Parasitic protists with modified mitochondria represent important and exciting group of organisms, not only from the view of eukaryotic cell evolution but also because these parasites are causative agents of serious and widespread diseases. The study and understanding of their biology is thus necessary for the development of new antiparasitic drugs. These organisms reside in host body cavities with low concentrations of oxygen and while they lack typical mitochondria, they possess mitochondrion-related organelles which still integrate many physiologically important processes. Trichomonas vaginalis is an anaerobic flagellate inhabiting mucosal surface of vagina. Instead of canonical mitochondria, T. vaginalis possesses organelles termed hydrogenosomes. These organelles harbor pathways of ATP-generating metabolism via substrate-level phosphorylation, dependent on enzymes prone to oxidative damage, such as pyruvate:ferredoxin oxidoreductase and Fe-Fe hydrogenase. Because the environment of trichomonads is not fully anaerobic, the parasite had to develop complex strategies to cope with both oxygen and reactive oxygen species (ROS) generated by host immune system cells. Recent data from T. vaginalis proteomic and genomic analyses revealed the presence of bacterial-type proteins potentially participating...

Die Behandlung von Patienten mit chronischen Schmerzen ist noch immer ein medizinisches Problem hoher Relevanz, da die bisher zur Verfügung stehenden Schmerzmittel nicht optimal für die Therapie chronischer Schmerzen geeignet sind und die Behandlungserfolge in vielen Fällen nicht befriedigend ausfallen. Daher ist die Entwicklung neuer Schmerzmittel speziell für die Behandlung chronischer Schmerzen unumgänglich. Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass die glycinerge Neurotransmission eine entscheidende Rolle bei der Modulation der Schmerzantwort einnimmt und daher ein vielversprechendes Ziel für die Behandlung chronischer Schmerzen darstellt. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten mit GlyT1-Inhibitoren wurde in diesem Projekt N,N-Diethylglycin (DEG), ein Metabolit des Propacetamols, hinsichtlich seines Effektes auf Glycintransporter (GlyTs) und Glycinrezeptoren (GlyRs) untersucht. Sollte DEG die glycinerge Neurotransmission effektiv beeinflussen und anti-allodynische/anti-hyperalgetische Eigenschaften in weiteren Versuchen zeigen, bestünde nicht nur die Möglichkeit der Weiterentwicklung des Propacetamols zur Behandlung chronischer neuropathischer Schmerzen, sondern es würde auch den Ansatz der Veränderung der herkömmlich genutzten Schmerzmittel durch Addition eines Effektors dieser neuen pharmakologischen Behandlungsstrategie bestätigen. In dieser Arbeit wurde die spezifische Wirkung des Propacetamols und seines Metaboliten DEG an GlyTs und GlyRs mittels eines elektrophysiologischen Ansatzes in Xenopus laevis Oozyten untersucht. Es wurde gezeigt, dass der nach Hydrolyse des Propacetamols entstehende aktive Metabolit DEG sowohl auf GlyT1 und GlyT2 substratartig als auch auf den GlyRα1 in partialagonistischer Form wirkt und damit eine Beeinflussung der glycinergen Neurotransmission in vitro möglich ist. In einem Nebenprojekt dieser Arbeit wurden zusätzlich mehrere humane GlyT1 Mutationen funktionell charakterisiert, die bei GlyT1-assoziierten Enzephalopathie Patienten identifiziert wurden und hier als ursächlich für die Erkrankung angesehen werden. Alle untersuchten Mutationen zeigten zumeist eine deutlich verringerte Aktivität, sowohl in ihrer maximalen Transportkapazität als auch Affinität für Glycin. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Mutationen im GlyT1 Gen in der Tat ursächlich für den Krankheitsphänotyp der GlyT1-assoziierten Enzephalopathie sind.:I Vorbemerkung ... 1 II Abstract ... 2 III Abkürzungsverzeichnis ... 3 IV Abbildungsverzeichnis ... 5 1 Einführung ... 6 1.1 Chronischer Schmerz und Schmerztherapie ... 6 1.2 Glycinerge Neurotransmission ... 9 1.3 Beeinflussung glycinerger Neurotransmission und therapeutische Nutzung ... 13 1.4 GlyT1 Enzephalopathie und Pathophysiologie ... 15 1.5 Methodik ... 19 1.6 Fragestellung ... 20 2 Publikation ... 21 3 Zusammenfassung ... 35 4 Literaturverzeichnis ... 39 5 Anhang ... 46 6 Darstellung des eigenen Beitrages ... 49 7 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ... 50 8 Lebenslauf ... 51 9 Danksagung ... 52

