La synthèse d'inhibiteurs puissants et selectifs de glycosidases, enzymes impliquées dans de nombreux processus biologiques, permet d'accéder à des agents thérapeutiques potentiels. L'objectif de ce travail était de synthétiser de nouveaux analogues du salacinol, un puissant inhibiteur naturel d'alpha - glucosidases possédant une stucture originale zwitterionique, et d'évaluer les propriétés inhibitrices des composes obtenus sur six glycosidases commerciales. Nous avons donc préparé plusieurs iminosucres, analogues de la désoxynojirimycine et de l'acide pipécolique, par une méthode originale basée sur l'utilisation d'isoxazolines. par couplage de ces iminosucres ou de différents thiosucres avec deux sulfares cycliques, nous avons synthétisé six nouveaux analogues azotés et neuf nouveaux analogues soufrés du salacinol. L'un de ces analogues soufrés s'est révélé être un très bon inhibiteur de la béta - glucosidase d'amandes.

Les glycoprotéines d'enveloppe (Env) du VIH-1 se caractérisent par leur long domaine cytoplasmique (DC) qui joue un rôle essentiel dans la morphogenèse et l’infectivité virales. La multiplication virale in vitro et in vivo dépend ainsi étroitement de l’intégrité de ce domaine. Nous avons cependant identifié un patient infecté par un VIH-1 présentant des Env avec un DC tronqué de 20 acides aminés. Cette anomalie structurale aurait dû aboutir à la production de virions dont la capacité infectieuse était fortement diminuée. Mon travail de thèse a donc consisté à évaluer les conséquences fonctionnelles d’une telle troncation et à explorer les mécanismes moléculaires permettant au virus présentant cette anomalie de se multiplier efficacement in vivo. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont abouti à l’identification de mécanismes de compensation des capacités de multiplication de ce virus portant des Env tronquées dans leur DC impliquant des mutations dans la protéine de matrice. En conclusion, toutes ces données ont permis d’apporter des éléments de compréhension nouveaux quant à l’assemblage du VIH-1 et son fort potentiel d’évolution in vivo. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) typically encodes envelope glycoprotein transmembrane subunits with long cytoplasmic tails (CTs) involved in viral infectivity and morphogenesis. The integrity of the gp41 CT thus seems to be essential for viral replication in vitro and in vivo. However, we report here the emergence and dominance in vivo of a primary HIV-1 variant carrying a natural 20-amino-acid truncation of the gp41 CT. Such a deletion would therefore be expected to impair viral replication. The aims of this study were thus to assess the functional consequences of the gp41 truncation and to identify the molecular mechanisms by which a primary HIV-1 harboring such a deletion in the gp41 CT maintained its ability to replicate efficiently in vivo. Our findings reveal that replication capacity of a primary HIV-1 carrying truncated CT could be rescued by compensatory mechanisms involving mutations in the matrix protein. In conclusion, our findings provide new insignt into HIV-1 assembly and evolution potential in vivo.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Objectif: Crumbs3 (CRB3) est essentielle pour la polarité épithéliale et la formation des jonctions serrées. Deux isoformes de CRB3 ont été identifiés, soit CRB3A et CRB3B. Les fonctions et la localisation de ces protéines demeurent méconnues. Notre objectif était d'étudier la localisation de ces protéines dans différentes lignées épithéliales et leur fonction par identification de partenaires d'interaction. Méthodes: Nous avons produit un gène de fusion HIS-CRB3A qui a été exprimé dans des cellules d'insectes, puis le produit de ce gène a été purifié à l'aide de billes magnétiques. La protéine HIS-CRB3 isolée a servie d'appât pour isoler des partenaires d'interaction par spectrométrie de masse à partir d'un homogénat de cellules épithéliales humaines (Caco-2). Résultats : L'analyse en spectrométrie de masse a révélé que plusieurs importines et exportines interagissent avec CRB3, suggérant que CRB3 puisse se localiser au niveau du noyau. En accord avec cette hypothèse, l'analyse de la séquence de CRB3 montre un NLS et un NES potentiels. De plus, par immunofluorescence et fractionnement cellulaire, nous avons montré que CRB3B se situe au niveau du noyau. Par contre, la localisation de CRB3A est restreinte à la membrane plasmique. Conclusion : Nous avons identifié des partenaires d'interaction de CRB3 qui laisse présager des fonctions insoupçonnées pour cette protéine.