Spelling suggestions: "subject:"proteoglycans""
31 |
Understanding the innovative viral glycosylation machinery using a combination of chemical and structural methodologies / Etude de la machinerie de glycosylation originale des virus géants en combinant la chimie et la biochimie structuraleNotaro, Anna 14 May 2019 (has links)
The sujet de cette these portait sur la caractérisation de la machinerie originale utilisée par les Mimiviridae pour glycosyler les fibrilles entourant leurs capsides en travaillant sur les prototypes des 3 lignées connues, Mimivirus (A), Megavirus chilensis (B) et Moumouvirus australensis (C). Les fibrilles de Mimivirus sont décorées par 2 polysaccharides différents :l’un est caractérisé par la répétition d’un disaccaride linéaire fait de 3)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→, avec un pyruvate branché en position 4,6 du GlcNAc ; l’autre présente une unité répétée branchée de séquence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ pour le squelette linéaire et du rhamnose branché en position 3 par de 2OMeVioNAc. Nous avons suggéré que les fibrilles de Megavirus sont décorées par plus d'une espèce de polysaccharides/oligosaccharides, donc l’un ayant présentant un trisaccharide de RhaNAc:α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. Les fibrilles de Moumouvirus sont décorées de glucosamine, quinovosamine et bacillosamine. A partir de ces données expérimentales il devenait possible de rechercher de nouveaux gènes responsables de ces glycosylations spécifiques. Le cluster de 9 gènes déjà publié de Mimivirus a pu être étendu à 13 gènes. Un cluster de 14 gènes a été d’autre part identifié dans le génome de Moumouvirus, le premier cluster de gènes de la glycosylation identifié dans la lignée B. Parmi les gènes de glycosylation, l’analyse fonctionnelle in vitro de la protéine L142 a permis de démontrer qu’il s’agit d’une N-acétyltransferase. En conclusion, les fibrilles des Mimiviridae sont lourdement glycosylées and le type de sucres et leur organisation dépend de la lignée considérée. / The aim of this thesis is the study of the innovative glycosylation machinery used by the Mimiviridae family for the glycosylation of the fibrils sourrounding their capsid, using Mimivirus, Moumouvirus australensis and Megavirus chilensis as prototypes of lineages A, B and C, respectively. Mimivirus fibrils are decorated with two distinct polysaccharide: one is characterized by a linear disaccharide repeating unit made of 3)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→, with a pyruvic acid branched at position 4,6 of GlcNAc.; the other has a branched repeating unit with the sequence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ in the linear backbone and rhamnose further branched at position 3 by viosamine methylated at position 2 and acetylated at position 4. We suggested that Megavirus chiliensis fibrils are decorated by more than one polysaccharides/oligosaccharide species, one having this trisaccharide: α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. Moumouvirus australensis fibrils are decorated with glucosamine and quinovosamine in addition to the rare sugar, bacillosamine. Starting from this experimental data, it was possible to identify new genes involved in glycosylation. As a result, the published nine-gene cluster of Mimivirus was extended to thirteen genes. A different cluster of fourteen genes was identified in Moumouvirus australensis, representing the first glycosylation gene cluster identified for the B lineage.Among the glycosylation genes, the function of L142 was investigated in vitro, demonstrating that it is an N-acetyltransferase. To conclude, the fibrils of Mimiviridae are heavily glycosylated and the type of sugars and their organization depends on their lineage.
