Les bactéries du genre Mycobacterium possèdent une enveloppe très caractéristique composée d'une membrane plasmique, une paroi et une capsule. Le compartiment pariétal est le plus remarquable, notamment grâce à la présence de lipides non liés de façon covalente à la structure : les lipides extractibles. Ubiquitaires ou spécifiques à une espèce, ces derniers sont retrouvés en surface, où ils peuvent jouer un rôle clé dans les interactions hôte-pathogène. La synthèse et le transport de ces lipides nécessite l'intervention d'une enzyme modulaire appelée polykétide synthase (Pks), d'une enzyme activant le substrat de la Pks, d'une autre transférant le produit de la Pks sur une molécule acceptrice et enfin d'un transporteur de la famille RND (résistance, nodulation, division cellulaire). Un locus regroupant les gènes codant pour des protéines de biosynthèse et de transport de lipides extractibles a été retrouvé sur le chromosome de M. smegmatis entre les gènes MSMEG_0406 et MSMEG_0413. Nous avons alors entrepris de caractériser le rôle de chacun de ces gènes. Notre stratégie a consisté à inactiver ces gènes par recombinaison homologue puis à étudier la nature et la localisation des dérivés lipidiques de l'enveloppe des mutants. Suite à la caractérisation structurale des dérivés lipidiques affectés par ces mutations, nous avons montré que ce locus est lié aux polyphléates de tréhalose (PPT), auparavant décrits chez M. phlei. Le composé mature consiste en un tréhalose estérifié par sept acides gras polyinsaturés appelés acides phléiques. L'étude des génomes mycobactériens a montré que ces gènes sont conservés par un large panel de mycobactéries non tuberculeuses, en particulier M. avium et M. abscessus, deux pathogènes opportunistes. L'analyse du contenu lipidique de ces deux espèces a mis en évidence un composé possédant des propriétés similaires aux PPT. Par ailleurs, l'inactivation chez M. abscessus de l'orthologue du gène codant la Pks abolit la production de ces composés, confirmant ainsi le rôle de la Pks. Par analogie avec les voies de biosynthèse des glycolipides produits par M. tuberculosis, agent de la tuberculose, nous avons pu établir un modèle de la voie de biosynthèse des PPT chez les mycobactéries. / The unique mycobacterial envelope can be divided into three entities: a plasma membrane, a cell wall and a capsule. The parietal compartment is remarkable for its lipid content notably the extractible lipids, not covalently bound to the structure. Either ubiquitous or species-specific, these surface lipids can play key roles in host-pathogen interactions. The synthesis and transport of many extractible lipids require at least a modular enzyme called polyketide synthase (Pks), a protein allowing the activation of the Pks substrate, another transferring the Pks product onto an acceptor molecule and a RND transporter (resistance-nodulation-division). A locus containing synthesis and transport coding genes was found on the M. smegmatis chromosome between MSMEG_0406 and MSMEG_0413. We then undertook to characterize the role of each gene composing this locus. Our strategy was to disrupt these genes by homologous recombination and then to analyze the lipid content and localization of the mutant strain envelope. Structural characterization of the impacted lipids showed a link between this locus and trehalose polyphleates (PPT) synthesis. The mature compound is a trehalose acylated by seven polyunsaturated fatty acids called phleic acid and previously described in M. phlei. Analysis of mycobacterial genomes showed that these genes are conserved in several non tuberculous mycobacteria, including the opportunistic pathogens M. avium and M. abscessus. Analysis of the lipid content of both species showed a compound with the same properties than PPT. Moreover, inactivation of the M. abscessus pks orthologue abolished its production, thus confirming the Pks implication in the PPT synthesis. By analogy with M. tuberculosis glycolipid biosynthesis, we could propose a model of the PPT biosynthetic pathway in mycobacteria.