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'asthme est une maladie inflammatoire des voies respiratoires caractérisée par une contraction réversible des voies aériennes, une hyperactivité bronchique, ainsi qu'une inflammation. L'asthme allergique est le phénotype le plus répandu et se distingue par une réponse de type Th2. Plusieurs cellules immunitaires, dont les cellules dendritiques et les lymphocytes B, jouent un rôle important dans la réponse inflammatoire. De plus, la pathogenèse de l'asthme comprend aussi une dérégulation des voies anti-inflammatoires, telles que la voie du CD200/CD200R. Le but de ce mémoire était de vérifier si l'apport exogène de CD200Fc, un agoniste du CD200R, pouvait altérer la progression de l'asthme chronique. En utilisant un modèle murin d'asthme expérimental, nous avons démontré que l'exposition chronique à du HDM (House Dust mite) a altéré l'expression du CD200 et du CD200R sur les populations de cellules immunitaires pulmonaires. Le CD200Fc n'a pas modifié la réponse Th2, mais il a diminué l'activation des lymphocytes B et des cellules dendritiques conventionnelles (cDC). Nous avons confirmé que le CD200Fc peut moduler l'activation des cDC in vitro en utilisant des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse. Ces résultats ont permis d'évaluer les effets bénéfiques de l'administration de CD200Fc et suggèrent son utilité comme complément thérapeutique potentielle chez les asthmatiques. / Asthma is an inflammatory disease of the airways characterized by reversible contraction of the airways, airway hyperreactivity, and inflammation. Allergic asthma is the most common phenotype and is characterized by a Th2 response. Several immune cells, including dendritic cells and B cells, play an important role in the inflammatory response. In addition, the pathogenesis of asthma also includes dysregulation of anti-inflammatory pathways, such as the CD200/CD200R pathway. The aim of this master's thesis was to verify whether a CD200R agonist, CD200Fc, could alter the progression of chronic asthma. Using an experimental model of asthma, we demonstrated that chronic exposure to HDM (House Dust mite) altered the expression of CD200 and CD200R on lung immune cell populations. CD200Fc did not modify the Th2 response, but it decreased the activation of B cells and conventional dendritic cells (cDC). We confirmed that CD200Fc can modulate cDC activation in vitro using bone marrow derived dendritic cells. These results demonstrate the beneficial impact of CD200Fc and suggest its potential add-on therapeutic effect in the context of asthma.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le marché des agents de livraison d'acides nucléiques est en pleine expansion et atteindra plus de cinq milliards de dollars en 2030. Ces agents, utilisés pour livrer de l'information génétique dans des cellules de mammifères, ont de nombreuses applications tant dans le domaine de la recherche fondamentale que thérapeutique. Parmi les différentes catégories d'agents de livraison, celle utilisant des vésicules extracellulaires (VE) pseudotypées par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG) s'est révélée prometteuse dans les dernières années. En effet, en combinaison avec un polymère cationique, ces particules (VE-VSVG) se sont montrées capables de livrer des acides nucléiques de type ADN et ARN dans différents types cellulaires. Malheureusement, les procédés de production actuels des VE-VSVG, impliquant l'utilisation de cellules HEK 293, sont difficiles à adapter à l'échelle industrielle notamment à cause de l'utilisation de cellules productrices adhérentes, de la présence de sérum dans le milieu de culture et de procédés de purification incomplets. Par conséquent, l'objectif de ces travaux de recherche a été de développer un procédé de fabrication des VE-VSVG, pouvant être plus facilement transposé à l'échelle industrielle. Cette thèse se divise en quatre chapitres. Le chapitre 1 constitue une revue de la littérature et fait un état des lieux des différentes méthodes de livraison d'acides nucléiques, ainsi que des procédés de production et de purification de particules biologiques pseudotypées par la protéine VSVG, incluant les VE-VSVG. Les trois chapitres suivants présentent les résultats obtenus au cours de ce doctorat. Le chapitre 2 regroupe les résultats d'une première publication dédiée à la mise en place d'un procédé de production de VE-VSVG par transfection transitoire de cellules HEK 293, cultivées en suspension sans sérum, ainsi que d'une méthode de purification, composée d'une phase de concentration par ultracentrifugation et d'une étape de séparation par chromatographie d'affinité. Le chapitre 3 présente les résultats d'une future publication, consacrée à l'analyse de l'effet de la production de VE-VSVG sur l'expression génique des cellules HEK 293, ainsi qu'à l'amélioration des rendements de production de ces particules, grâce à l'identification de différents gènes prometteurs au cours de cette étude transcriptomique. Finalement, le chapitre 4 regroupe des résultats consacrés à l'évaluation d'autres plateformes de fabrication (production et purification) des VE-VSVG. En conclusion, les nouvelles données et les procédés développés dans le cadre de cette thèse permettent d'améliorer significativement la production et la purification de cet agent de livraison d'acides nucléiques prometteur, dans un contexte industriel. / The market