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Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob die unterschiedliche Versorgung mit Protein (XP), Threonin (Thr) und Glycin (Gly) bei einer limitierten Threoninversorgung einen Einfluss auf die Threonindehydrogenase-Aktivität (TDG-Aktivität) in der Leber von Küken und Laborratten hat. Dazu wurden 7 Versuche mit federgesexten männlichen Cobb-Küken und weißen Wistar-Ratten in verschiedenen Altersstufen und Lebendmassebereichen durchgeführt: Versuch 1: Küken vom 15. - 25. Lebenstag bei unterschiedlichen Rohproteingehalten. Die kalkulierten XP-Gehalte lagen bei 5,5%; 11,0%; 16,5%; 22,0%; 27,5% und 33,0%. Versuch 2: Küken vom 17. - 30. Lebenstag bei XP-Gehalten von 18,5% und 22,5% mit jeweils 2 Threoninstufen von 0,45% und 0,60% wahr fäcal verdaulichem Threonin. Versuch 3: Küken vom 10. - 20. Lebenstag bei XP-Gehalten von 16,5% und 22,0% und einer Steigerung des Threoningehaltes von 0,65% auf 0,79% Threonin bei 16,5% XP und 0,86% auf 1,05% Threonin bei 22,0% XP. Versuch 4: Küken vom 1. - 49. Lebenstag in Bodenhalten bei praxisnaher Phasenfütterung. Die Prüfung der Leber-Threonindehydrogenase erfolgte am 7., 21., 35. und 49. Lebenstag. Versuch 5: Küken vom 5. - 15. Lebenstag bei einem XP-Gehalt von einheitlich 22,0% und Glycingehalten von 0,64% und 0,98% und wahr fäcal verdaulichen Threoningehalten von 0,45% und 0,60% bei 0,64% bzw. 0,98% Glycingehalt. Die Gly+Ser-Gehalte betrugen insgesamt 1,55% bzw. 1,90%. Versuch 6: Weiße Wistar-Ratten im Lebendmassebereich von 106 - 140 g bei XP-Gehalten von 0%, 6,0%, 12,0%, 18,0% und 24,0%. Vesuch 7: Weiße Wistar-Ratten im Lebendmassebereich von 149 - 167 g und XP-Gehalten von 12,0% und 18,0% mit unterschiedlichen Threoningehalten von 0,28%, 0,42% und 0,72% bei 12,0% XP bzw. 0,42%, 0,52% und 0,72% bei 18,0% XP. Am Ende des jeweiligen Vesuches wurden die Lebern von jeweils 6 Tieren entnommen und für die Bestimmung der TDG-Aktivität in vitro aufbereitet. Die Threoninwirksamkeiten wurden aus N-Bilanzversuchen mit einem exponentiellen N-Verwertungsmodell abgeleitet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Durch die Erhöhung der XP-Gehalte stieg die TDG-Aktivität in der Kükenleber ab 22,0% XP in der Futtermischung trotz limitierter Threoninversorgung signifikant an. Die Threoninwirksamkeit war unverändert bis zu einem XP-Gehalt von 27,5% und fiel bei 33,0% XP signifikant ab. D. h. durch einen verstärkten Abbau von Threonin durch die TDG erfolgte eine Verminderung der Thr-Wirksamkeit bei der Futtermischungen mit hohem XP-Gehalt. 2. Bei einem XP-Gehalt von 18,5% und einem Anstieg der Thr-Konzentration von 0,45% auf 0,60% dThr zeigte sich kein Einfluss auf die TDG-Aktivität in der Kükenleber, wohl aber bei einem XP-Gehalt von 22,5% und einem Gehalt von 0,60% dThr war die TDG-Aktivität in der Kükenleber erhöht. Das könnte den Bereich angeben, in dem Threonin nicht mehr limitierend wirkt. 3. Bei einem Gehalt von 16,5% XP und einem Anstieg der Thr-Konzentration von 0,65% auf 0,79% wurde kein Einfluss auf die TDG-Aktivität in der Kükenleber ermittelt, dagegen stieg die TDG-Aktivität bei einem Gehalt von 22,0% XP und einer Erhöhung des Thr-Gehaltes von 0,86% auf 1,05% signifikant an. 4. Im Verlauf des Phasenfütterungsversuches zeigten sich altersabhängige Veränderungen der TDG-Aktivität, die mit Phasen eines besonders hohen metabolischen Bedarfes an Glycin erklärt weden können. 5. Bei einem XP-Gehalt von 22,0% (Gly + Ser-Gehalt 1,55%) führte die Erhöhung des Thr-Gehaltes von 0,45% auf 0,60% dThr zu einer mehreren Akkumulation von Gly in den Lebermitochondrien, jedoch nicht signifikantem Anstieg der TDG-Aktivität. Bei 1,90% Gly+Ser und 22,0% XP stieg die TDG-Aktivität nach Thr-Zulage signifikant an. Dieser Befund weist auf das Ende des Thr-Limitierungsbereiches hin. 6. Bei Laborratten lag die TDG-Aktivität bei einer proteinfreien Ration am niedrigsten, erhöhte sich bei einer XP-Steigerung bis 12,0% XP, verringerte sich geringfügig bis 18,0% XP und stieg von 18,0% bis 24,0% XP tendenziell an. Insgesamt beeinflusste das XP-Niveau die TDG-Aktivität aber nur zufällig. 7. Der Anstieg des Thr-Gehaltes von 0,28% auf 0,72% bei 12,0% XP bewirkte einen allmählichen Anstieg der TDG-Aktivität in den Rattenlebermitochondrien. Das trifft ebenfalls für die Futtermischung mit 18,0% XP zu, allerdings auf einem etwas höheren Niveau. Die TDG-Aktivität wurde nahezu ausschließlich durch die Aminoacetonakkumulierung moduliert. TDG-Aktivität und Thr-Wirksamkeit zeigten das Ende des Thr-Limitierungsbereiches an. Die in vitro TDG-Aktivitäten der Leber von Küken und Laborratten wird demnach nicht nur durch die Thr-Konzentrationen im Futter sondern auch vom XP-Gehalt und damit dem Angebot anderer Aminosäuren sowie vom Alter beeinflusst. Da offensichtlich Zusammenhänge zur unspezifischen Katabolisierungsrate anderer Aminosäuren bestehen, wird die Interpretation von TDG-Veränderungen (in vitro) erschwert. Bezüge zum Parameter Thr-Wirksamkeit sind mit Einschränkungen deutlich geworden und müssen, bevor quantitative Aussagen möglich sind, weiter erforscht werden.

