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Contrôle des dommages oxydants au noyau spermatique : Apports des modèles murins knock-out pour des glutathion peroxydases

Noblanc, Anaïs 05 July 2013 (has links) (PDF)
Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant et leur mobilité lors de leur transit le long de l'épididyme. Paradoxalement, cette maturation épididymaire nécessite la présence d'espèces oxygénées réactives (EOR) pour condenser la chromatine spermatique afin de mieux protéger l'ADN de ces mêmes molécules. Nous avons étudié la façon dont l'épididyme parvient à assurer l'équilibre entre un déficit et un excès d'EOR en caractérisant le phénotype épididymaire de souris dont la production de deux enzymes antioxydantes glutathion peroxydases a été invalidée, GPx5 et snGPx4. L'épididyme de ces souris génère une réponse antioxydante élevée et augmente l'activité de pontage disulfure sur les gamètes en modulant l'expression génique d'enzymes antioxydantes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) et de protéines disulfide isomérases (Pdia). Bien que ce sursaut d'activité soit efficace pour protéger les membranes du tissu et des spermatozoïdes, la chromatine des spermatozoïdes présente un défaut de condensation, laissant l'ADN spermatique vulnérable face aux EOR. Les gamètes présentent alors des dommages oxydants dans le noyau qui s'aggravent avec la diminution de l'activité antioxydante lors du vieillissement. Des approches immunologiques et biochimiques ont montré que les dommages oxydants se produisent préférentiellement sur l'ADN spermatique situé à la périphérie du noyau, qui est enrichi en nucléosomes persistants et qui est associé à la matrice nucléaire. Afin de déterminer s'il est possible de diminuer ces atteintes oxydantes sur les gamètes, nous avons étudié les effets d'une supplémentation orale antioxydante sur des souris sauvages et sur l'un de nos modèles murins mutant.
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Contrôle des dommages oxydants au noyau spermatique : Apports des modèles murins knock-out pour des glutathion peroxydases

Noblanc, Anaïs 05 July 2013 (has links) (PDF)
Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant et leur mobilité lors de leur transit le long de l'épididyme. Paradoxalement, cette maturation épididymaire nécessite la présence d'espèces oxygénées réactives (EOR) pour condenser la chromatine spermatique afin de mieux protéger l'ADN de ces mêmes molécules. Nous avons étudié la façon dont l'épididyme parvient à assurer l'équilibre entre un déficit et un excès d'EOR en caractérisant le phénotype épididymaire de souris dont la production de deux enzymes antioxydantes glutathion peroxydases a été invalidée, GPx5 et snGPx4. L'épididyme de ces souris génère une réponse antioxydante élevée et augmente l'activité de pontage disulfure sur les gamètes en modulant l'expression génique d'enzymes antioxydantes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) et de protéines disulfide isomérases (Pdia). Bien que ce sursaut d'activité soit efficace pour protéger les membranes du tissu et des spermatozoïdes, la chromatine des spermatozoïdes présente un défaut de condensation, laissant l'ADN spermatique vulnérable face aux EOR. Les gamètes présentent alors des dommages oxydants dans le noyau qui s'aggravent avec la diminution de l'activité antioxydante lors du vieillissement. Des approches immunologiques et biochimiques ont montré que les dommages oxydants se produisent préférentiellement sur l'ADN spermatique situé à la périphérie du noyau, qui est enrichi en nucléosomes persistants et qui est associé à la matrice nucléaire. Afin de déterminer s'il est possible de diminuer ces atteintes oxydantes sur les gamètes, nous avons étudié les effets d'une supplémentation orale antioxydante sur des souris sauvages et sur l'un de nos modèles murins mutant.