of nucleic acid delivery agents is growing rapidly and will reach more than $5 billion by 2030. These agents, used to deliver genetic information into mammalian cells, have numerous applications in both basic and therapeutic research. Among the different classes of delivery agents, the one using extracellular vesicles (EV) pseudotyped with the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) has shown promises in recent years. In combination with a cationic polymer, these particles (EV-VSVG) have been shown to be able to deliver DNA and RNA in different cell types. Unfortunately, current EV-VSVG production processes, involving the use of HEK 293 cells, are difficult to adapt to industrial scale, notably due to the use of adherent producer cells, the presence of serum in the culture medium and incomplete purification procedures. Therefore, the goal of this thesis was to develop a manufacturing process for EV-VSVG that could facilitate the transposition to industrial scale. This thesis is divided into four chapters. Chapter 1 is a review of the literature and presents an overview of the nucleic acid delivery methods, as well as processes for the production and purification of VSVG-pseudotyped biological particles, including EV-VSVG. The following three chapters present the results obtained during this Ph.D. Chapter 2 covers the results of a first publication dedicated to the development of a production process of EV-VSVG by transient transfection of HEK 293 suspension cells grown in serum-free media, as well as a purification method, composed of a concentration step by centrifugation and a separation step by affinity chromatography. Chapter 3 presents the results of a future publication, dedicated to the analysis of the effect of VSVG protein production on HEK 293 cell gene expressions, as well as to the improvement of those particles production yields, through the identification of various promising genes during this transcriptomic study. Finally, Chapter 4 brings together results devoted to the evaluation of alternative manufacturing platforms (production and purification) for EV-VSVG. In conclusion, the new data and processes developed in this thesis significantly improve the production and purification of this promising nucleic acid delivery agent, in an industrial context.

La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par une perte synaptique et neuronale. La présence de mutations dans le gène codant pour la Préséniline 1 (PS1) conduit à une forme très agressive de la MA et les mutants PS1 pourraient amplifier la perte synaptique et neuronale. La MA est aussi marquée par une augmentation de la protéine Butyrylcholinestérase (BuChE) qui joue un rôle dans la dégradation de l’Acétylcholine (ACh). De plus, l’ACh est diminuée dans la MA. La Synaptophysine (Syn), marqueur de la synaptogenèse est aussi diminuée dans la MA. Des études antérieures au laboratoire ont démontré une interaction de PS1 avec la Neural-Plakophilin-Related Armadillo Protein(NPRAP), une protéine neuronale dont la délétion du gène entraîne des déficits cognitifs importants. De précédents travaux au sein du laboratoire ont mis en évidence que NPRAP module l’expression du gène de BuChE et semble également intervenir dans l’expression de Syn. De plus, nous avons identifié une mutation dans le gène NPRAP qui serait associée au développement de la MA. L’hypothèse de mon projet de maitrise est que PS1 et NPRAP sont importants pour le maintien de l’intégrité neuronale, via Syn et BuChE. Mon objectif est d’étudier l’effet de PS1 et NPRAP sauvageset mutantes (PS1 L392V / PS1 M146L / NPRAP G810R) sur la modulation des niveaux protéiques et de l’ARNm de Syn et BuChE. Le niveau protéique et d’ARNm de Syn et BuChE ont été analysé dans les cellules HEK-293 et SH-SY5Y. Nous avons également vérifié l’expression de Syn et BuChE au niveau cellulaire par l’immunofluorescence. Les résultats obtenus mettent en évidence une augmentation du niveau de BuChE dans les cellules SH-SY5Y transfectées par PS1-M146L et NPRAP sauvage. Aucune modulation du niveau protéique ou de l’ARNm de synaptophysine n’a été détecté et les analyses d’immunofluorescence ne sont pas concluantes. Des analyses supplémentaires permettront de valider l’impact de PS1 M146L et NPRAP sauvage sur l’expression de BuChE. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by synaptic and neuronal loss. The presence of mutations on the Presenilin 1 (PS1) gene are associated with a very aggressive form of AD and these mutations could amplify the synaptic and neuronal loss. AD is also characterized by the increase in Butyrylcholinestérase protein (BuChE) which plays a role in acetylcholine (ACh) degradation. Moreover, ACh is decreased in AD. Synaptophysin protein (Syn), a marker of synaptogenesis has also been shown to be decreased in AD. Prior studies in the laboratory demonstrated an interaction between PS1 andNeural-Plakophilin-Related Armadillo Protein (NPRAP), a neuronal protein whose gene deletion causes important cognitive dysfunctions. Previous work has shown that NPRAP modulates expression of BuChE gene and seems to be involved in Syn expression. Furthermore, we identified a mutation in NPRAP’s gene that could be associated with the development of AD.My hypothesis is that PS1 and NPRAP are important for the maintenance of neuronal integrity, via Syn and BuChE. My objective was to study the effect of the wild-type and mutated form of PS1 and NPRAP (PS1 L392V / PS1 M146L / NPRAP G810R) on the modulation of Syn and BuChE’s levels. Syn and BuChE’s expression were analysed at the protein level and ARNm level in HEK-293 and SH-SY5Y cells. We also verified Syn and BuChE expression at the cellular level by Immunofluorescence. The results obtained seems to indicate an increase of the level of BuChE in SH-SY5Y transfected cells by PS1-M146L and NPRAP sauvage. There is no significant variation of Syn level and immunofluorescence analysis were not conclusive. Other experiments will be necessary to verify the impact of PS1 M146L and NPRAP sauvage on the expression of BuChE’s.

PROBLÉMATIQUE. Le tabagisme induit une réponse inflammatoire pulmonaire qui, lorsque soutenue, peut engendrer des dommages tissulaires. Il existe des systèmes de régulation de l’inflammation afin de maintenir et de rétablir l’homéostasie cellulaire tel que le système « Signal regulatory protein alpha » (SIRPa)/CD47. SIRPa est exprimée principalement par les cellules myéloïdes, alors que CD47 est retrouvée de façon ubiquitaire. Il a été démontré que l’activation de SIRPa par la protéine de fusion CD47-Fc réduit la réponse inflammatoire pulmonaire dans un modèle d’asthme allergique sensibilisé à l’ovalbumine. Nous posons donc l’hypothèse que l’activation de SIRPa pourrait limiter l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette. OBJECTIFS. 1) Évaluer l’effet de la fumée de cigarette sur les niveaux d’ARNm et protéiques de SIRPa. 2) Investiguer l’impact d’une activation de SIRPa sur l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette. MÉTHODES. Des souris BALB/c ont été exposées à la fumée de cigarette 2h/jour, 5 jours/semaine pendant 2, 8 et 24 semaines afin d’explorer, par qPCR, les niveaux d’ARNm de SIRPa. D’autres protocoles d’exposition de 4 jours ont été réalisés afin de déterminer les niveaux protéiques de SIRPa par cytométrie en flux et d’investiguer l’impact d’une activation de SIRPa par l’administration systémique du CD47-Fc. L’efficacité du CD47-Fc sur la réponse inflammatoire pulmonaire a été déterminée par des comptes cellulaires totaux et différentiels dans le lavage broncho-alvéolaire. RÉSULTATS. En contexte tabagique, les niveaux d’ARNm de SIRPa augmentent dans le poumon alors que le nombre de phagocytes exprimant cette protéine semble diminuer. Or, SIRPa est retrouvée en plus grande quantité sur les cellules qui l’expriment toujours. L’administration du CD47-Fc engendre une diminution de la neutrophilie chez les souris fumeuses. CONCLUSION. Ces résultats suggèrent que le CD47-Fc peut réduire l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette. De plus amples recherches permettront d’évaluer son potentiel thérapeutique. / RATIONAL. Smoking induces an inflammatory response in the lung that can cause significant tissue damage if sustained. Fortunately, there exist inflammatory regulatory pathways that help maintain and restore cellular homeostasis, such as through the signal regulatory protein alpha (SIRPa)/CD47 system. SIRPa is mainly expressed by myeloid cells while CD47 is found ubiquitously. It has been shown that activation of SIRPa by CD47-Fc fusion protein reduces the inflammatory pulmonary response in an ovalbumin-induced allergic asthma mouse model. Thus, we hypothesize that activation of SIRPa could limit lung inflammation induced by cigarette smoke exposure. OBJECTIVES. 1) To evaluate the effect of cigarette smoke on SIRPa mRNA and protein levels. 2) To investigate the impact of SIRPa activation on lung inflammatory response induced by cigarette smoke exposure. METHODS. SIRPa mRNA levels were explored by qPCR in BALB/c mice that were exposed to cigarette smoke 2 hours/day, 5 days/week during 2, 8 and 24 weeks. Also, 4 days cigarette smoke protocols were performed to investigate SIRPa protein levels by flow cytometry and to evaluate the impact of SIRPa activation by systemic administration of CD47-Fc. Treatment efficacy was determined via total and differential cellular count in the bronchoalveolar lavage (BAL). RESULTS. SIRPa mRNA levels were increased in the lungs of mice exposed to cigarette smoke. Although, the number of phagocytes expressing SIRPa protein seems to decrease, our data show that these cells expressed SIRPa at a higher intensity. Finally, we found that CD47-Fc treatment reduced neutrophilia in BAL of mice exposed to cigarette smoke. CONCLUSION. These results demonstrate that CD47-Fc treatment can reduce lung inflammation induced by cigarette smoke exposure, suggesting further research into CD47-Fc therapeutic potential is required.

