Globotriaosylceramide (Gb3) is a resistance factor against human immunodeficiency virus (HIV) infection, but its expression has not been studied on human CD4+ T-cells. It was proposed that CD4+ T-cells may express Gb3 upon in vitro stimulation. To examine this, the optimal method for surface-expressed Gb3 detection was determined by comparing reagents, which showed that natural ligand (VT1B) and rat IgM monoclonal antibody (38-13) were the best methods. Using these, stimulated cells upregulated Gb3 in subsets of CD4+ T-cells, including T regulatory and NKT cell phenotypes, although the expression remained less than 2 percent of total cells. An enrichment method confirmed this. Examination of total Gb3 revealed that stimulated CD4+ T-cells without surface-expressed Gb3 did not express intracellular Gb3. Based on these results, it is concluded that CD4+ T-cells do not express Gb3 at significant levels under the conditions examined and, thus, may not have potential for resistance to HIV infection.

Globotriaosylceramide (Gb3) is a resistance factor against human immunodeficiency virus (HIV) infection, but its expression has not been studied on human CD4+ T-cells. It was proposed that CD4+ T-cells may express Gb3 upon in vitro stimulation. To examine this, the optimal method for surface-expressed Gb3 detection was determined by comparing reagents, which showed that natural ligand (VT1B) and rat IgM monoclonal antibody (38-13) were the best methods. Using these, stimulated cells upregulated Gb3 in subsets of CD4+ T-cells, including T regulatory and NKT cell phenotypes, although the expression remained less than 2 percent of total cells. An enrichment method confirmed this. Examination of total Gb3 revealed that stimulated CD4+ T-cells without surface-expressed Gb3 did not express intracellular Gb3. Based on these results, it is concluded that CD4+ T-cells do not express Gb3 at significant levels under the conditions examined and, thus, may not have potential for resistance to HIV infection.

Alzheimer's disease (AD) is characterized by the accumulation of amyloid beta plaques, neurofibrillary tangles (NFT) and loss of cortical neurons that control memory and cognition. The cause of NFTs and Aβ plaques is not clear, though it is known that they are formed by enzymes which are preferentially sequestered to membrane domains called lipid rafts. Sulfatide (ST) is a glycosphingolipid that is essential for the proper structure and function of lipid rafts. In mice that lack ST, membrane domains that are normally maintained by adhesive contacts and functional lipid rafts are improperly formed and are unstable. In these ST null mice, voltage gated sodium channels, neuronal proteins that normally cluster at the nodes of Ranvier, initially accumulate in the node but are not retained with age. Taken together the findings from the ST null mice indicate that membrane organization is compromised. Recently, a published report demonstrated that ST is significantly reduced in AD. Based on this observation combined with the findings from the ST null mice, I propose that membrane architecture is also altered in AD and this alteration may facilitate AD pathogenesis. To test this hypothesis, I have used an immunohistochemical approach to assess neuronal membrane organization in AD and non-AD brain samples. Analysis of the sodium channel clusters was chosen since these nodal domains provide an easy assessment tool for membrane organization. In the current study, sodium channel domains were not altered and no change in isoform expression was observed. Based on these findings, membrane organization does not appear to be altered in AD. It is important to note, however, that sodium channel clusters are restricted to a specific region of the axon and thus membrane organization within other regions of the axon and in other regions of the neuron may be altered. Additionally, assessment of the brain samples, using thin layer chromatography, did not show a reduction in ST levels between the AD and non-AD brains. Therefore, my study strongly suggests that further analysis of ST levels in AD brains should be conducted to resolve the contrasting results between the current study and the previously published work.

