Une tumeur nécessite un approvisionnement en oxygène et en nutriments pour sa croissance mais aussi pour la dissémination à distance vers d’autres organes. L’angiogenèse tumorale est le phénomène exploité par la tumeur pour accomplir ses besoins. Les «Tip cells » situées à l’extrémité des capillaires en bourgeonnement initient et guident la croissance des néovaisseaux. Ces cellules sont considérées actuellement comme une cible thérapeutique pertinente pour les médicaments anti-angiogéniques. De nombreuses études ont permis d’identifier un cluster de marqueurs moléculaires exprimés de manière privilégiée au niveau des « Tip cells ». Un de ces marqueurs appelé endocan, a été identifié au laboratoire, et a fait objet du travail réalisé pendant la thèse. Endocan est un protéoglycane circulant surexprimé dans de nombreux cancers humains dont l’expression est fréquemment associée à un mauvais pronostic. Par son glycane, endocan intervient dans la croissance tumorale en augmentant l’effet des facteurs de croissance, mais aussi la migration des cellules endothéliales. Mon travail de thèse s’est orienté sur la caractérisation biochimique et fonctionnelle d’endocan murin afin d’avoir un modèle animal utile pour une meilleure compréhension de l’activité pro-tumorale d’endocan humain. Les travaux présentés dans ce manuscrit montrent qu’endocan murin est un protéoglycane de type chondroitine sulfate, mais partiellement glycosylé. Ce déficit de glycosylation est gouverné par des domaines peptiques distants codés par l’exon 1 et l’exon 2 et qui distinguent l’endocan murin de son homologue humain. Dans un modèle de xénogreffe tumorale chez la souris SCID, nous avons démontré qu’endocan murin ne présente aucun pouvoir pro-tumoral. Contrairement à l’endocan humain, il ralentit la vitesse de croissance tumorale. Cette propriété anti-tumorale est liée à la présence d’une forme non glycosylée. Nous avons pu montrer à travers plusieurs modèles de xénogreffes tumorales que cette propriété de freinage de la croissance tumorale s’étend aussi au core protéique d’endocan humain. De plus, nous avons pu démonter qu’une administration systémique d’endocan non glycosylé est significativement associée à un ralentissement de la croissance tumorale. Ceci établit la relation de causalité entre le polypeptide d’endocan et la propriété anti-tumorale observée dans les différents modèles animaux. Le polypeptide d’endocan ne modifie pas in vitro la prolifération ni la viabilité des cellules HT-29 ce qui laisse penser à un mécanisme d’action indirect. Sur le plan pathologique, nous avons montré que les formes non glycosylée d’endocan humain et murin sont associées à une réaction inflammatoire stromale constituée d’une infiltration pan-leucocytaire. La déplétion des leucocytes CD122+ (essentiellement les cellules NK murines) abolit partiellement l’effet anti-tumoral induit par l’endocan non glycosylé. Nos résultats ajoutent endocan au concert des molécules endothéliales tumorales qui participent au contrôle de la réaction inflammatoire stromale. / Solid tumor requires a supply of oxygen and nutrients for growth but also for metastasizing to another organ. Tumor angiogenesis is the phenomenon exploited by tumor to fulfill these needs. The"Tip cells" located at the end of sprouting capillaries initiate and guide the growth of neovessels. These cells are currently considered as an important therapeutic target for anti-angiogenic drugs. Many studies have identified a cluster of molecular markers selectively expressed by the \\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\"Tip cells.\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\" One of these markers called “endocan”, has represented the subject of the thesis work.Endocan is a circulating proteoglycan overexpressed in many human carcinomas, and expression is often associated with poor prognosis. It is suspected to play an important role in tumor development. Through its glycan chain, endocan modulates the effect of growth factors, and also the migration of endothelial cells. My thesis work has focused on the biochemical and functional characterization of mouse endocan in order to obtain a useful animal model for better understanding of the pro tumoral activity of human endocan. The work presented in this manuscript shows that mouse endocan is a chondroitin sulfate proteoglycan but much less glycanated than human endocan. Our data indicate that combinatorial distant domains from the O-glycanation site, located within exons 1 and 2 determine the glycanation pattern of endocan. In SCID mouse model of tumor xenograft we demonstrated that mouse endocan does not exhibit a pro tumoral activity. In opposite to the human homologue, overexpression of mouse endocan in HT-29 cells delayed the tumor appearance and reduced the tumor growth rate. This tumor growth inhibition was mostly supported by non glycanated mouse endocan. Unexpectedly, human non glycanated endocan overexpressed in HT-29, A549, or K1000 cells also delayed the tumor appearance and reduced the tumor growth. Moreover, systemic delivery of human non glycanated endocan also reproduced HT-29 tumor delay. In vitro, endocan polypeptide did not affect HT-29 cell proliferation, nor cell viability.Interestingly, a stromal inflammatory reaction was observed only in tumors overexpressing endocan polypeptide. In addition, depletion of CD122+ cells was able to delete partially the tumor delaying effect of endocan polypeptide. These results reveal a novel pathway for endocan in the control of tumor growth, which involves innate immune cells.