|
32 |
Etude structure-fonction d'une fucosyltransférase (FucTA) de Arabidopsis thaliana.Both, Peter 29 October 2009 (has links) (PDF)
Ce travail cherche à apporter un éclairage sur les relations séquence-structure-fonction des alpha1,3/4-fucosyltransférases, avec un accent particulier sur les core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes. La fucosylation de type Core alpha1,3 est une caractéristique des oligosaccharides N-liés des plantes et invertébrés, avec une fonction biologique qui n'est pas encore élucidée. L'activité Core alpha1,3-fucosyltransférase est responsable d'allergies alimentaires, au pollen, et aux insectes chez l'homme. Dans le cadre de ce travail sont présentés des résultats de caractérisation biochimique (effet de cations divalents sur l'activité, Km de substrat donneur), des expériences de troncation des différents domaines (ex: suppression du domaine C-terminal spécifique aux core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes), et de mutagenèse dirigée, en utilisant comme protéine modèle, la core 1,3-fucosyltransferase A (FucTA) d'Arabidopsis thaliana qui a été exprimée sous forme recombinante chez Pichia pastoris. Ces expériences ont été dictées sur la base de nos résultats d'analyses bioinformatiques des séquences de alpha1,3/4-fucosyltransférases et de la modélisation par homologie du domaine de liaison au nucléotide-sucre de l'enzyme FucTA. La mutagenèse des résidus clé identifiés par cette approche a permis de confirmer l'importance de certains acides aminés dans le mécanisme catalytique. Enfin la protéine FucTA étant elle-même glycosylée quand elle est produite chez P. pastoris, nous avons étudié l'impact de cette glycosylation sur la production et l'activité de la protéine, par des expériences de mutagenèse, de Western blotting et de spectrométrie de masse.
|
33 |
Identification of the role of [methyl]glucuronic acid on arabinogalactan polysaccharides in Arabidopsis thalianaLópez Hernández, Federico January 2018 (has links)
Arabinogalactan proteins (AGPs) are proteoglycans heavily substituted by arabinogalactan polysaccharides. These are composed of arabinose and galactose, and minor sugars such as glucuronic acid (GlcA), fucose and xylose. The arabinogalactan polysaccharides do not decorate classical AGPs exclusively, but they can also be found decorating a wide range of proteins. Arabinogalactan proteins have been implicated in many processes of plant development. Recently, AGPs were proposed to bind and store calcium at the plasma membrane. They are extracellular, and are localised mainly at the plasma membrane via a GPI-anchor. They can also be soluble in the apoplast. Their low abundance, chemical similarity and high functional redundancy have hindered their study. My strategy to overcome these difficulties was to study knock-out Arabidopsis thaliana plants of glycosyltransferases that transfer sugars specifically onto AG-polysaccharides. Glucuronic acid makes up about 10% of the arabinogalactan polysaccharide structure in Arabidopsis thaliana cell culture AGPs. Previously, the glucuronic acid transferase A TGLCA T14A, a member of the CAZy Glycosyl Transferase 14 family, was shown to transfer GlcA specifically onto AGPs, and knock-out Arabidopsis plants showed a 30% reduction in [Me]GlcA substitution in AGP-enriched preparations. However, no clear growth phenotype was observed. The characterisation of knock-out plants of other GT14 family members and combinations thereof is described here. Based on previous studies (Lamport and Várnai, 2013), I assayed in vitro the calcium binding capacity of AGP extracts from WT and knock-out plants. The results showed that AGP extracts from knock-out plants can hold less calcium than WT plants in vitro. A wide range of plant growth phenotypes were identified. Growth phenotypes can be explained by changes in the cytoskeleton and deficiencies in calcium signaling. Our evidence suggests links between structural deficiencies of extracellular proteoglycans to extracellular calcium and cytoskeleton. This research has the potential to create a new model system for the study of molecular mechanisms dependent on calcium that drive cell expansion, division and differentiation in plants.
|
34 |
Využití průtokové cytometrie pro diagnostiku a charakterizaci dědičných poruch glykosylace / Flow cytometry in the diagnostics and characterization of congenital disorders of glycosylationVeselá, Šárka January 2021 (has links)
Congenital disorders of glycosylation (CDG) are rare multisystem metabolic diseases and their number has rapidly grown in recent years. The clinical manifestation includes very broad spectrum of symptoms. In most of all cases CDG are caused by mutations in genes encoding the enzymes of glycosylation pathway. Based on the type of defect, CDG are divided into the following groups: disorders of N-glycosylation or O-glycosylation of proteins, defects in modification of proteins by GPI anchor, disorders of lipid glycosylation and defects that impact multiple glycosylation pathways. The aim of the thesis was to find new biochemical analyses suitable for diagnostics and characterization of CDG patients. The experimental conditions were optimized for selected markers (Sambucus Nigra (SNA) lectin, proaerolysin (FLAER), antibodies to proteins CD55 and CD59) and the staining was applied to cultivated skin fibroblasts from controls and patients diagnosed with CDG by whole-exome sequencing (ATP6AP1-CDG, PIGN-CDG, SLC10A7-CDG, PISD deficiency). The experiments were performed using flow cytometry (FACS) and fluorescent microscopy (FM). The detection of sialylation by SNA lectin and analysis of the mitochondrial membrane potential changes by a fluorescent labelled probe JC-1 with FCCP simulation of mitochondrial...