Verotoxin produced by Enterohemorrhagic E. coli is comprised of a catalytic A subunit and a receptor Gb3 binding B subunit pentamer. VT causes protein synthesis inhibition by ribosomal inactivation in Gb3 positive cells via receptor mediated endocytosis and retrograde transport to the ER. We propose that verotoxin is a novel inhibitor for HIV-1 infection. Experiments conducted using VT treated Jurkat-C T cells and PHA/IL-2 activated human PBMCs reveal the anti-HIV-1 property of VT is receptor Gb3 independent since the catalytic A subunit alone is sufficient for inhibition. Possible mechanism of action involves mild inhibition of protein synthesis and cell proliferation. Recent findings in our lab suggest Gb3 is a natural resistance factor for HIV-1 infection, which was further investigated by selecting a Gb3 low subpopulation in THP-1 cells using VT treatment. Selected THP-1 cells were completely resistant to HIV-1 infection, however decreased surface CXCR4 expression may be a cause.

Verotoxin produced by Enterohemorrhagic E. coli is comprised of a catalytic A subunit and a receptor Gb3 binding B subunit pentamer. VT causes protein synthesis inhibition by ribosomal inactivation in Gb3 positive cells via receptor mediated endocytosis and retrograde transport to the ER. We propose that verotoxin is a novel inhibitor for HIV-1 infection. Experiments conducted using VT treated Jurkat-C T cells and PHA/IL-2 activated human PBMCs reveal the anti-HIV-1 property of VT is receptor Gb3 independent since the catalytic A subunit alone is sufficient for inhibition. Possible mechanism of action involves mild inhibition of protein synthesis and cell proliferation. Recent findings in our lab suggest Gb3 is a natural resistance factor for HIV-1 infection, which was further investigated by selecting a Gb3 low subpopulation in THP-1 cells using VT treatment. Selected THP-1 cells were completely resistant to HIV-1 infection, however decreased surface CXCR4 expression may be a cause.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間健康科学) / 甲第20293号 / 人健博第41号 / 新制||人健||4(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科人間健康科学系専攻 / (主査)教授 高桑 徹也, 教授 岩井 一宏, 教授 精山 明敏 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human Health Sciences / Kyoto University / DFAM

Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen. Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären. Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate. In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden. / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that. The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde. Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives. In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.

Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen. Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären. Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate. In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Sphingolipide, Glycosphingolipide und Ganglioside 1 1.1.1 Biosynthese und Transport der Ganglioside 5 1.1.2 Biologische Funktionen und pathophysiologische Bedeutung der Ganglioside 10 1.2 Sialinsäuren 12 1.3 Das Disialogangliosid GD3 16 1.3.1 Vorkommen von GD3 16 1.3.2 Biologische Wirkungen von GD3 17 1.3.3 GD3 als Zielstruktur in der Tumortherapie 20 1.3.4 Modifikationen der Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.1 9-O-Acetylierung der terminalen Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.2 Oxidation der terminalen Sialinsäure von GD3 25 1.4 Zielstellung 27 2 MATERIAL UND METHODEN 28 2.1 Materialien 28 2.1.1 Biologische Materialien 28 2.1.1.1 Patientenproben 28 2.1.1.2 Versuchstiere 28 2.1.1.3 Zelllinien und Hybridome 28 2.1.2 Reagenzien, Antikörper und Enzyme 29 2.1.3 Chemikalien 31 2.1.4 Geräte und Hilfsmittel 32 2.2 Methoden 34 2.2.1 Zellkultur 34 2.2.1.1 Kulturmedien 34 2.2.1.2 Zellkulturtechnik 35 2.2.1.3 Zellernte der