Ebolavirus (EBOV) est un filovirus responsable de fièvres hémorragiques virales sévères chez l’humain, qui peuvent être létales dans 90% des cas. L’actuelle épidémie en République Démocratique du Congo et l’ampleur démesurée de l'épidémie de 2014-2016 en Afrique de l’Ouest, qui a causé la mort de plus de 11 000 personnes, ont poussé les agences sanitaires internationales à tester plusieurs approches thérapeutiques afin d’essayer d’endiguer rapidement la propagation virale et de limiter la mortalité liée au virus lors de futures épidémies. Parmi toutes les stratégies testées, le virus recombinant réplicatif rVSV-ZEBOV qui exprime la glycoprotéine de surface d’EBOV, semble offrir la meilleur protection, aussi bien en modèle animaliers que sur le terrain. Avant d’être testé chez l’humain, de nombreuses études ont permis de mettre en évidence l’efficacité et l’innocuité de ce vaccin prototype. Pourtant et malgré le fait que de nombreuses études ont démontré l’importance et le rôle de la glycoprotéine GP dans l’efficacité des vaccins contre ce virus, aucune étude n’a encore été réalisé sur la nature des glycoprotéines virales synthétisées par le gène GP d’EBOV inséré dans le génome du virus VSV. Ainsi, les caractérisations moléculaires des protéines virales produites lors de l’infection par le virus rVSV-GP décrites dans ces travaux de thèse offrent de nouvelles perspectives pour comprendre le succès de ce vaccin mais aussi l’origine virales dans les effets secondaires sévères observés lors de la vaccination, et pourront aider à développer un vaccin plus sûr, qui n’est actuellement pas utilisable chez les personnes immunodéprimées / The filovirus Ebolavirus (EBOV) is the causative agent of severe viral hemorrhagic fevers in humans that can be lethal in 90% of cases. The current outbreak in the Democratic Republic of Congo and the extraordinary scale of the 2014-2016 outbreak in West Africa, that caused the death of more than 11 000 disease victims, lead the international public health agencies to test several therapeutic approach to limit viral spreading and mortality. Amongst those, the recombinant replication-competent rVSV-ZEBOV virus, that expressed EBOV GP glycoprotein, appears to offer the best protection in animal models and outbreak settings. While its effectiveness and safety have been widely investigated before human trials and despite numerous studies that showed the importance the nature of the glycoproteins which are produced during the infection from the EBOV GP gene that has been inserted in VSV genome are unknown. In this respect, the molecular characterisations of the viral glycoproteins synthesised during rVSV-GP presented in this thesis, offer new insights with which to understand the success of the rVSV-GP vaccine but also the potential viral origins of the severe adverse side effects observed during vaccination and could help in developing a safer vaccine, which currently cannot be used in an immunocompromised population

3,3'-Neotrehalosadiamine (NTD) is a diaminosugar that possesses a rare alpha,beta-1,1'-linked glycosidic bond and has been reported to possess antimicrobial activity against Staphylococcus aureus. The ntdABC operon contains three structural genes that are necessary for the production of NTD in certain mutants of Bacillus subtilis. The gene predicted to be the first in the NTD biosynthetic pathway, ntdC, was subcloned into pET-28b as the hexa-histidine tagged fusion. The gene product was expressed, purified to homogeneity, and found to be an NAD+-dependent glucose 6-phosphate 3-dehydrogenase, likely operating according to a ternary complex mechanism and possessing a catalytic dyad composed by D176 and H180. The advent of this knowledge suggests that additional genes are required for the biosynthesis of NTD aside from the three encoded by the ntdABC operon.