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Diversité structurale des Glutathion Transférases fongiques des classes Oméga et Xi et identification de leurs ligands par des approches cristallographiques / Structural diversity of fungal Xi and Omega glutathione transferases and identification of their ligands by crystallographic approaches

Schwartz, Mathieu 25 September 2018 (has links)
La détoxication est un processus biochimique présent chez tous les organismes biologiques et qui leur permet d’assurer leur survie face aux xénobiotiques provenant de leur environnement. Les glutathion transférases (GST) représentent une large famille d’enzymes participant à la phase II de détoxication en conjuguant le glutathion au composé à éliminer. Par ailleurs, certaines GST ont un rôle non catalytique et assurent la séquestration ou le transport de molécules d’un compartiment cellulaire à un autre. Alors que l’activité catalytique des GST est étudiée depuis plusieurs décades, l’identification précise des molécules physiologiques ciblées par les GST reste un défi. Chez les organismes fongiques dégradeurs de bois, certaines classes de GST se sont multipliées au niveau génomique. Cette redondance serait le reflet de la diversité des molécules chimiques libérées lors de la dégradation du bois. Dans cette thèse, des approches biochimiques et structurales ont été employées pour caractériser onze isoformes de GST du basidiomycète Trametes versicolor. De plus, une approche utilisant des librairies de molécules a permis d’identifier une famille de ligands reconnus par ces GST : les polyphénols. Les modes d’interaction de ces ligands ont été décrits précisément à partir de la résolution de nombreuses structures cristallographiques. L’identification d’un flavonoïde à partir d’un extrait de bois de merisier (Prunus avium), arbre sur lequel croît T. versicolor, a été permise par une approche de cristallographie d’affinité. Ces données suggèrent que les GST d’organismes fongiques saprotrophes pourraient prendre en charge les polyphénols libérés lors de la décomposition du bois / The ubiquitous biochemical process that enables each organism to cope with xenobiotics from its environment and thus ensures its survival is called detoxification. Glutathione transferases (GSTs) form a large family of enzymes divided into several classes. These enzymes participate in the detoxification phase II by conjugating the tripeptide glutathione to the molecule to be eliminated. Moreover, some GSTs are involved in non-catalytic processes such as sequestration or transport of molecules from one cellular compartment to another. Studies dedicated to the catalytic activity of GSTs have been ongoing for decades, yet precise identification of molecules targeted by GSTs remains challenging. In wood-decaying organisms, some of the GST classes have expanded with an increase of the number of isoforms encoded at the genomic level. This redundancy would reflect the diversity of the small molecules released upon wood enzymatic degradation. Through this thesis work, biochemical and structural approaches were used in order to characterize eleven GST isoforms from the saprotrophic fungus Trametes versicolor. In addition, the use of libraries of molecules helped in identifying polyphenols as a family of ligands that bind these GSTs. The molecular interaction modes were described precisely based on the resolution of numerous crystal structures. The identification of a flavonoid from an extract of the wild-cherry tree (Prunus avium) on which T. versicolor grows, was enabled by using an affinity crystallography approach. These data suggest that fungal GSTs could interact with plant polyphenols released during wood degradation
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Contrôle des dommages oxydants au noyau spermatique : apports des modèles murins knock-out pour des glutathion peroxydases / Control of oxidative damage to the spermatic nucleus : contribution of knock-out mouse models for glutathione peroxidases

Noblanc, Anaïs 05 July 2013 (has links)
Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant et leur mobilité lors de leur transit le long de l’épididyme. Paradoxalement, cette maturation épididymaire nécessite la présence d’espèces oxygénées réactives (EOR) pour condenser la chromatine spermatique afin de mieux protéger l’ADN de ces mêmes molécules. Nous avons étudié la façon dont l’épididyme parvient à assurer l’équilibre entre un déficit et un excès d’EOR en caractérisant le phénotype épididymaire de souris dont la production de deux enzymes antioxydantes glutathion peroxydases a été invalidée, GPx5 et snGPx4. L’épididyme de ces souris génère une réponse antioxydante élevée et augmente l’activité de pontage disulfure sur les gamètes en modulant l’expression génique d’enzymes antioxydantes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) et de protéines disulfide isomérases (Pdia). Bien que ce sursaut d’activité soit efficace pour protéger les membranes du tissu et des spermatozoïdes, la chromatine des spermatozoïdes présente un défaut de condensation, laissant l’ADN spermatique vulnérable face aux EOR. Les gamètes présentent alors des dommages oxydants dans le noyau qui s’aggravent avec la diminution de l’activité antioxydante lors du vieillissement. Des approches immunologiques et biochimiques ont montré que les dommages oxydants se produisent préférentiellement sur l’ADN spermatique situé à la périphérie du noyau, qui est enrichi en nucléosomes persistants et qui est associé à la matrice nucléaire. Afin de déterminer s’il est possible de diminuer ces atteintes oxydantes sur les gamètes, nous avons étudié les effets d’une supplémentation orale antioxydante sur des souris sauvages et sur l’un de nos modèles murins mutant. / The spermatozoa acquire their fertilizing ability and their motility through the epididymis. Paradoxically, this epididymal maturation needs reactive oxygen species (ROS) to condense the sperm chromatin permitting to protect the DNA against these molecules. We studied how the epididymis ensure the equilibrium between deficit and excess of ROS by characterizing the epididymal phenotype of mice lacking two antioxidant activities of the glutathione peroxidase family, GPx5 & snGPx4. The epididymis of these mice produce a strong antioxidant response and also increase the disulfide bridging activity by adjusting the gene expression of antioxidant enzymes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) and disulfide isomerase proteins (Pdia). This protection is efficient for tissue and sperm membranes but not for sperm chromatin which is susceptible to decondensation. The sperm cells show oxidative damage in the nucleus, which worsen with the decrease of the antioxidant activity upon aging. Immunological and biochemical approaches indicated that oxidative damage occurred only on the sperm DNA at the periphery of the nucleus, which is enriched with persisting nucleosomes and associated to the nuclear matrix. Finally, to determine if these oxidative damages on the spermatozoa can be lowered, we studied the effects of an oral antioxidant supplement on wild type and gpx5-/- mice (Chabory et al., 2009).