The fabrication of transient electronic devices based on non-toxic materials is an emerging field, in which the key characteristic is the complete dissolution of the devices within a settled period of time. Usually, these devices are built in polymeric substrates or pure metals; however they show some disadvantages such as low degradation rate. The aim of this work was to investigate the feasibility of electrodeposition of FeMn-based films from green sulfate-based aqueous electrolytes without and with the use of additives toward the possible replacement of the aforementioned materials. The results obtained from the first experiments regarding the electrodeposition of Fe and Mn as single metals allowed the design of the experiment to synthesize FeMn layers. Potentiostatic deposition of metallic Mn layers from environmentally friendly aqueous manganese sulphate electrolytes with a pH value of 3 was successfully demonstrated. A continuous flow in the cathodic compartment of the electrochemical cell to control the pH value during the electrodeposition experiments was found to be essential for achieving good layer qualities. It also allowed the co-electrodeposition with a second element, Fe, which also needs an acidic pH value to be electrodeposited from aqueous electrolytes. Cyclic voltammetry analyses were performed in combination with electrochemical quartz microbalance measurements in the MnSO4 containing electrolytes and a suitable deposition potential range was identified. The electrolyte composition played an important. The addition of H3BO3 provided mechanical stability to the Mn films and avoided their disintegration. An increase of the (NH4)2SO4 concentration increases the deposit roughness but also the layer quality, without impurities and a better crystalline α-Mn structure. An increase of the deposition potential led to an increase of the film thickness. Mn-oxides/-hydroxides were identified only in a thin surface region of the films. The Mn electrodeposited films were deeply characterized by means of SEM, XRD, GD-OES and XPS. The results related to the Mn electrodeposition allowed further design of the electrolytes and experiments to electrochemically synthesize FeMn layers. The assessment of the impact of the electrodeposition parameters on the structural, morphological and magnetic properties of the obtained films was also aimed in this work. With view to possible application of FeMn-based films in transient devices, their corrosion behavior in chloride-containing solution and their cytotoxicity were also evaluated. The electrolytes were characterized by means of CV and EQCM analyses. The ratio of the metal ions Mn2+:Fe2+ and the presence of glycine as complexing agent in the electrolyte determined the layer composition. The formation of the complexes Fe(gly)+ and Mn(gly)+ established a new reduction step modifying the Fe and Mn reduction/deposition. Glycine also leaded to a better film quality. A set of magnetron co-sputtered FeMn thin films was deposited as reference in order to compare the two synthesis methods with a broader range of Mn content between 10 and 70 wt.%. Metallic electrodeposited FeMn films presented a bcc structure with a Im-3m symmetry as well as the sputtered samples with a low Mn content up to 25 wt.%. An increase of the Mn content in the electrodeposited layers yielded to the formation of oxidized compounds with a fcc structure and Fm-3m symmetry. An increase in the Mn content for the sputtered films maintained the bcc structure but the symmetry was lowered to I-43m. With view to possible application of FeMn-based films in transient devices, their corrosion behavior in chloride-containing solution and their cytotoxicity were also evaluated. Regarding their corrosion behaviour, both techniques produced FeMn films with an active dissolution behaviour in chloride containing solutions. In vitro cytotoxicity tests revealed significant biocompatible characteristics of the sputtered films regardless of their Mn content. However, electrodeposited FeMn based layers did not presented optimal biocompatible characteristics. Furthermore, template-assited