Suspensionszellen 35 2.2.1.4 Zellernte der adhärenten Zelllinien 35 2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 36 2.2.1.6 Kryokonservierung 36 2.2.1.7 Auftauen 37 2.2.1.8 Hybridomkultivierung 37 2.2.1.9 Kultur von AML Blasten 37 2.2.2 Durchflusszytometrie 37 2.2.2.1 Oberflächenfärbung von Zelllinien 38 2.2.2.2 Oberflächenfärbung von PBMC und Granulozyten 39 2.2.2.3 Intrazelluläre Färbung 39 2.2.2.4 Detektion reaktiver Sauerstoffspezies mittels DCFDA-Färbung 39 2.2.2.5 SubG1-Analyse 41 2.2.3 Aufarbeitung von Gangliosiden aus Zellen 41 2.2.3.1 Herstellung des Rohextraktes 42 2.2.3.2 Entsalzung des Extraktes an einer Reversed Phase Chromatographie-Säule 43 2.2.4 Dünnschichtchromatographie - HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie) 44 2.2.4.1 Detektion mit Orcinfärbung 44 2.2.4.2 Detektion mit Primulin - Färbung 45 2.2.4.3 Detektion mit Overlay - Immunfärbung 45 2.2.5 Isolation von Glycolipiden aus lyophilisierter Buttermilch 47 2.2.5.1 Herstellung des Rohextraktes 48 2.2.5.2 Entsalzung mittels Dialyse 49 2.2.5.3 Si60-Kieselgel-Chromatographie 49 2.2.5.4 DEAE-Ionenaustauschchromatographie 50 2.2.5.5. Entsalzung mit RP-Säule 51 2.2.5.6 HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) 51 2.2.6 Herstellung von GD3-7-Aldehyd aus GD3 52 2.2.6.1 Oxidation von Gangliosiden in situ auf HPTLC-Platten 52 2.2.6.2 Darstellung von GD3-7-Aldehyd unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und Eisen-II-clorid (Fenton Reaktion) 53 2.2.7 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen GD3-7-Aldehyd 53 2.2.7.1 Immunisierung der Mäuse 54 2.2.7.2 Vorbereitung der Myelomzellen 54 2.2.7.3 Präparation der Milzzellen 55 2.2.7.4 Fusion der Milz- und Myelomzellen 55 2.2.7.5 Selektion und Klonierung 56 2.2.7.5.1 Screening 56 2.2.7.5.2 Ermittlung der Spezifität 57 2.2.7.5.3 Bestimmung der Immunglobulinklasse und des Subtyps 57 2.2.8 Separation mononukleärer Zellen (PBMCs) und Granulozyten aus Vollblut 57 2.2.8.1 Isolation einzelner Leukozytenpopulationen mittels MACS Technologie 58 2.2.8.1.1 Positivselektion von Monozyten 58 2.2.8.1.2 Positivselektion von Slan-DCs mit M-DC8 58 2.2.9 Generierung und Maturierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten 59 2.2.10 Indirekte Immunfluoreszenz 60 2.2.10.1 Aufzentrifugieren von Suspensionszellen auf Objektträger 60 2.2.10.2 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen auf Objektträgern 60 2.2.10.3 Fluoreszenzfärbung von Zellen und Geweben auf Objektträgern 60 2.2.11 Immunhistochemische Färbung mit modifizierter ABC-Methode 61 2.2.12 Behandlung von HL60 mit GD3-7-Aldehyd 62 2.2.13 Inkubationsversuche von Molt-4 mit unterschiedlichen GD3-Derivaten 63 2.2.14 Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in HEp-2 durch UV-Bestrahlung 63 3 ERGEBNISSE 64 3.1 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 65 3.1.1 Isolation von GD3 und 9-O-acetyl-GD3 aus lyophilisierter Buttermilch 65 3.1.1.1 Reinigung des Rohextraktes über Si60-Kieselgelchromatographie 65 3.1.1.2 Reinigung des Glycolipidgemisches über DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatographie 66 3.1.1.3 Reinigung der Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 mittels High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 67 3.1.1.4 Quantifizierung des gewonnenen Gangliosids GD3 69 3.1.1.5 Aufarbeitung von Gangliosidproben zur Gewinnung von 9-O-acetyl-GD3 70 3.1.2 Darstellung von GD3-7-al aus GD3 unter Verwendung von Natriumperjodat 71 3.2 Herstellung eines GD3-7-Aldehyd-spezifischen monoklonalen Antikörpers 73 3.2.1 Milzpräparation und Fusion 75 3.2.2 Entwicklung einer Screening-Methode für Hybridoma-Überstände 75 3.2.3 Vermehrung und Klonierung der produzierenden Zellen 77 3.2.4 Spezifität der Klone 77 3.2.5 Sensitivität der glycolipidspezifischen monoklonalen Antikörper 82 3.2.6 Nutzbarkeit des Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie 85 3.3 Apoptoseinduktion mit unterschiedlichen GD3-Derivaten an Molt-4-Zellen 86 3.4 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 88 3.5 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Materialien 89 3.