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Effet du butyrate de sodium dans les lignées du cancer du sein féminin: mécanismes d'action et sensibilisation des cellules par cet inhibiteur des histones désacétylases à la toxicité induite par la doxorubicine et le cisplatine

Louis, Monette 15 December 2004 (has links)
Résumé<p>L’objectif de ce travail a été d’évaluer la toxicité du butyrate de sodium (NaBu), un inhibiteur des<p>histones désacétylases (HDACs), et ses mécanismes d’action sur les cellules de cancer du sein<p>humain, les cellules MCF-7 déficientes pour la caspase-3, et lignées dérivées :les cellules MCF-<p>7/caspase-3, et les cellules VCREMS résistantes à la vincristine, et dans une moindre mesure à la<p>doxorubicine. La contribution de l’apoptose dans la létalité induite par le NaBu a été recherchée<p>dans les cellules MCF-7wt en estimant l’exposition de la phosphatidylsérine ainsi que le clivage de<p>la PARP. La présence de caspase-3, n’a ni amplifié ni accéléré l’apoptose qui a impliqué le<p>rhéostat Bax/Bcl-2 en faveur d’une induction de Bax. La cytostasie du NaBu dans les cellules<p>MCF-7 s’est manifestée par un blocage des cellules en phase G2/M. L’évaluation du niveau<p>d’expression des régulateurs du cycle cellulaire dans les cellules MCF-7wt et MCF-7/caspase-3 a<p>montré une surexpression de p21, de façon indépendante de p53. L’action cytostatique du NaBu<p>a été associée à une accumulation légère et modeste des formes non-phosphorylées de pRB, un<p>facteur dont la phosphorylation par les complexes cycline D/cdk4,6 et cycline E/cdk2 est<p>nécessaire à la transition G1/S. Dans ces conditions, les niveaux de cdk2 et de Cdc25A, une<p>oncoprotéine activatrice de cdk2, sont restés stables. Le NaBu est une molécule à effet<p>pléïotropique, l’utilisation de la trichostatine A, inhibiteur par excellence des HDACs, a permis<p>d’établir la relation de causalité entre l’inhibition des HDACs et la toxicité du NaBu. La plupart<p>des inhibiteurs des HDACs induisent l’apoptose en perturbant le métabolisme oxydatif de la<p>mitochondrie ce qui pourrait modifier le statut redox cellulaire. Nous avons cherché une<p>implication du métabolisme du glutathion (GSH), le thiol anti-oxydant non-protéique majoritaire<p>de la cellule, dans la toxicité induite par le NaBu. Les résultats montrent que le NaBu induit une<p>déplétion du GSH dans les cellules MCF-7wt et dérivées de façon dose-dépendante, corrélée avec<p>la mortalité cellulaire. Devant l’éventualité d’une consommation accrue de GSH par les enzymes<p>associées à son métabolisme, nous avons évalué le niveau des activités des enzymes glutathion<p>peroxydase, glutathion réductase et glutathion S-transférases. Dans les cellules MCF-7, le NaBu a<p>induit de façon significative ces enzymes anti-oxydantes, à l’exception des GSTs, de même que la<p>catalase, une enzyme indépendante de ce système. Les expériences visant à libérer le pool de<p>GSH lié aux protéines ont montré que la déplétion du GSH intracellulaire est parallèle à celle du<p>GSH lié aux protéines. Par conséquent, la consommation du GSH est réellement la cause de la<p>chute du niveau de GSH générant un stress oxydant. La doxorubicine, un inhibiteur des<p>topoisomérases, a une utilisation clinique limitée en raison de ses effets secondaires irréversibles<p>(cardiotoxicité entre autres). Dans le but d’améliorer son efficacité, nous avons expérimenté des<p>combinaisons NaBu/doxorubicine sur les cellules VCREMS et MCF-7, étant donné la capacité<p>du NaBu à induire l’expression des topoisomérases et favoriser la conformation déployée de la<p>chromatine. L’utilisation de la technique isobologramme nous a permis de déterminer les index<p>de combinaison pour une application simultanée ou séquentielle des drogues. Les résultats<p>indiquent que le NaBu sensibilise les cellules VCREMS et MCF-7 à l’action de la doxorubicine.<p>Dans les cellules VCREMS, cet effet s’est produit en dépit de la stimulation des enzymes de<p>détoxication, GSTs et GPX. L’ensemble de ces résultats indique que l’utilisation du NaBu en<p>combinaison avec certains anticancéreux constitue une stratégie très intéressante en<p>cancérothérapie. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Étude des gluthation transférases de la classe Phi du peuplier (Populus trichocarpa) : caractérisation structurale, enzymatique et recherche de molécules cibles / Structural, enzymatic characterization and research of target molecules of the poplar glutathione transferase Phi