electrodeposition to obtain microrobots was studied in this work. Observed confinement effect was exploited, which results in compositional gradients with Mn-rich and Fe-rich regions and tubular or mushroom-like shapes. The propulsion performance of these electrochemically prepared hybrid micromotors was studied in the presence of H2O2 fuel with Triton-X as a surfactant and a magnetic field of 23.5 mT was applied. Bubbles produced by the catalytic decomposition of the H2O2 by the MnO2 and MnFe2O4 compounds was clearly the motion mechanism. Wireless modulated trajectory by the application of an external magnetic field was possible thanks to the magnetic phases, Fe3O4 and MnFe2O4.

Diese Arbeit liefert Informationen über die neuartige Synthese von physikalischen durch Glycin vernetzten Cellulosehydrogelen. Ihre Herstellung, Morphologie, Wasseraufnahmevermögen, mechanische und thermische Eigenschaften, Wiederverwendbarkeit und Stabilität werden detailliert beschrieben. Die Arbeit präsentiert eine umfassende Studie über die Herstellung, Charakterisierung, Morphologie und thermischen Eigenschaften von Hydrogelen und validiert die Verwendung von Cellulose-Glycin-Hydrogelen für Anwendungen mit abgeschiedenen Goldnanopartikeln. / This thesis provides information about the novel synthesis of cellulose hydrogels physically crosslinked by glycine; their fabrication, morphology, water absorption capacity, mechanical properties, thermal properties, reusability, stability and gold nanoparticle deposition. The work validates also the use of cellulose–glycine hydrogels for gold nanoparticle deposition applications and presents a comprehensive study of gold nanoparticle deposited hydrogels about their fabrication, characterization, morphology and thermal properties.

The project is about piezoelectric energy harvesters and piezoelectric bio-organic materials.Nowadays, various kinds of energy harvesters based on micro or nano materials are appliedinmanyelectronic applications, such as wearable devices and electricity generators. Amongthem, thepiezoelectric effect-based energy harvesters are more attractive in research and industryfields. Inrecent years, piezoelectric biomaterials become a popular option because they are availabletocouple electrical and mechanical energy in a biological, ecofriendly systemto generate electricityinreal time. Among them, γ- glycine crystals have been recently synthesized in wafer scale throughasimple polyvinyl alcohol (PVA)-assisted evaporation process exhibiting good piezoelectricperformance. However, so far there are no metal-free energy-harvesting devices basedonPVA-glycine film to enable green manufacturing. In this project, we proposed the direct inkwritingorganic PEDOT:PSS electrodes and PVA-glycine-PVA piezoelectric crystals to fabricate metal-freeenergy harvesters. The output voltage reaches 1.5 V at a load resistance of 500 MΩandunderaforce of 10 N. The performance is comparable to other glycine-based devices in recent literature.Our scalable, sustainable and low-cost printing process is expected to greatly contribute tothefieldof biomaterials-based piezoelectric energy harvesting. / Projektet handlar om piezoelektriska energiskördare och piezoelektriska bioorganiska material. Nuförtiden används olika typer av energiskördare baserade på mikro- eller nanomaterial i mångaelektroniska applikationer, såsom bärbara enheter och elgeneratorer. Bland dem är de piezoelektriskaeffektbaserade energiskördarna mer attraktiva inom forsknings- och industriområden. På senare år harpiezoelektriska biomaterial blivit ett populärt alternativ eftersom de är tillgängliga för att koppla elektrisk och mekanisk energi i ett biologiskt, miljövänligt system för att generera elektricitet i realtid. Bland dem har γ-glycinkristaller nyligen syntetiserats i waferskala genom en enkel polyvinylalkohol (PVA)-assisterad förångningsprocess som uppvisar god piezoelektrisk prestanda. Än så länge finnsdet dock inga metallfria energiskördande enheter baserade på PVA-glycinfilm för att möjliggöra gröntillverkning. I detta projekt föreslog vi direkt bläckskrivande organiska PEDOT:PSS-elektroder ochPVA-glycin-PVA piezoelektriska kristaller för att tillverka metallfria energiskördare. Utspänningennår1,5 V vid en belastningsresistans på 500 MΩ och under en kraft på 10 N. Prestandan är jämförbar medandra glycinbaserade enheter i nyare litteratur. Vår skalbara, hållbara och billiga utskriftsprocess förväntas i hög grad bidra till området för biomaterialbaserad piezoelektrisk energiskörd.