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Thesis advisor: Mary F. Roberts / As the central repository of biological information and ultimate mediator of all processes underlying the activities of living organisms, nucleic acids are the sine qua non for life as we know it. Biological research over the past century and more has revealed much of the structure and function of nucleic acids, revealing in turn how life begins, changes, reproduces, and ends. We glimpse how life has become what it is and perhaps what it may become. This work seeks to understand the ramifications of altering a single nitrogen of the purine nucleoside components of nucleic acids. As will be shown, purine analogs lacking the N3 nitrogen have altered interactions with proteins, water, and other molecules. Replacement of this nitrogen with a C-H, C-CH3, or C-CH2OH functionality impacts the structure and biological interactions of a DNA duplex containing these alterations in ways not entirely foreseen when this work began over ten years ago. The synthetic effort needed to obtain purine nucleosides containing each of these modifications is significant. Along the way, new methodologies applicable both to the synthesis of purine analogs and natural purine nucleosides are described. / Thesis (PhD) — Boston College, 2010. / Submitted to: Boston College. Graduate School of Arts and Sciences. / Discipline: Chemistry.

Longtemps considérée comme un simple support mécanique, la matrice extracellulaire (MEC) est un élément majeur dans le maintien de l’homéostasie. Ainsi l’élastine, principal constituant de la MEC des gros vaisseaux élastiques, est dégradée au cours du vieillissement, produisant ainsi des peptides d’élastine bioactifs (PE). Plusieurs études ont démontré l'implication des PE en physiopathologies tels que l’invasion tumorale, l’athérosclérose ou l’insulino-résistance (IRes). Ces effets s’expliquent par l’activation du complexe récepteur de l’élastine (CRE), composé par : une sous-unité extracellulaire liant les PE (EBP, elastin binding protein), la cathepsine A (dont le rôle reste inconnu), et la neuraminidase 1 (induisant la signalisation intracellulaire). L'IRes décrite, pourrait être associée à l’activité de désialylation de la neuraminidase-1 sur les chaines de N-glycosylation (Ng-c) du récepteur de l’insuline (RI). Sur la base de cette hypothèse, notre objectif a donc été de confirmer ce mécanisme et ses conséquences in silico (sur le RI), in vitro (pré-adipocytes 3T3-L1) et in vivo (aorte de souris). Nous montrons ainsi in vitro que les PE provoquent un dysfonctionnement de l’autophosphorylation du RI se répercutant sur plusieurs processus cellulaires comme l’entrée du glucose ou encore la différenciation adipocytaire. In silico, nous montrons pour la première fois le rôle des acides sialiques sur le comportement des Ng-c d'une part et sur le RI d'autre part. Enfin, in vivo, cette interaction CRE / IR engendre une hypertension artérielle par une diminution de la vasorelaxation des cellules endothéliales. / Often considered as a simple mechanical support, the extracellular matrix (ECM) is a major element of homeostasis regulation. Thus, elastin, the main constituent of large elastic vessels, is degraded during aging, producing bioactive elastin-derived-peptides (EDP). Several studies have demonstrated the EDP effects in physiopathologies such as tumor invasion, atherosclerosis, or insulin resistance (IRes) development. Those effects are explained by the activation of the elastin receptor complex (CRE), composed of: an extracellular subunit binding EDP (EBP, elastin binding protein), cathepsin A (its role is still unknown) and the sialidase neuraminidase-1 (Neu-1, involved in signaling pathway induction). Interestingly, the lab suggested that IRes may be induced by the desialylation of the N-glycan chains (Ng-c) on the insulin receptor (IR). The aim of this study was to confirm this hypothesis by demonstrating the consequence of desialylation on the IR in silico, on a 3T3-L1 pre-adipocyte cell in vitro, and on vascular complications in vivo. We show that EDP induce in vitro an impairment of IR autophosphorylation, affecting glucose uptake and adipocyte differentiation. In silico approach demonstrates the role of sialic acids on the behavior of Ng-c in the one hand and in other hand of IR. Finally, the IRes induced by ERC-IR interaction increase the vascular complication such as arterial hypertension by endothelial cell impairment. To conclude, Ng-c alteration would likely be responsible for structural changes in the IR at the origin of insulin resistance.