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf verschiedenen Primatengeweben 89 3.5.2 Immunhistochemie mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf humanem Darmgewebe 92 3.5.3 GD3-Metabolite im Lipidextrakt verschiedener Tumorzelllinien 93 3.5.4 GD3-Metabolite in Tumorgeweben 95 3.5.5 Nachweis von GD3-7-Aldehyd in peripheren mononukleären Blutzellen 97 3.5.5.1 Identifizierung der GD3-7-Aldehyd-haltigen Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie 98 3.5.5.2 Untersuchung 6-Sulfo-LacNAc-dendritischer Zellen aus peripherem Blut auf das Vorkommen von GD3-7-Aldehyd 100 3.5.5.3 Untersuchung der von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) 101 3.5.5.4 Untersuchung von Granulozyten 103 3.5.5.5 Vorkommen von GD3 und GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von AML-Blasten 105 3.6 Untersuchung der Eignung von GD3-7-Aldehyd als mögliche Zielstruktur für eine immunologische Tumortherapie 107 3.6.1 Auswirkung von Bestrahlung und Wasserstoffperoxidinkubation auf die Ausprägung des 10C6 - Antigens auf der Oberfläche von AML-Blasten 107 3.6.2 Oxidation des Gangliosides GD3 auf der Oberfläche von Melanomzellen 108 3.6.3 Untersuchung der Ausprägung des 10C6-Antigens auf der Oberfläche von HEp-2-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 109 3.6.4 Untersuchung der Ausprägung von GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von SK-Mel-23-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 112 3.6.5 Nachweis der Einlagerung von GD3-7-Aldehyd in die Zellmembran von HL60-Zellen 114 3.6.5.1 Nachweis des integrierten GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit von der Zeit 115 4 DISKUSSION 117 4.1 Untersuchung von GD3-7-Aldehyd – der Weg vom Apoptosemediator zum Tumortarget 117 4.2 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 118 4.3 GD3-7-Aldehyd als Effektormolekül der mitochondrial vermittelten Apoptose 120 4.4 Gangliosidspezifische Antikörper 124 4.4.1 Immunogenität von nativen und modifizierten Gangliosiden 124 4.4.2 Auswahl antikörperproduzierender Zellklone mit neuem Screeningverfahren 127 4.4.3 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers 10C6 127 4.4.4 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers R24 128 4.4.5 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers M-T6004 129 4.4.6 Nutzbarkeit des monoklonalen Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie und die indirekte Immunfluoreszenz 129 4.5 Reaktive Sauerstoffspezies in biologischen Systemen 129 4.5.1 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 130 4.6 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Systemen 131 4.6.1 Gewebefärbungen 131 4.6.2 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in Tumorzellen 132 4.6.3 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd auf peripheren mononukleären Blutzellen 135 4.7 Tumortargeting mit GD3-7-Aldehyd 137 4.7.1 Untersuchung des Vorkommens von GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 137 4.7.2 Dekorationsversuche HL60 138 4.7.3 Einbau veränderter Sialinsäuren als Therapiemodell 138 4.8 Ausblick 141 5 ZUSAMMENFASSUNG 143 6 LITERATURVERZEICHNIS 147 ANHANG 159 Abkürzungen 159 Abbildungen 162 Tabellen 166 Danksagung 167 THESEN 168 ANLAGE 1 169 ANLAGE 2 170 / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that. The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde. Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives. In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Sphingolipide, Glycosphingolipide und Ganglioside 1 1.1.1 Biosynthese und Transport der Ganglioside 5 1.1.2 Biologische Funktionen und pathophysiologische Bedeutung der Ganglioside 10 1.2 Sialinsäuren 12 1.3 Das Disialogangliosid GD3 16 1.3.1 Vorkommen von GD3 16 1.3.2 Biologische Wirkungen von GD3 17 1.3.3 GD3 als Zielstruktur in der Tumortherapie 20 1.3.4 Modifikationen der Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.1 9-O-Acetylierung der terminalen Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.2 Oxidation der terminalen Sialinsäure von GD3 25 1.4 Zielstellung 27 2 MATERIAL UND METHODEN 28 2.1 Materialien 28 2.1.1 Biologische Materialien 28 2.1.1.1 Patientenproben 28 2.1.1.2 Versuchstiere 28 2.1.1.3 Zelllinien und Hybridome 28 2.1.2 Reagenzien, Antikörper und Enzyme 29 2.1.3 Chemikalien 31 2.1.4 Geräte und Hilfsmittel 32 2.2 Methoden 34 2.2.1 Zellkultur 34 2.2.1.1 Kulturmedien 34 2.2.1.2 Zellkulturtechnik 35 2.2.1.3 Zellernte der Suspensionszellen 35 2.2.1.4 Zellernte der adhärenten Zelllinien 35 2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 36 2.2.1.6 Kryokonservierung 36 2.2.1.7 Auftauen 37 2.2.1.8 Hybridomkultivierung 37 2.2.1.9 Kultur von AML Blasten 37 2.2.2 Durchflusszytometrie 37 2.2.2.1 Oberflächenfärbung von Zelllinien 38 2.2.2.2 Oberflächenfärbung von PBMC und Granulozyten 39 2.2.2.3 Intrazelluläre Färbung 39 2.2.2.4 Detektion reaktiver Sauerstoffspezies mittels DCFDA-Färbung 39 2.2.2.5 SubG1-Analyse 41 2.2.3 Aufarbeitung von Gangliosiden aus Zellen 41 2.2.3.1 Herstellung des Rohextraktes 42 2.2.3.2 Entsalzung des Extraktes an einer Reversed Phase Chromatographie-Säule 43 2.2.4 Dünnschichtchromatographie - HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie) 44 2.2.4.1 Detektion mit Orcinfärbung 44 2.2.4.2 Detektion mit Primulin - Färbung 45 2.2.4.3 Detektion mit Overlay - Immunfärbung 45 2.2.5 Isolation von Glycolipiden aus lyophilisierter Buttermilch 47 2.2.5.1 Herstellung des Rohextraktes 48 2.2.5.2 Entsalzung mittels Dialyse 49 2.2.5.3 Si60-Kieselgel-Chromatographie 49 2.2.5.4 DEAE-Ionenaustauschchromatographie 50 2.2.5.5. Entsalzung mit RP-Säule 51 2.2.5.6 HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) 51 2.2.6 Herstellung von GD3-7-Aldehyd aus GD3 52 2.2.6.1 Oxidation von Gangliosiden in situ auf HPTLC-Platten 52 2.2.6.2 Darstellung von GD3-7-Aldehyd unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und Eisen-II-clorid (Fenton Reaktion) 53 2.2.7 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen GD3-7-Aldehyd 53 2.2.7.1 Immunisierung der Mäuse 54 2.2.7.2 Vorbereitung der Myelomzellen 54 2.2.7.3 Präparation der Milzzellen 55 2.2.7.4 Fusion der Milz- und Myelomzellen 55 2.2.7.5 Selektion und Klonierung 56 2.2.7.5.1 Screening 56 2.2.7.5.2 Ermittlung der Spezifität 57 2.2.7.5.3 Bestimmung der Immunglobulinklasse und des Subtyps 57 2.2.8 Separation mononukleärer Zellen (PBMCs) und Granulozyten aus Vollblut 57 2.2.8.1 Isolation einzelner Leukozytenpopulationen mittels MACS Technologie 58 2.2.8.1.1 Positivselektion von Monozyten 58 2.2.8.1.2 Positivselektion von Slan-DCs mit M-DC8 58 2.2.9 Generierung und Maturierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten 59 2.2.10 Indirekte Immunfluoreszenz 60 2.2.10.1 Aufzentrifugieren von Suspensionszellen auf Objektträger 60 2.2.10.2 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen auf Objektträgern 60 2.2.10.3 Fluoreszenzfärbung von Zellen und Geweben auf Objektträgern 60 2.2.11 Immunhistochemische Färbung mit modifizierter ABC-Methode 61 2.2.12 Behandlung von HL60 mit GD3-7-Aldehyd 62 2.2.13 Inkubationsversuche von Molt-4 mit unterschiedlichen GD3-Derivaten 63 2.2.14 Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in HEp-2 durch UV-Bestrahlung 63 3 ERGEBNISSE 64 3.1 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 65 3.1.1 Isolation von GD3 und 9-O-acetyl-GD3 aus lyophilisierter Buttermilch 65 3.1.1.1 Reinigung des Rohextraktes über Si60-Kieselgelchromatographie 65 3.1.1.2 Reinigung des Glycolipidgemisches über DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatographie 66 3.1.1.3 Reinigung der Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 mittels High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 67 3.1.1.4 Quantifizierung des