Pégeot, Henri 11 December 2015 (has links)
Les glutathion transférases (GSTs) constituent une famille multigénique d’enzymes présentes dans les trois domaines du vivant. Cette présence ubiquitaire souligne l’origine sans doute très ancienne de ces enzymes ainsi que des fonctions fondamentales conservées au cours de l’évolution. Ces enzymes sont impliquées notamment dans la détoxication cellulaire de molécules toxiques et dans le métabolisme secondaire. Les analyses phylogénétiques regroupent les GSTs des organismes photosynthétiques au sein de quatorze classes qui peuvent être séparées en deux grands groupes selon le résidu catalytique : les GSTs à sérine catalytique qui possèdent des activités de conjugaison du glutathion (GSH) et/ou peroxydase tandis que les GSTs à cystéine catalytique présentent des activités thioltransférase, déshydroascorbate réductase et de déglutathionylation. Les GSTs à sérine catalytique de la classe Phi (GSTF) sont présentes chez les organismes photosynthétiques et certains basidiomycètes. Chez les plantes, cette classe comprend un nombre de gènes plus important que les autres classes de GSTs. Ceux-ci sont parmi les plus régulés en réponse à divers stress et ils ont été fortement étudiés chez les plantes céréalières en raison de l’activité de détoxication des herbicides des protéines correspondantes. Pourtant, à quelques exceptions près, les rôles physiologiques des GSTFs restent inconnus et la redondance d’isoformes dans cette classe reste incomprise. Par des approches moléculaires, biochimiques et structurales, l’analyse structure-fonction des huit GSTFs de l’arbre modèle Populus trichocarpa a été réalisée au cours de cette thèse. L’analyse phylogénétique des GSTFs chez les organismes photosynthétiques a montré que cette classe est apparue au moment de l’apparition terrestre des végétaux et que différents groupes pouvaient être identifiés avec des motifs catalytiques distincts. L’analyse transcriptionnelle a montré que les gènes relatifs aux GSTFs de peuplier sont principalement exprimés dans les fleurs femelles, les pétioles et les fruits. Certains aspects du mécanisme réactionnel ont été caractérisés en déterminant notamment les paramètres cinétiques et d’interaction des huit GSTFs et de plusieurs variants mutés pour des résidus clés vis-à-vis de substrats modèles. Les structures de cinq des huit GSTFs ont été résolues et ces protéines dimériques adoptent un repliement GST canonique et des spécificités structurales au niveau du site actif ont pu être observées. De plus, au regard de la capacité des orthologues des GSTFs à lier des hormones et des flavonoïdes ainsi que de l’expression récurrente des GSTFs de peuplier dans les fruits et les fleurs femelles, deux organes riches en ces molécules, il peut être supposé qu’elles ont aussi des propriétés de type ligandine. Des résultats préliminaires ont également été obtenus pour la recherche de substrats physiologiques à partir de métabolites extraits de différents organes de peuplier. A terme, l’identification de ces substrats permettra de déterminer le mode d’action (catalytique vs ligandine) de chaque enzyme et d’identifier clairement les fonctions in planta de ces enzymes / Glutathione transferases (GSTs) belong to a multigenic family whose presence in most eukaryotes, prokaryotes and archaea reflects their widespread nature and very likely important functions. These enzymes represent a major group of enzymes involved in xenobiotic detoxification and secondary metabolism. From the most recent genomic and phylogenetic analyses, the GST family is subdivided into 14 classes that can be separated into two main groups based on the catalytic residue which is either a serine (Ser-GST) or a cysteine (Cys-GST). Ser-GSTs usually catalyze glutathione (GSH) conjugation and/or peroxide reduction. On the other hand, Cys-GSTs cannot perform GSH-conjugation reactions but instead catalyze thiol-transferase, dehydroascorbate reductase and deglutathionylation reactions. Ser-GSTs from the Phi class (GSTF) are present in photosynthetic organisms and some basidiomycetes. This class is composed of a large number of genes compared to other GST classes which are amongst the most stress-inducible. The