|
35 |
Utilisation du triflate de fer(III) en glycosylation sous activation micro-ondes ou en flux continu / Glycosylation promoted by iron triflate(III) under microwave irradiation or in continuous flowXolin, Amandine 06 November 2015 (has links)
Les oligosaccharides et les glycoconjugués jouent des rôles essentiels dans de nombreux processus biologiques. Cependant, leur synthèse est plus complexe que la majorité des autres biomolécules. Le principal défi réside souvent dans la formation de la liaison glycosidique. Il est donc toujours nécessaire de développer des réactions de glycosylation efficaces et totalement stéréosélectives, utilisant de nouveaux donneurs et permettant d'accéder à des structures glycosidiques à différentes échelles. Ces réactions sont d'autant plus intéressantes si elles utilisent des promoteurs peu chers, peu toxiques et peu dangereux pour l'environnement, comme des sels de fer. Dans ce cadre, la formation directe de b-glycosides de la N-acétyl-D-glucosamine par catalyse au triflate de fer(III) a été étudiée. Cette glycosylation peut être réalisée sous irradiation micro-ondes ou en flux continu. Les conditions d'activation sous micro-ondes ont ensuite été étendues à la synthèse de motifs de N-glycanes complexes. Cette synthèse consiste en une étape de polyglycosylation au triflate de fer(III), combinée à une étape d'introduction d'un lien moléculaire, via une nouvelle glycosylation ou une réaction de la chimie click. Enfin, une a-mannosylation utilisant le triflate de fer(III) a été découverte et mise au point. Cette glycosylation, réalisée sous activation micro-ondes, est totalement stéréosélective, même en l'absence de groupement participant. / Oligosaccharides and glycoconjugates are involved in numerous biological events. However, their synthesis is generally more complex than for other biomolecules. The main challenge is often the generation of the glycosidic bond. For this reason, it is still important to develop efficient and stereoselective glycosylations, which afford glycosides in significant amounts using new donors. These reactions are even more attractive if the promoter used is cheap, non-toxic and environmentally friendly, like iron salts. In this context, the direct synthesis of b-glycosides of N-acetyl-D-glucosamine using catalytic iron triflate(III) has been developed. This glycosylation can be performed under microwave irradiation or in continuous flow. The microwave-assisted conditions were then extended to the synthesis of complex N-glycan mimics. This synthesis is based on a polyglycosylation reaction using an iron(III) triflate catalysis coupled to another glycosylation or a click reaction to introduce a functionalized linker. Finally, an a-mannosylation promoted by iron(III) triflate has been developed. This glycosylation, performed under microwave irradiation, is completely stereoselective, even without neighbouring group participation.