gewonnenen Gangliosids GD3 69 3.1.1.5 Aufarbeitung von Gangliosidproben zur Gewinnung von 9-O-acetyl-GD3 70 3.1.2 Darstellung von GD3-7-al aus GD3 unter Verwendung von Natriumperjodat 71 3.2 Herstellung eines GD3-7-Aldehyd-spezifischen monoklonalen Antikörpers 73 3.2.1 Milzpräparation und Fusion 75 3.2.2 Entwicklung einer Screening-Methode für Hybridoma-Überstände 75 3.2.3 Vermehrung und Klonierung der produzierenden Zellen 77 3.2.4 Spezifität der Klone 77 3.2.5 Sensitivität der glycolipidspezifischen monoklonalen Antikörper 82 3.2.6 Nutzbarkeit des Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie 85 3.3 Apoptoseinduktion mit unterschiedlichen GD3-Derivaten an Molt-4-Zellen 86 3.4 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 88 3.5 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Materialien 89 3.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf verschiedenen Primatengeweben 89 3.5.2 Immunhistochemie mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf humanem Darmgewebe 92 3.5.3 GD3-Metabolite im Lipidextrakt verschiedener Tumorzelllinien 93 3.5.4 GD3-Metabolite in Tumorgeweben 95 3.5.5 Nachweis von GD3-7-Aldehyd in peripheren mononukleären Blutzellen 97 3.5.5.1 Identifizierung der GD3-7-Aldehyd-haltigen Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie 98 3.5.5.2 Untersuchung 6-Sulfo-LacNAc-dendritischer Zellen aus peripherem Blut auf das Vorkommen von GD3-7-Aldehyd 100 3.5.5.3 Untersuchung der von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) 101 3.5.5.4 Untersuchung von Granulozyten 103 3.5.5.5 Vorkommen von GD3 und GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von AML-Blasten 105 3.6 Untersuchung der Eignung von GD3-7-Aldehyd als mögliche Zielstruktur für eine immunologische Tumortherapie 107 3.6.1 Auswirkung von Bestrahlung und Wasserstoffperoxidinkubation auf die Ausprägung des 10C6 - Antigens auf der Oberfläche von AML-Blasten 107 3.6.2 Oxidation des Gangliosides GD3 auf der Oberfläche von Melanomzellen 108 3.6.3 Untersuchung der Ausprägung des 10C6-Antigens auf der Oberfläche von HEp-2-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 109 3.6.4 Untersuchung der Ausprägung von GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von SK-Mel-23-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 112 3.6.5 Nachweis der Einlagerung von GD3-7-Aldehyd in die Zellmembran von HL60-Zellen 114 3.6.5.1 Nachweis des integrierten GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit von der Zeit 115 4 DISKUSSION 117 4.1 Untersuchung von GD3-7-Aldehyd – der Weg vom Apoptosemediator zum Tumortarget 117 4.2 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 118 4.3 GD3-7-Aldehyd als Effektormolekül der mitochondrial vermittelten Apoptose 120 4.4 Gangliosidspezifische Antikörper 124 4.4.1 Immunogenität von nativen und modifizierten Gangliosiden 124 4.4.2 Auswahl antikörperproduzierender Zellklone mit neuem Screeningverfahren 127 4.4.3 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers 10C6 127 4.4.4 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers R24 128 4.4.5 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers M-T6004 129 4.4.6 Nutzbarkeit des monoklonalen Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie und die indirekte Immunfluoreszenz 129 4.5 Reaktive Sauerstoffspezies in biologischen Systemen 129 4.5.1 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 130 4.6 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Systemen 131 4.6.1 Gewebefärbungen 131 4.6.2 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in Tumorzellen 132 4.6.3 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd auf peripheren mononukleären Blutzellen 135 4.7 Tumortargeting mit GD3-7-Aldehyd 137 4.7.1 Untersuchung des Vorkommens von GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 137 4.7.2 Dekorationsversuche HL60 138 4.7.3 Einbau veränderter Sialinsäuren als Therapiemodell 138 4.8 Ausblick 141 5 ZUSAMMENFASSUNG 143 6 LITERATURVERZEICHNIS 147 ANHANG 159 Abkürzungen 159 Abbildungen 162 Tabellen 166 Danksagung 167 THESEN 168 ANLAGE 1 169 ANLAGE 2 170