corresponding proteins have been extensively studied in crops with regard to their detoxification activities toward herbicides. However, with a few exceptions, very little is known about their roles in planta and it is not well understood why this class has expanded. By combining molecular, cellular, biochemical and structural approaches, the eight isoforms from the model tree Populus trichocarpa have been characterized during this PhD project. Phylogenetic analysis of GSTFs in the green lineage shows that the apparition of this class is concomitant with the appearance of terrestrial plants and that different groups can be distinguished based on the active site signature. RT-PCR analysis of the eight isoforms of GSTFs showed that transcripts mostly accumulate in female flowers, petioles and fruits. Some aspects of the reaction mechanism have been characterized by determining kinetic parameters of the eight poplar GSTFs and of several mutated variants for key residues towards model substrates. The structures of five GSTFs have been solved and these dimeric proteins display a typical GST fold but specificities have been observed at the catalytic site level. Moreover, considering the demonstrated capacity of GSTF orthologs to bind hormones, anthocyanins or flavonoids, and the consistent high expression of poplar GSTFs in female flowers and fruits, two organs rich in these molecules, we speculate that they may also possess ligandin properties. Preliminary results have been obtained regarding the nature of the substrates in various poplar organs by analyzing protein thermostability in the presence of putative ligands. In order to assess whether a functional redundancy between poplar Phi GSTs exists and to identify their mode of action (catalytic vs ligandin functions), we started to isolate and identify physiological substrates
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Caractérisation biochimique et fonctionnelle de glutathion-S-transferases (GSTs) chez Phanerochaete chrysosporium / Biochemical and functional characterization of glutathione Stransferases (GSTs) in Phanerochaete chrysosporium

Anak Ngadin, Andrew 25 May 2011 (has links)
Phanerochaete chrysosporium est un champignon ligninolytique largement étudié pour ses capacités à dégrader la lignine et certains xénobiotiques grâce à un important système d'enzymes extracellulaires. Son génome est entièrement séquencé et constitue un inventaire de séquences protéiques prédites qui a permis la description de nombreuses superfamilles de protéines. Parmi elles, les Glutathion S-transférases sont essentiellement impliquées dans le métabolisme secondaire du champignon. Cependant, malgré les nombreux travaux montrant l'implication de ces enzymes dans la réponse aux stress, le développement cellulaire et plus globalement dans certaines fonctions métaboliques, leurs réelles fonctions restent inconnues à cause de leur grande diversité et le manque de données concernant leurs spécificités catalytiques. P. chrysosporium possède 27 isoformes de GSTs qui se regroupent en 7 classes. Parmi elles, 3 sont étendues chez les champignons saprophytes : les classes Omega, Ure2p et ethérase. Deux membres de la classe Omega ont été caractérisés au niveau biochimique et montrent desspécificités de substrat. En effet, PcGTO1 fait partie d'une nouvelle classe appelée S-glutathionyl-phydroquinone reductase, alors que PcGTO3 est plutôt active avec le phenylacetophenone. La structure tridimensionnelle de PcGTO1 suggère que l'enzyme appartient également à une nouvelle classe structurale que nous avons appelée xi. La deuxième classe majoritaire que nous avons étudiée est la classe des Ure2p qui est composée de 9 isoformes et se regroupent en 2 sous-classes. Trois isoformes ont été étudiées au niveau transcriptionnel, biochimique et physiologique. PcUre2p4 et PcUre2p6 appartenant à la première sous-classe sont spécifiquement exprimés dans des cultures fongiques en présence d'hydrocarbures aromatiques polycycliques et l'activité des protéines recombinantes correspondantes est classique des GSTs à savoir le transfert de glutathion sur un substrat hydrophobe. A l'inverse, PcUre2p1 qui appartient à la deuxième sous-classe est exprimé de manière constitutive au niveau transcriptionnel et la protéine présente une activité thiol transférase comparable aux protéines de la classe Omega. Les