Les interfaces permettant le couplage entre l'électrophorèse capillaire (CE) et la spectrométrie de masse (MS) à source ESI souffrent actuellement d'un manque de robustesse ou de sensibilité. Les travaux présentés décrivent la mise en oeuvre d'un nouveau type d'interface CE-ESl-MS â haute sensibilité CESl-MS. La caractérisation du spray généré par CESl-MS a montré la production d'un nanoESI induisant une augmentation importante de la sensibilité par rapport au régime ESI classique. Le système CESl-MS a pu ainsi être mis en oeuvre comme plateforme d'infusion nanoESI et utilisé pour l'étude de complexes non-covalents de haut poids moléculaires en MS native. Une méthodologie par CESl-MS/MS a également été développée pour la caractérisation complète de la structure primaire d'anticorps monoclonaux (mAbs). Les résultats montrent la possibilité en une unique injection de caractériser l'ensemble de la séquence d'acides aminés, un nombre significatif de glycosylations et l'ensemble des modifications d'intérêts. Cette méthodologie a pu être appliquée pour déterminer la similarité entre des mAbs commerciaux et leur candidat biosimilaire respectif. / Interfacings allowing the hyphenation of capillary electrophoresis (CE) to ESI mass spectrometry(MS) currently suffer from lack of robustness and sensitivity. This work describes the application of a new design of CE-ESl-MS coupling referred as the CESl-MS. Characterization of the ESI generated through the CESl-MS system showed the production of a nanoESI allowing to increase drastically the sensitivity compared to conventional ESI. The CESl-MS was used as a nanoESI infusion platform allowing to study high molecular masses noncovalent complexes in native MS. A CESl-MS/MS method was developed enabling the complete primary structure characterization o fmonoclonal antibodies (mAbs). Results showed the ability of the methodology in a single injection to simultaneously characterize the entire amino acid sequence, a significant number of glycosylation and all the posttranslational modifications of interest. Finally the methodotogy was applied to assess the similarity between marketed mAbs and their respective biosimilar candidate.

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des glycoprotéines complexes possédant de nombreuses micro-hétérogénéités qui peuvent influencer leur efficacité dans l’organisme. Il est par conséquent nécessaire de développer des méthodes analytiques robustes, sensibles et spécifiques pour les caractériser avec la plus grande précision. L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes analytiques permettant la caractérisation fine et à différents niveaux d’un anticorps monoclonal, le cetuximab, ainsi qu’un anticorps monoclonal conjugués à un principe actif, le brentuximab vedotin, sur des couplages direct ou indirect de l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse. Dans une première partie, une approche middle-up protéomique du cetuximab a été réalisé sur le couplage indirect CZE-UV/MALDI-MS afin de séparer et caractériser les variants de charges du fragment F/2 et F(ab)’2 ainsi que la caractérisation top-down des fragments Fc/2. Ensuite une nouvelle stratégie indirecte CZE-UV/nanoESI-MS a été développée pour permettre la caractérisation fine de ce mAbs partiellement digéré. Enfin un couplage direct par CESI-MS a été développé pour permettre l’analyse rapide et précise du cetuximab middle-up. Dans une deuxième partie, la combinaison d’analyse de mAbs d’intact, middle-up et bottom-up protéomique a été réalisée sur le couplage CZE-UV/nanoESI-MS et CESI-MS. Cela a permis la caractérisation à différent niveau du brentuximab vedotin. Cette méthodologie a permis l’analyse du DAR, l’identification de fragments conjugués, la caractérisation simultanée de la séquence complète de l’anticorps, d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, la caractérisation des peptides conjugués ainsi que l’identification d’ions diagnostiques du principe actif. / Monoclonal antibodies (mAbs) are highly complex glycoproteins having a lot of micro-heterogeneities which can influence their effectiveness. As a consequence, it is necessary to develop robust analytical methods, sensitive and specific to characterize them with high accuracy. The purpose of this thesis was to develop analytical methods allowing the multi-level characterization of monoclonal antibody (cetuximab), and antibody drug conjugates (brentuximab vedotin), using on-online or off-line capillary electrophoresis – mass spectrometry coupling. In the first section, a middle-up proteomic approach of cetuximab was carried out using Off-line CZE-UV/MALDI-MS coupling to separate and to characterize Fc/2 and F(ab)’2 charge variants. A top-down characterization of Fc/2 fragments was also employed. Then a new strategy off-line CZE-UV/nanoESI-MS was used to allow the characterization of this partially digest mAbs. Finally, an online coupling by CESI-MS was developed to allow the fast and accurate analysis of middle-up cetuximab. In a second part, the combination of intact, middle-up and bottom-up proteomic carried out on CZE-UV/nanoESI-MS and CESI coupling allowed the most exhaustive characterization of brentuximab vedotin. This methodology allowed the analyze of DAR, the identification of fragments drug conjugates, the simultaneous characterization of the complete structure of antibody, a significant number of post-translational modifications, all peptides drug conjugates and the identification of diagnostic ions.