Les voies d’endocytose qui régissent l’internalisation d’éléments extracellulaires peuvent être classées selon que la protéine de manteau, la clathrine, est impliquée ou non dans le processus. Les voies indépendantes de la clathrine sont utilisées par de nombreuses toxines, des virus et des protéines endogènes. Les mécanismes permettant d’induire le recrutement des protéines cargoes et la déformation de la membrane plasmique dans le contexte de l'endocytose clathrine-indépendant restent encore mal compris. Cette étude montre que la galectine 3, une protéine humaine qui se lie aux glucides, induit la formation d’invaginations de la membrane plasmique de manière indépendante de la clathrine. Les glycosphingolipides (molécules jouant un rôle majeur dans la physiologie de la cellule) sont essentielles pour permettre à la galectine 3 d’induire ces invaginations et d’être internalisée dans la cellule. Les structures tubulaires induites par la galectine 3 présentent une morphologie étonnamment similaire à celle de compartiments intermédiaires de transport décrits dans la littérature pour l’endocytose indépendante de la clathrine. Des cargos utilisant la voie indépendante de la clathrine, tels que CD44 et les intégrines α5 et β1, sont retrouvés dans les tubules induits par la galectine 3. De plus, cette dernière est nécessaire à l’internalisation de CD44. Cela indique donc que la galectine 3 pourrait relier des protéines cargos glycosylés à des glycosphyngolipides de la membrane plasmique et ainsi induire une déformation de la membrane et leur internalisation dans les cellules. Ce mécanisme diffère de celui utilisé par la toxine pentamérique de Shiga et par la toxine cholérique, qui sont leur protéines cargos propores et interagissant directement avec le glycosphyngolipide leur servant de récepteur. Les tubules induits par la galectine 3 sont distincts de ceux induit par les autres lectines. Celles-ci présentent des spécificités différentes de liaison aux glucides, montrant ainsi la l'importance des interactions entre les lectines et les sucres dans ce processus. De plus, nous avons constaté que la galectine 3 module l’équilibre à l’état basal de l’intégrine β1 à la surface de la cellule. Cette protéine étant capitale pour les phénomènes d’adhésion et de migration cellulaires, nous avons donc exploré le rôle conjoint de la galectine 3 et des glycosphingolipides dans la migration cellulaire. La galectine 3 inhibe la migration des cellules humaines de carcinomes mammaires alors qu’elle stimule au contraire celle de cellules de tumeurs mammaires murines. Or, nous avons montré que la régulation par la galactine 3 de la migration de différentes lignées cellulaires est dépendante des glycosphingolipides. Il ressort donc de cette étude que la galectine 3 et les glycosphingolipides contribuent de manière synergique au processus d’induction de déformation de la membrane, à l’endocytose de protéines cargos et à la migration cellulaire. / Endocytic processes which govern the uptake of extracellular material into the cell can be classified based on their dependence on the coat protein, clathrin. Clathrin-independent mechanisms are used by many toxins, viruses and endogenous proteins. How cargo is recruited and membranes are bent is not well understood in these cases. Here, we discovered that galectin 3, a human carbohydrate binding protein induced the clathrin-independent formation of endocytic plasma membrane invaginations. Glycosphingolipids, which have established functions in key physiological processes, were found to be essential for the formation of galectin 3-induced invaginations and for the efficient uptake of the protein into the cell. Galectin 3-induced tubular structures were found to have a strikingly similar morphology to that of the clathrin-independent