|
36 |
Marquage métabolique de glycanes : diagnostic et approches thérapeutiques / Metabolic labeling of glycans : diagnostic and therapeutic approachesFourmois, Laura 11 October 2016 (has links)
Cette thèse porte sur la méthode de marquage métabolique de glycanes. Elle consiste à utiliser des monosaccharides modifiés pouvant être métaboliquement introduits sur la membrane externe des cellules. Deux cibles ont été choisies, les bactéries Legionella pneumophila, et des cellules eucaryotes (lignée cellulaire du cancer de la prostate, PC3).Différents analogues saccharidiques ont été synthétisés pour les deux cibles portant différents rapporteurs chimiques, notamment des fonctions azoture, alcyne terminal, alcène terminal, cyclopropène et cétone. Une voie de synthèse commune a été développée mettant en jeu des dérivés d’esters de N-hydrosuccinimide et des dérivés saccharidiques amino, tels que la D-mannosamine, la D-galactosamine et le L-fucose pour les cellules eucaryotes et des analogues d’un précurseur de l’acide légionaminique pour les bactéries Legionella pneumophila.Des essais de marquages métaboliques de glycanes ont été effectués sur Legionella pneumophila. Pour cela, différents dérivés saccharidiques ont été incorporés par les bactéries, puis la révélation des rapporteurs chimiques avec des groupements complémentaires a été évaluée (azoture-cyclooctyne, alcène-tétrazine, cétone-hydrazide/alkoxyamine). La détection a été réalisée soit directement (fluorophore sur le partenaire), soit indirectement (reconnaissance d’un groupement biotine par une streptavidine portant un fluorophore). Les bactéries ont été ensuite observées par microscopie photonique et les observations ont mis en évidence un marquage membranaire.Pour les cellules eucaryotes (PC3), des essais de marquage métabolique ont été effectués afin de vérifier l’incorporation des monosaccharides modifiés via une détection par fluorescence. Une série d’outils portant les fonctions complémentaires aux rapporteurs chimiques, notamment un dérivé de cyclooctyne (TMDIBO) et un dérivé de tétrazine ont été synthétisés. Ils ont été couplés à des dérivés de biotine afin d’obtenir des outils pour la microscopie photonique et à des ARMs (Antibody Recruiting Molecules), tel que le 2,4-dinitrophényle et le rhamnose, en vue d’une potentielle approche thérapeutique. Celle-ci consiste à combiner l’incorporation de monosaccharides modifiés et leur réaction avec un partenaire portant des ARMs, afin de recouvrir la surface des cellules par ces motifs. Les ARMs en présence de sérum humain vont ensuite activer le complément conduisant à la lyse des cellules marquées. Des tests de marquage métabolique ont été réalisés avec les outils couplés aux ARMs et une détection par fluorescence a permis de vérifier la présence des ARMs à la surface des cellules. Des premiers essais ont été effectués avec du sérum humain et des optimisations sont à réaliser.Le marquage métabolique de glycanes est une méthode efficace afin de détecter par fluorescence les bactéries Legionella pneumophila à l’aide d’analogues d’un précurseur de l’acide légionaminique et les cellules eucaryotes PC3 via des dérivés d’autres monosaccharidiques. Le marquage obtenu dans les deux cas est membranaire. Cette méthode permet éventuellement de combiner des aspects d’imagerie ou de diagnostic, avec différentes approches thérapeutiques. / This PhD work focuses on glycans metabolic labeling. This method uses a modified monosaccharides bearing a chemical reporter. The unnatural monosaccharide is metabolically incorporated into glycans. Two targets were selected, Legionella pneumophila bacteria and prostate cancer cells (PC3).Various saccharidic analogs were synthesized carrying several chemical reporters, like azide, terminal alkyne, terminal alkene, cyclopropene and ketone functions. A common synthetic strategy was developed using N-hydrosuccinimide ester derivatives and amino monosaccharides, such as D-mannosamine, D-galactosamine and L-fucose for eukaryotic cells and analogs of a legionaminic acid precursor for Legionella pneumophila bacteria.Differents metabolic labeling of glycans were carried out on Legionella pneumophila. Various sugar derivatives were incorporated by bacteria, then the reporter group was reacted selectively and covalently with a complementary function (azide-cyclooctyne, alkene-tetrazine, ketone-hydrazide/alkoxyamine). Bacteria were visualized with an imaging probes by light microscopy (directly: partner bearing a fluorophore, indirectly: recognition of a biotin group by a fluorescent streptavidin). The results highlighted outer membrane labeling.For eukaryotic cells (PC3), metabolic oligosaccharides engineering has been accomplished to check chemical reporter analogs incorporation via detection with fluorescent probes. A series of tools carrying functions complementary to the chemical reporters was synthesized, such as cyclooctyne derivatives (TMDIBO) and tetrazine derivatives. These derivatives were combined with biotin groups for detecting tools or with Antibody Recruiting Molecules (ARMs), such as 2,4-dinitrophenyl and L-rhamnose, for potential therapeutic approaches. The concept focuses on the combination of metabolic glycan labeling and the activation of human serum complement by ARMs to kill selectively labeled cells. First, ARMs labeled cells was checked by recognition of fluorescent anti-ARMs antibodies. Then, metabolic glycan labeling and human serum complement activation has been evaluated but the complement activation protocols still need to be optimized.Metabolic labeling of glycans is an effective method to detect, by fluorescence, Legionella pneumophila bacteria using analogs of a legionaminic acid precursor and eukaryotic cells (PC3) with monosaccharide derivatives. The labeling was observed on the membrane of the two targets. This method can potentially combine imaging or diagnostic aspects with various therapeutic approaches.