Les bactéries magnétotactiques (MTB) représentent un groupe de bactéries diverses sur le plan phylogénétique, morphologique et physiologique et elles ont la capacité de s'orienter grâce au champ géomagnétique terrestre afin de trouver leurs conditions optimales de développement. Ce comportement remarquable est appelé le magnétotactisme. Les connaissances actuelles de la formation des magnétosomes et du magnétotactisme sont basées principalement sur l'étude des souches magnetospirilla d'eau douce. Au cours de cette thèse, j'ai participé à l'annotation et réalisé des analyses génomiques, physiologiques et génétiques des deux MTB marines. Mes résultats ont révélé un mécanisme d'adaptation de la souche magnetospirillum QH-2 à l'habitat intertidal et des voies métaboliques (autotrophie,- fixation de l'azote, transport du fer) ainsi que des mécanismes de détection environnementaux distincts des magnétospirilla d'eau douce. La souche marine ovoïde MO-1 possède un génome composé de fortes proportions de gènes avec des origines possibles de gamma-(23,6 %), delta-(16,8 %), alpha-(13,2 %) et bêta- (9,1 %) protéobactéries. Cette constatation suggère que MO-1 est un ancêtre fossile ou une nouvelle sous-classe des Proteobacteria. J'ai caractérisé le comportement magnétoctatique de la souche MO-1 et montré que le magnétotactisme est bénéfique et même essentiel pour la croissance des MTB. Par ailleurs, j'ai caractérisé des glycoprotéines essentielles pour la structure et la fonction de l'appareil flagellaire de MO-1. L'ensemble de ces résultats contribue à notre compréhension de la diversité et l'évolution des MTB, ainsi que l'importance environnementale du magnétotactisme. / Magnetotactic bacteria (MTB) consist of a phylogenetically, morphologically and physiologically diverse group of gram-negative bacteria. They have the unique capacity of synthesizing magnetic crystal enveloped with membrane, referred to as magnetosomes, which allow the bacteria swimming along magnetic fields lines (magnetotaxis) to seek optimal oxygen concentration with maximal efficiency. Current knowledge of magnetosome formation and magnetotaxis mainly steams from the study of freshwater magnetospirillum strains. In this thesis, I participated to the expert annotation and performed genomic, physiological and genetic analyses of two marine MTB. I revealed the adaptation of marine magnetospirillum strain QH-2 to the intertidal habitat and metabolic pathways (autotrophy, N2-fixation, iron-transport) and environmental sensing mechanism distinct from those of the freshwater magnetospirilla. In addition, the genome of the marine ovoid strain MO-1 is composed of high proportions of genes with possible origins of gamma- (23.6%), delta- (16.8%), alpha- (13.2%) and beta- (9.1%) proteobacteria. This finding suggests that MO-1 is either a fossil ancestor or a new subclass of the Proteobacteria. I characterized the magnetotactic behavior of the strain MO-1 and showed that magnetotaxis is beneficial and even essential for the growth of MTB. In addition, I carried out proteomic and biochemical studies of glycol-proteins being components of the MO-1 flagellar apparatus or possibly serving as lubricants for the flagellar motor. Together these results contribute to our understanding of the diversity and evolution of MTB as well as the environmental significance of magnetotaxis.