carriers described in literature. Clathrin-independent endocytic cargoes such as CD44, α5 and β1 integrin were present in galectin 3-induced tubules, and galectin activity and glycosphingolipids were required for the uptake of CD44. This indicated that galectin 3 could link glycosylated cargoes with glycosphingolipids for cargo recruitment and membrane bending. In contrast, the pentameric Shiga and cholera toxins are their own cargoes and drive membrane deformations by directly binding to their respective glycosphingolipid receptors. Galectin 3-induced tubules were distinct from those induced by lectins with different carbohydrate binding specificities, which revealed the importance of lectin-glycan interaction in this process. Further, we observed that galectin 3 modulated the steady state surface dynamics of β1 integrin, a protein which like CD44 is critical for cell adhesion and migration. Subsequently, we explored the interplay of galectins and glycosphingolipids in cell migration. Galectin 3 inhibited cell migration in human breast carcinoma cells, and stimulated migration in a mouse mammary tumor cell line. However, the regulation of migration by galectin 3 was in both cases found to be dependent on glycosphingolipids. In conclusion, galectin 3 and glycosphingolipids synergistically contribute to the clathrin-independent curvature generation process, cargo endocytosis and cell migration.

Glycosphingolipids (GSLs), composed of a polar saccharide head and a lipophilic ceramide tail, are ubiquitous components of the plasma membrane of eukaryotic cells. They serve in many regulatory capacities and have antigenic properties towards natural killer T (NKT) cells of the innate immune system. Critical to the recognition of glycosylceramides by NKT cells are antigen presenting cells (APC), such as dendritic cells, which are responsible for binding, processing, and delivery of ligands to these lymphocytes. This event is mediated by CD1d, a major histocompatibility complex-like protein expressed on the surface of APCs, which binds GSL antigens by the ceramide moiety and presents the polar group to the T cell receptors of CD1d-restricted cells. The subsequent immune response involves NKT cell proliferation and emission of numerous cytokines, such as interferon-gamma (IFN-gamma) and interleukin-4 (IL-4), resulting in the stimulation of the innate and adaptive immune systems through maturation of APCs, activation of T cells, and secretion of antibodies by B cells. To understand the structure-activity relationship between GSLs and NKT cell activity and the requirements for intracellular processing of antigens, analogs of the model compound alphaGalCer (KRN-7000) have been synthesized. These include fluorophore-appended 6”-amino-α-galactosylceramides and N-alkenoyl GSLs, such as PBS-57, a potent alphaGalCer surrogate useful in NKT cell stimulation studies. A nonantigenic beta-C-galactosylceramide has also been prepared as an inhibitor of these innate lymphocytes. To probe the potential for using NKT cells to bias the immune system between the proinflammatory TH1 response or the immunomodulatory TH2 mode, versions of alphaGalCer with shortened ceramides have been created. One of these truncated analogs, PBS-25, has successfully been cocrystallized with CD1d and the binary complex structure solved by X-ray crystallography. Synthetic glycosphingolipids derived from Novosphingobium capsulatum and Sphingomonas paucimobilis have also been made. In assays with classical Valpha14i/Valpha24i NKT cell lines, these Gram-negative bacterial antigens were recognized directly and specifically by host immune systems through CD1d-restriction, unlike GSL-deficient microbes (e.g., Salmonella typhimurium). A search for other GSL-bearing alpha-proteobacteria led to the discovery of another natural glycosphingolipid, an N-alkenoylphytosphingoid-alpha-galactoside, isolated from the outer membrane of Ehrlichia muris.