|
37 |
Etude et ingénierie de la N-glycosylation des protéines chez la microalgue verte chlamydomanas reinhardtii. / Titre en anglais non communiquéLucas, Pierre-Louis 11 September 2019 (has links)
Actuellement, plus de 70% des biomédicaments commercialisés sont des glycoprotéines recombinantes. Les coûts élevés de production de ces biomédicaments ont poussé les scientifiques à développer des organismes de production alternatifs. Récemment, les microalgues ont été proposées en tant que potentiel système de production compte-tenu de leur rapidité de croissance et de leurs faibles coûts de production. Cependant, avant de produire des biomédicaments industriels chez les microalgues, il est impératif de s’assurer que les modifications post-traductionnelles, comme la N-glycosylation, soit conservées et compatibles avec une utilisation thérapeutique. Dans ce contexte, l’étude de la Nglycosylation de deux microalgues modèles, Chlamydomonas reinhardtii (microalgue verte) et Phaeodactylum tricornutum (diatomée) a été réalisée. Dans un premier temps, l’ingénierie de la N-glycosylation de C. reinhardtii a été initiée en exprimant une Nacétylglucosaminyltransférase I (GnT I) hétérologue. Les résultats obtenus ont permis de réévaluer les voies de N-glycosylation de C. reinhardtii et de montrer que cette microalgue synthétise une structure glycannique linéaire qui n’est pas substrat de la GnT I. Dans un second temps, un protocole d’extraction et de caractérisation des précurseurs glycanniques de C. reinhardtii et P. tricornutum a été développé et appliqué pour déterminer la structure des précurseurs glycanniques dans ces espèces. Enfin, la caractérisation de deuxxylosyltransférases potentielles (XTA et XTB) de C. reinhardtii a été menée en utilisant des mutants d’insertion et des analyses des N-glycannes par spectrométrie de masse. Cette étude a confirmé les rôles spécifiques de XTA et XTB dans la voie de N-glycosylation de C. reinhardtii. / Currently, more than 70% of the commercialized biopharmaceuticals are glycoproteins. The high production costs lead scientists to develop alternative organisms suitable for such production. Recently, microalgae emerged as a potential interesting production system thanks to their quick growth rate and low production costs. However, prior to start industrial glycoproteins production in microalgae, protein post-translational modifications like Nglycosylation, must be carefully controlled. This PhD thesis focused on the analysis of the Nglycosylation pathway of two different microalgae, Chlamydomonas reinhardtii (greenmicroalgae) and Phaeodactylum tricornutum (diatom). In order to start N-glycan engineering, heterologous N-acetylglucosaminyltransferase I (GnT I) sequences were expressed in C.reinhardtii. This study demonstrated that C. reinhardtii synthetize a linear N-glycan unsuitable for GnT I activity and allows the reinvestigation of the C. reinhardtii N-glycosylation pathway. A second chapter of this work focus on the optimization of a protocol suitable for analyzing the structure of the Dolichol N-linked precursors of C. reinhardtii and P. tricornutum. Lastly, two potential xylosyltransferases (XTA and XTB) from C. reinhardtii were characterized using insertional mutants and N-glycomic analyses by mass spectrometry approaches. This work allows us to propose specific involvement of XTA and XTB in the xylosylation processing of C.reinhardtii N-glycans.