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Strikt anaerobe Bakterien wie Clostridium difficile und C. scatologenes verwenden GRE, um die chemisch ungünstige Decarboxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat zu p-Cresol zu katalysieren. Das Enzymsystem besteht aus einer Decarboxylase und dem zugehörigen Aktivierungsenzym. Die 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase (4Hpad) besitzt zusätzlich zum Protein-basierten Glycinradikal eine weitere Untereinheit mit bis zu zwei [4Fe-4S] Clustern und repräsentiert hierdurch eine neue Klasse von Fe/S-Cluster-haltigen GREs, die aromatische Verbindungen umsetzen. Das Aktivierungsenzym (4Hpad-AE) weicht vom Standardtypus ab, indem es zusätzlich zum S-Adenosylmethionin(SAM)-bindenden [4Fe-4S]-Cluster (RS-Cluster) mindestens einen weiteren [4Fe-4S]-Cluster bindet. In dieser Studie wurden heterologe Expressions- und Reinigungsprotokolle für 4Hpad und 4Hpad-AE entwickelt. Kristallstrukturen von 4Hpad cokristallisiert mit den Substraten (4-Hydroxyphenylacetat, 3,4-Dihydroxyphenylacetat) und dem Inhibitor (4-Hydroxyphenylacetamid) zeigten geringe strukturelle Änderungen im aktiven Zentrum des Proteins. Die Radikalbildung am 4Hpad-AE wurde durch die Überprüfung einer klassischen reduktiven Spaltung von SAM zu den Reaktionsprodukten 5’-Deoxyadenosin und Methionin bestätigt. EPR- und Mössbauer-Spektroskopische Analysen zeigten, dass 4Hpad-AE mindestens einen zusätzlichen [4Fe-4S] Cluster neben dem einzelnen RS-Cluster enthält. Die katalytische Notwendigkeit eines zusätzlichen Clusters wurde durch eine Mutationsanalyse untersucht, wobei eine verkürzte Version des Enzyms ohne die zusätzliche Cystein-reiche Insertion konstruiert wurde. Das verkürzte Mutante ohne die Bindungsmotive für die zusätzlichen Cluster gekennzeichnet, die Konfiguration, Stöchiometrie und die Funktion der zusätzlichen Cluster diagnostizieren. / 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase (4Hpad) is a two [4Fe-4S] cluster containing glycyl radical enzyme proposed to use a glycyl/thiyl radical dyad to catalyze the last step of tyrosine fermentation in Clostridium difficile and C. scatologenes by a Kolbe-type decarboxylation. The decarboxylation product p-cresol is a virulence factor of the human pathogen C. difficile. The small subunit of 4Hpad may have a regulatory function with the Fe/S clusters involved in complex formation and radical dissipation in the absence of substrate. The respective activating enzyme (4Hpad-AE) has one or two [4Fe-4S] cluster(s) in addition to the SAM-binding [4Fe-4S] cluster (RS cluster). The role of these auxiliary clusters is still under debate with proposed functions including structural integrity and conduit for electron transfer to the RS cluster. This study shows the optimized expression and purification protocols for the decarboxylase and the co-crystallization experiments and binding studies with 4-hydroxy-phenylacetate and 3,4-dihydroxyphenylacetate and with the inhibitor 4-hydroxy-phenylacetamide. The purification and characterization of active site mutants of decarboxylase are also done. Concerning 4-HPAD-AE, we report on the purification of code-optimized variants, and on spectroscopic and kinetic studies to characterize the respective i) SAM binding enthalpies, ii) rates for reductive cleavage of SAM and iii) putative functions of the additional Fe/S clusters. The truncated mutant lacking the binding motifs for the auxiliary clusters is characterized to diagnose the configuration, stoichiometry and function of the auxiliary clusters.