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Ce travail traite de la formulation et de la caractérisation de liposomes porteurs de glycolipides synthétiques, en vue du ciblage d'une bactérie : Helicobacter pylori. Après avoir passé en revue les différents systèmes à temps de résidence gastrique prolongé, il décrit la synthèse et l'utilisation de néoglycolipides de type "ancre-espaceur-sucre ", constitué respectivement du cholestérol, du tétraéthylène glycol et enfin du fucose (ou N-acétylglucosamine). Ont été étudiées dans ce travail l'organisation supramoléculaire des néoglycolipides seuls en fonction de leur état d'hydratation, les altérations de la bicouche liposomale suite à l'incorporation du néoglycolipide, l'accessibilité des sucres à la surface des liposomes, la variation du pH intraliposomal en fonction de pH externes acides, et enfin, l'interaction de quatre formulations de liposomes contenant ou non les néoglycolipides avec 2 souches d'H. pylori

La tuberculose (TB) est une maladie infectieuse causée par M. tuberculosis. En 2009, la mortalité était élevée avec 1,7 millions de décès enregistrés dans le monde. La co-infection par le VIH, notamment en Afrique, et les tuberculoses à bacilles multi-résistants aux antibiotiques, rendent la maîtrise de la pandémie encore plus complexe. Les tests actuels de diagnostic présentent des lacunes notamment en terme de sensibilité pour la microscopie qui est le test le plus utilisé, ou en terme de praticité, en ce qui concerne la culture qui est le test de référence. Le développement de nouveaux tests pour le diagnostic de la TB active représente un enjeu majeur de nos sociétés modernes. Les tests immunologiques, en particulier les tests sérologiques actuellement disponibles, présentent une alternative aux tests bactériologiques couramment utilisés mais leurs performances restent faibles. Pour cela, il est indispensable de cibler de nouveaux biomarqueurs pour développer un test efficace, sensible, rapide et peu onéreux. C'est dans de cadre que s'inscrit ce travail de thèse.Nous rapportons dans ce mémoire, la recherche de marqueurs innovants dans le cadre de la mise au point d'un test de diagnostic de la tuberculose. Nous avons ciblé plusieurs marqueurs protéiques (OmpATb, LipY, Rv0183, Rv1984c et Rv3452) et un marqueur glycolipide, le tréhalose-6,6'-dimycolate (TDM). Parmi ces candidats, plusieurs présentent de réelles performances sur le plan diagnostique. Parallèlement à cette étude, nous avons mis au point une technique de séparation des différentes formes de TDM. La séparation des différentes formes de TDM devrait permettre de déterminer de façon précise les fonctions de ces composants majeurs de la paroi de M. tuberculosis et d'évaluer leur potentiel en terme de diagnostic.Mots clés : tuberculose, sérodiagnostic, détection antigène, détection anticorps, enzymes lipolytiques, glycolipide. / Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by M. tuberculosis. In 2009, mortality was high with 1,7 million of recorded deaths in the world. The co-infection by the HIV, in particular in Africa, and tuberculosis with multi-resistant bacilli to antibiotics, make the control of pandemia more complex. The current tests of diagnosis present gaps, in particular, in term of sensitivity for microscopy, which is currently the used test, or in term of praticity, for the culture which is considered as the gold standard.The development of new tests for the diagnosis of TB active represents a major challenge of our modern societies. The immunological tests, in particular the serologic tests available, can present an alternative to the currently bacteriological tests. However, their performances are not sufficient. That's why, it is essential to target new biomarkers which permit to establish an effective, sensitive, fast and cheap test. It is in this context that my study takes place.We report in this memory, the research of innovating markers for the development of a diagnostic test of tuberculosis. We targeted several protenic markers (OmpATb, LipY, Rv0183, Rv1984c and for Rv3452) and a glycolipid marker, the trehalose-6,6'-dimycolate (TDM). Among these candidates, several shown good performances for active TB diagnosis. In parallel to this study, a technique of separation of the various forms of TDM was developed. The separation of the various forms of TDM will permit to study their role on the biological activities and evaluate their potential in term of diagnosis.Key words: tuberculosis, serodiagnostic, antigen detection, antibody detection, lipolytic enzymes, glycolipid.