analyses physiologiques menées grâce à la complémentation de souche déficience de Saccharomyces cerevisiae ont montré que PcUre2p1, PcUre2p4 et PcUre2p6 n'avaient pas la même fonction que l'isoforme de la levure puisqu'aucune complémentation n'a été détectée en ce qui concerne la résistance au stress ou la régulation du métabolisme azoté. Ces résultats suggèrent que leschampignons, en particulier ceux qui présentent des propriétés saprophytes ont développé des spécificités de fonction de leur GSTs probablement en réponse à des contraintes environnementales. / Phanerochaete chrysosporium is a ligninolytic fungus widely studied because of its capacities to degrade wood and xenobiotics through an extracellular enzymatic system. Its genome has been sequenced and has provided researchers with a complete inventory of the predicted proteins produced by this organism. This has allowed the description of many protein superfamilies. Among them, Glutathione S-transferases (GSTs) constitute a complex and widespread superfamily classified as enzymes of secondary metabolism. However, despite the numerous associations of GSTs with stress responses, cell development and metabolism in various organisms, the functions of these enzymes remain usually evasive mainly due to their high diversity and also to the lack of knowledge about their catalytic specificities. In P. chrysosporium 27 GST isoforms have been highlighted and clustered into seven classes. Among them three are extended in saprophytic fungi: the Omega, the Ure2p and the etherase classes. Two members of the Omega class have been characterized at the biochemical level showing difference in substrate specificities. Indeed, PcGTO1 is member of a new class of Sglutathionyl- p-hydroquinone reductase, while PcGTO3 is rather active with phenylacetophenone. The three-dimensional structure of PcGTO1 confirms the hypothesis not only of a new biological class, but also of a new structural class that we propose to name GST xi. The second extended class we have studied is the Ure2p one. It is composed of nine isoforms in P. chrysosporium and clusters into two subclasses. Three Ure2p class members have been studied in more details at transcriptional, biochemical and physiological levels. PcUre2p4 and PcUre2p6 of the first subclass are specifically expressed in cultures treated with polycyclic aromatic hydrocarbons and the recombinant proteins are active as typical glutathione transferases. By contrast, PcUre2p1, which belongs to the second subclass is constitutively expressed whatever the condition tested and is active with small molecules as substrate, such as proteins from the Omega class. Physiological studies have revealed that these proteins do not have the same function than the Saccharomyce cerevisiae isoform, concerning both the response to oxidative stress and its involvement in the nitrogen catabolite repression. These results suggest that fungi, especially those with saprophytic capabilities, have developed specificities of GST function as an adaptation to environmental constraints
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Les glutathion peroxydases et protéine disulfure isomérases de peuplier : potentialités du repliement thiorédoxine pour la catalyse des réactions redox / Biochemical properties of thioredoxin superfamily proteins catalysing versatile redox reactions

Selles, Benjamin 29 June 2011 (has links)
La formation de ponts disulfure constitue une modification post-traductionnelle des protéines importante pour de nombreux processus physiologiques, jouant un rôle particulier dans le repliement, la catalyse et la régulation de leur activité. Ce travail concerne l'étude des relations structure-fonction d'oxydoréductases de peuplier appartenant à deux familles de la superfamille des thiorédoxines, les glutathion peroxydases (Gpxs) et les protéine disulfure isomérases (PDIs).L'étude biochimique fine de la Gpx5 a permis de montrer que cette peroxydase réduit le peroxynitrite, propriété inconnue pour ce type de Gpx et de détailler plusieurs étapes du mécanisme catalytique (formation de l'acide sulfénique, changement structural entre formes réduites et oxydées, régénération par les Trxs). La dimérisation de la Gpx5 n'est pas requise pour son activité mais pourrait jouer un rôle dans la reconnaissance de certains substrats. Enfin, l'inactivation