|
38 |
Synthèse d’outils pour le marquage métabolique des glycanes. / Synthesis of tools for the metabolic labeling of glycans.Carlier, Mathieu 22 November 2019 (has links)
Les glycanes sont des biomolécules constituées d’un enchainement de monosaccharides liés entre eux par des liaisons glycosidiques. La nature et l’abondance des monosaccharides constituant la chaine glycanique ainsi que l’agencement des motifs de glycosylation diffèrent fortement en fonction de l’organisme d’origine. La biosynthèse et la dégradation de ces architectures polysaccharidiques sont finement régulées par des systèmes enzymatiques spécifiques et sont organisées au sein des divers compartiments cellulaires. Les glycanes interviennent dans divers processus biologiques : réserves énergétiques, repliement et stabilité protéique, reconnaissance cellulaire et adhésion à la matrice extracellulaire.Cette thèse porte sur la synthèse et l’utilisation de composés permettant le marquage métabolique des glycanes de cellules eucaryotes (lignée cellulaire du cancer de la prostate, PC-3) ou de bactéries didermes à mycomembranes (Corynebacterium glutamicum).Les composés synthétisés ou utilisés dans cette thèse sont des saccharides fonctionnalisés par un groupement bio-orthogonal (groupements azido, alcyne ou méthylcyclopropène) ou des outils de marquage porteurs simultanément d’un groupement bio-orthogonal complémentaire (groupements cyclooctyne ou tétrazine) et d’une étiquette pouvant être détectée par une macromolécule fonctionnalisée par des fluorophores (D-biotine/stréptavidine ou 2,4-DiNitroPhénol/ anticorps anti-DNP). La solubilité, en milieu aqueux, des outils de marquage est un facteur limitant leur utilisation. Une partie des travaux de cette thèse a consisté à développer des outils de marquage plus solubles en milieu aqueux, par l’ajout d’un motif -sulfo--alanine. Ce motif porte une fonction acide sulfonique qui est déprotonée, à pH physiologique, favorisant ainsi la solubilité en milieu aqueux.L’incorporation métabolique des saccharides fonctionnalisés ainsi que la capacité des outils à marquer les cellules (après incorporation métabolique) est évaluée, sur l’un ou l’autre des modèles biologiques, par analyse en cytométrie en flux ou par microscopie confocale. / Glycans are biomolecules made up of a chain of monosaccharides bound together by glycosidic bonds. The nature and abundance ofmonosaccharides forming the glycanic chain and the arrangement of glycosylation patterns differ greatly depending on the organism of origin. The biosynthesis and degradation of these polysaccharide architectures are finely regulated by specific enzymatic systems and are organized within the various cell compartments. Glycans are used in various biological processes: energy reserves, protein folding and stability, cell recognition and adhesion to the extracellular matrix.This thesis focuses on the synthesis and use of compounds allowing the metabolic labeling of glycans of eukaryotic cells (cell line of prostate cancer, PC-3) or of diderm bacteria with mycomembranes (Corynebacterium glutamicum).The compounds synthesized or used in this thesis are saccharides functionalized by a bio-orthogonal groups (azido, alkyne or methylcyclopropene groups) or labeling tools simultaneously carrying a bio-orthogonal complementary function (cyclooctyne or tetrazine groups) and a label that can be detected by a macromolecule functionalized by fluorophores (D-biotin/streptavidine or 2,4-DiNitroPhenol/ anti-DNP antibodies). The solubility of labeling tools in aqueous media is a limiting factor. Part of the work of this thesis has been to develop more water-soluble labeling tools by adding a -sulfo--alanine pattern. This pattern has a sulfonic acid function, which is deprotonated at physiological pH, thus promoting aqueous solubility.The metabolic uptake of functionalized saccharides and the ability of tools to label cells (after metabolic uptake) are evaluated in either biological model, by flow cytometry analysis or confocal microscopy.