Cette thèse est une contribution à l’étude des relations structure propriétés dans le domaine de la glycoamphiphilie. Trois nouvelles familles de neoglycolipides ont été synthétisées, deux familles principalement destinées à apporter des éléments sur l’état liquide cristallin des glycolipides, et une troisième famille permettant d’aborder l’étude de nouvelles glycosondes fluorescentes. Plus de 50 produits finaux ont été préparés (et donc leurs très nombreux précurseurs) et caractérisés structuralement par spectroscopie RMN, de masse, et par analyse élémentaire. Les propriétés liquides cristallines de ces nouveaux produits ont été ensuite étudiées par microscopie optique et DSC. L’étude des propriétés liquides cristallines de la famille d’éthers montrent que la localisation de la chaine sur le squelette sucre modifie la répartition entre liaisons hydrogène inter- ou intra moléculaires entre têtes polaires sucres. L’analyse du comportement thermotrope des glucostéroïdes, notamment ceux qui sont disubstitués, montre que les interactions lipide-lipide sont également très importantes. Il a été observé que ces systèmes complexes pouvaient adopter deux types d’architectures au niveau supramoléculaire en fonction de la flexibilité du système, laissant plus ou moins aux trois motifs présents dans la molécule la liberté de choisir leur préférence d’autoassociation. Les glycostéroïdes étant largement rencontrés dans la Nature, on peut considérer que ces observations nouvelles qui ont été apportées signalent que le comportement supramoléculaire de telles molécules est potentiellement multiple. Enfin, une brève exploration d’une nouvelle famille de glycosondes fluorescentes a été abordée. / In this study, we have synthesized two families of new carbohydrate-based amphiphilic derivatives: a series of alkyl glucoside ethers varying in terms of chain length and position on the sugar, and a series of glucosteroids varying in terms of alkyl spacer and, for the disutibstuted systems, in terms of alkyl side chain length. By the means of analytical methods, such as NMR spectroscopy, mass spectroscopy and elementary analysis, the structure of all the compounds was carefully established, as well as their purity. Their liquid crystalline behaviors were studied by the means of transmission light microscopy and differential scanning calorimetry. The two families of compounds which have been studied illustrate how much the behavior can be essentially related to polar interactions (H-bonding), therefore to the sugar moiety, for the ether series, or to hydrophobic interactions (lipid-lipid) in the glucosteroid series. In this latter series, preference for either steroid-stroid or steroid alkyl packing appears as an insight in understanding the behavior of complex lipids, showing potentially more than one conformational structure with important consequences on the supramolecular level, therefore to their potential biological role. This could be regarded as “lipid denaturation” by analogy to the protein denaturation. Also, when we see that compounds like the glycosteroids having an long chain ester -CAG, BbGL-I, are found to exist in Nature, and how much glycolipid-cholesterol interactions were recently shown to be critical in some biological processes, it is hoped that our observations can provide a new vision angle for the study of complex lipids and glycolipids. As a start to develop new probes targeting the “lipid raft” microdomain in membranes, we also explored a sequence towards carbohydrate laurdan hybrids. Further development of this strategy and evaluation of the biological properties is programmed within new collaborative projects.

La première partie de ce manuscrit concerne l'étude en monocouches à l'interface air-eau de mélanges lipidiques susceptibles de former des "rafts" dans les membranes cellulaires, c'est-à-dire des domaines enrichis spécifiquement en certains lipides (glycolipides, sphingolipides, cholestérol) et certaines protéines. Du fait de leur composition spécifique, ces domaines sont caractérisés par une phase particulière ("liquid ordered phase") présentant des caractéristiques intermédiaires entre celles des phases fluides et condensées. Les principales méthodes mises en oeuvre dans cette étude sont des mesures de pression de surface (isothermes de compression, analyse des aires moléculaires moyennes, études de désorption en présence de beta-cyclodextrine), la microscopie de fluorescence (après marquage de la monocouche à l'aide d'une sonde fluorescente), ou la microscopie à l'angle de Brewster. Une des parties les plus importantes de ce travail concerne le comportement de monocouches constituées d'un glycolipide, le GM3, en présence de phospholipides (phase fluide), de sphingomyéline ou de cholestérol (phase "raft"). Les mesures montrent que le GM3 n'a pas d'affinité particulière pour la sphingomyéline. De même, son interaction avec le cholestérol induit une condensation de la monocouche similaire à celle observée avec les phospholipides en phase fluide, et ne permet pas le maintien du cholestérol dans la monocouche lors d'une désorption induite par la beta-cyclodextrine. Ce manque d'interaction spécifique du GM3 avec des lipides présents dans les "rafts" permet donc d'expliquer sa répartition assez large dans les membranes d'adipocytes, tant dans la phase fluide que dans les "rafts". La seconde partie concerne l'étude de molécules organiques de type hémicyanine organisées en monocouches de Langmuir et films de Langmuir-Blodgett, étudiés par des méthodes complémentaires (absorption, spectroscopie de fluorescence stationnaire et résolue en temps), mesures de pression de surface et microscopie de fluorescence. Ces hémicyanines comportent une chaîne hydrophobe nécessaire à la réalisation de films organisés stables. Ces derniers peuvent avoir de multiples applications dans la collecte et le transfert de l'énergie lumineuse ou les analyses chimiques ou biochimiques (reconnaissance sélective de cations lors de pollutions par exemple).