de la cystéine peroxydatique par suroxydation suggère que les Gpxs pourraient également avoir une fonction dans la signalisation en réponse aux peroxydes.Concernant les PDIs, suite à une analyse phylogénétique détaillée amenant à proposer une nouvelle classification en 9 classes chez les organismes photosynthétiques, la caractérisation biochimique de plusieurs isoformes présentant des organisations modulaires distinctes et appartenant à trois classes de PDIs a été entreprise. Aucune activité enzymatique typique n'a été identifiée pour la PDI-A, alors que les PDI-L1a et -M possèdent à la fois une activité oxydase et réductase. Les deux modules a de la PDI-M catalysent des réactions spécifiques, de réduction ou d'oxydation. / Protein activity and folding can be regulated by post-translational modifications that can impact on their physiological functions. One of these is the formation/reduction of disulfide bridges. The aim of the present work is to study the structure-function relationship of protein members of the thioredoxin superfamily, the protein disulfide isomerases (PDI) and the glutathione peroxidases (Gpx).A precise biochemical study has allowed us to demonstrate that this enzyme is an efficient peroxynitrite scavenger, a new finding for this type of protein and allowed investigating several steps of the Gpx5 catalytic mechanism (i.e. sulfenic acid formation, structural changes between reduce dand oxidized forms, Trx-mediated recycling). We also demonstrate that the dimer form of Gpx5 is not absolutely required for peroxide reduction but probably involved in peroxide specificity. Finally, the capability of the peroxidatic cysteine to be overoxidized brings some new clues in favor of an additional signaling function for Gpx5.Concerning PDIs, a detailed phylogenetic analysis of photosynthetic organisms allowed us to identify 9 classes of PDIs and to propose a new nomenclature that fits all these organisms. The biochemical characterization of isoforms of interest has allowed us to highlight some specificity of PDI-L1a and PDI-M in terms of reduction or oxidation reactions catalyzed. A detailed analysis of PDI-M isoform also indicates that the two Trx modules of this protein show differential oxidation or reduction capacities. We could not detect any activity for PDI-A isoforms, leaving us to wonder whether this enzyme is simply active or possesses highly specific protein partners.
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Syntéza core/shell kvantových teček pro diagnostiku / Synthesis of core/shell quantum dots for diagnostics

Mihajlović, Ana January 2014 (has links)
This thesis deals with biosensors based on modified semiconductor core/shell quantum dots (QDs) for diagnosis. The work is divided into four main parts. The first one discusses the theory required for the use of QDs in bioaplications, there are described methods of synthesis, modification, application and bioconjugation of QDs. In the experimental part, CdTe/ZnS QDs with core/shell structure were prepared, in which the core was modified by MPA, GSH and TGA. In the next step, these QDs were further modified using CDI, EDC and NHS as mediators in order to increase affinity to BSA (bovine serum albumine) and IgG (imunoglobuline G). Prepared conjugates were characterized by fluorescence spectroscopy (Infinite M200Pro, Tecan) and capillary electrophoresis (Agilent 7100).
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Syntéza kvantových teček pro detekci proteinů / Synthesis of quantum dots for proteins detection

Šibíková, Anna January 2015 (has links)
This thesis is focused on synthesis of quantum dots (QDs) for protein detection. It comprises three parts. The first part summaries the theory of QDs, their synthesis, functionalization, interactions and applications in medicine. In the second part synthesis of CdTe/ZnS core/shell QDs modified by glutathione (GSH) is described, followed by the conjugation with biomolecules BSA and IgG. Several coupling agents such as EDC with NHS and CDI were used. In the last part, the final products were characterized by fluorescence spectroscopy and capillary electrophoresis. The results show the dependence of the fluorescence intensity of the QDs on pH range, concentration of BSA and IgG concentrations using different crosslinkers.

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