|
39 |
Detection of changes in n-glycosylation profiles of therapeutic glycoproteins using LC-MSPlaninc, Ana 19 December 2016 (has links) (PDF)
Biopharmaceuticals are becoming one of the most promising drugs on the market mainly due to their successful treatment of a vast array of serious diseases, such as cancers, immune disorders, and infections. Structurally, biopharmaceuticals are proteins and it is important to mention that more than 60 % of biopharmaceuticals are glycosylated. Glycosylation is one of the most common posttranslational modifications. It is also the most demanding and the most complex posttranslational modification. The research showed that glycosylation can significantly impact on the safety, efficiency, and quality of the therapeutic glycoproteins. In the first part of the introduction of the present thesis, the development of the therapeutic glycoproteins and their classification were reviewed. Glycosylation process and nomenclature were also discussed. The second part of the introduction revealed current issues in the field of the production and the characterization of the therapeutic glycoproteins. In the context of the doctoral thesis, we introduced new approach, namely hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to a high-resolution mass spectrometer (HILIC-HR-MS) combined with Principal Component Analysis (PCA) and classification through Soft Independent Modelling by Class Analogy (SIMCA) data treatment. Accordingly, N-glycans were first enzymatically released using peptide-N-glycosidase F (PNGase F) and reduced using sodium borohydride. Then those N-glycans were separated by HILIC and detected by HR-MS. PCA and SIMCA simplified interpretation of the MS data collected in the huge tables. PCA was applied to test whether it is possible to visualize N-glycosylation differences between samples and to help identifying within which N-glycans changes occurred. SIMCA, which is a more complex data analysis technique, was applied to build and validate a classification models. SIMCA was also applied to verify whether it is possible to use built models to classify real samples. Described approach enabled us to detect small changes in N-glycosylation of the therapeutic glycoproteins (a change of only 1% in relative glycan abundance). It was applied to assess changes in N-glycosylation of therapeutic glycoproteins. Accordingly, we tested N-glycosylation consistency between batches of infliximab, trastuzumab, and bevacizumab and monitored the N-glycosylation of bevacizumab over storage time in plastic syringes.Furthermore, we worked on the faster sample preparation technique, where online-solid-phase extraction (SPE)-LC was combined to the previously mentioned HILIC-MS-PCA/SIMCA method. Online-SPE-LC allowed us to faster the sample preparation in terms of avoiding time-consuming cleaning steps. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished
|
40 |
Thrombosis and Inflammation: A Dynamic Interplay and the Role of Glycosaminoglycans and Activated Protein CKohli, Shrey, Shahzad, Khurrum, Jouppila, Annukka, Holthöfer, Harry, Isermann, Berend, Lassila, Riitta 08 June 2023 (has links)
Hemostasis, thrombosis, and inflammation are tightly interconnected processes which
may give rise to thrombo-inflammation, involved in infectious and non-infectious acute
and chronic diseases, including cardiovascular diseases (CVD). Traditionally, due to
its hemostatic role, blood coagulation is isolated from the inflammation, and its
critical contribution in the progressing CVD is underrated, until the full occlusion of
a critical vessel occurs. Underlying vascular injury exposes extracellular matrix to
deposit platelets and inflammatory cells. Platelets being key effector cells, bridge
all the three key processes (hemostasis, thrombosis, and inflammation) associated
with thrombo-inflammation. Under physiological conditions, platelets remain in an
inert state despite the proximity to the endothelium and other cells which are
decorated with glycosaminoglycan (GAG)-rich glycocalyx (GAGs). A pathological insult
to the endothelium results in an imbalanced blood coagulation system hallmarked
by increased thrombin generation due to losses of anticoagulant and cytoprotective
mechanisms, i.e., the endothelial GAGs enhancing antithrombin, tissue factor pathwayinhibitor
(TFPI) and thrombomodulin-protein C system. Moreover, the loss of GAGs
promotes the release of mediators, such as von Willebrand factor (VWF), platelet
factor 4 (PF4), and P-selectin, both locally on vascular surfaces and to circulation,
further enhancing the adhesion of platelets to the affected sites. Platelet-neutrophil
interaction and formation of neutrophil extracellular traps foster thrombo-inflammatory
mechanisms exacerbating the cardiovascular disease course. Therefore, therapies
which not only target the clotting mechanisms but simultaneously or independently
convey potent cytoprotective effects hemming the inflammatory mechanisms are
expected to provide clinical benefits. In this regard, we review the cytoprotective
protease activated protein C (aPC) and its strong anti-inflammatory effects thereby
preventing the ensuing thrombotic complications in CVD. Furthermore, restoring GAGlike
vasculo-protection, such as providing heparin-proteoglycan mimetics to improve regulation of platelet and coagulation activity and to suppress of endothelial perturbance
and leukocyte-derived pro-inflammatory cytokines, may provide a path to alleviate
thrombo-inflammatory disorders in the future. The vascular tissue-modeled heparin
proteoglycan mimic, antiplatelet and anticoagulant compound (APAC), dual antiplatelet
and anticoagulant, is an injury-targeting and locally acting arterial antithrombotic which
downplays collagen- and thrombin-induced and complement-induced activation and
protects from organ injury.
|
Page generated in 0.0468 seconds