de von Frey. Cet effet dure plusieurs semaines et est bilatéral, même lorsque les injections sont unilatérales, indiquant qu’une composante centrale est forcément impliquée. Toutefois, une composante périphérique impliquant les récepteurs glutamatergiques semble présider le tout puisque les antagonistes glutamatergiques, appliqués de façon préventive empêchent le développement de l’hypersensibilité. Cependant, le maintien de cette hypersensibilité doit dépendre de mécanismes centraux puisque l’application d’antagonistes une fois la sensibilisation induite, ne diminue en rien le nombre de réponses obtenues. Ce modèle semble approprié pour reproduire une hypersensibilité musculaire durable de bas niveau. Nos données indiquent que les récepteurs glutamatergiques périphériques participent à l’induction de cette hypersensibilité de longue durée. Nous croyons que ce modèle pourra éventuellement contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine des myalgies faciales persistantes. / The first objective of this project was to establish an animal model of chronic orofacial pain, which could mimic symptoms of patients suffering from orofacial myalgia. We used acidic saline injections (2 injections, 2 days apart at pH 4.0) in masseteric muscles to induce mechanical hypersensitivity. Nocifensive behavior was measured before and after the injections using von Frey filaments in male Sprague Dawley rats. Later, the potential analgesic effect of glutamate receptors antagonists was measured by intramuscular administration of these antagonists at different times. Our results suggest that two injections of acidic saline produce a mechanical hypersensitivity as reflected by the increased number of responses to applications of von Frey filaments. This effect lasts several weeks and is bilateral, even when the injections are unilateral, indicating that a central component must be involved. However, the initial stage of induction of this hypersensitivity involves peripheral glutamate receptors since injection of their antagonists before the second acidic saline injection prevents development of the nocifensive response, whereas their injection at later times is ineffective in blocking development of the response. This model based on a double injection of acidic saline seems appropriate to reproduce low intensity, long-lasting muscle pain. Our data suggests that peripheral glutamate receptors are involved in the induction of this long-term hypersensitivity. We believe that this model may contribute to a better understanding of the mechanisms behind persistent orofacial muscle pain.