Impairment of the cholinergic neurotransmission system is regularly detected in animal models of Alzheimer's disease as well as in human patients suffering from this serious disease. Moreover, there is increasing amount of evidence suggesting that activation of individual mAChR subtypes specifically influences the cleavage of APP, the precursor for β-amyloid. APP can be processed in an amyloidogenic or non-amyloidogenic pathway and a relative abundance of these patways contributes to establishing the final concentration of neurotoxic β-amyloid in the brain. In this work, I have studied the acute and chronic effects of A β1-42 on binding and functional characteristics of mAChR. I have demonstrated that Aβ1-42 present in cell culture expressing the individual subtypes of mAChR negatively and specifically influences the function of the M1 mAChR subtype. I have also detected a decline in muscarinic receptor-mediated signal transduction in brain tissue of young adult APPswe/PS1dE9 mice, a commonly used animal model of Alzheimer's disease. Demonstration of the impairment of muscarinic transmissin in transgenic mice by soluble β-amyloid that occurs earlier than amyloid pathology and behavioral deficit, and its imitation by soluble Aβ1-42 in vitro lend strong support to the notion of the early involvement...

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par une accumulation anormale de lymphocytes B matures. Les thérapies actuelles reposent sur l'utilisation d'inhibiteurs ciblant les kinases impliquées dans la voie du récepteur des cellules B (BCR), mais elles sont limitées par le niveau élevé de résistance à l’apoptose des cellules leucémiques. En effet, celles-ci échouent à éradiquer les cellules résistantes à l'apoptose, il est donc essentiel d'identifier d'autres voies de survie comme nouvelles cibles pour les thérapies anticancéreuses. La surexpression des récepteurs de surface couplés aux protéines G (RCPGs) entraîne une transformation cellulaire et joue ainsi un rôle essentiel dans les tumeurs malignes. Dans cette étude, nous montrons que le récepteur de la neurotensine de type 2 (NTSR2), un récepteur couplé aux protéines G, est un acteur essentiel dans les mécanismes de résistance à l'apoptose dans les cellules leucémiques. Le récepteur NTSR2 est surexprimé et constitutivement actif dans les cellules leucémiques, son activation dépend de son interaction avec le récepteur TrkB (Tropomyosin-related kinase B) et du recrutement des protéines Giα à la place de son interaction avec son ligand naturel, la neurotensine (NTS). L'interaction NTSR2-TrkB agit comme un oncogène conditionnel nécessitant le BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), le ligand de TrkB, qui est fortement exprimé dans les cellules B leucémiques, contrairement à son ligand naturel la NTS. L'interaction NTSR2-TrkB active les voies de signalisation de survie, y compris les voies de Src et Akt, ainsi que l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) et Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large). Néanmoins le récepteur TrkB seul ne protège pas les cellules B leucémiques d'une diminution drastique de la viabilité par apoptose lorsque NTSR2 est inactivé. L’ensemble de ces résultats suggèrent que l'interaction NTSR2-TrKB et l'activation soutenue des voies de signalisation dépendante de cette interaction constituent un mécanisme essentiel d’échappement à l'apoptose des cellules B leucémiques. Le ciblage du récepteur NTSR2 représente une stratégie prometteuse pour le traitement de cette pathologie. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the abnormal accumulation of mature B lymphocytes. Current therapies for CLL rely on using kinase inhibitors targeting B-cell receptor (BCR) pathways, but they are limited by the high level of apoptosis-resistant B-CLL cells, which results in a high frequency of patient relapse. Because current therapies fail to eradicate these apoptosis-resistant cells, it is essential to identify alternative survival pathways as novel targets for anticancer therapies. Overexpression of cell-surface G protein-coupled receptors (GPCRs) drives cell transformation, and thus plays a critical role in malignancies. In this study, we show that neurotensin receptor 2 (NTSR2), a G-protein-coupled receptor, is an essential driver of apoptosis resistance in B-CLL. NTSR2 was highly expressed and constitutively active in B-CLL cells, and its activation depended on its interaction with the tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) and the recruitment of Gi proteins, instead of its interaction with its natural ligand, neurotensin (NTS). The NTSR2-TrkB interaction acted as a conditional oncogenic driver requiring the TrkB ligand BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), which is highly expressed in B-CLL cells, unlike its natural ligand NTS. The NTSR2-TrkB interaction activates survival signaling pathways, including the Src and AKT kinase pathways, as well as expression of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) and Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large). TrkB failed to protect B-CLL cells from a drastic decrease in viability via typical apoptotic cell death when NTSR2 was down-regulated. Taken together, the results suggest that the NTSR2-TrKB interaction and the sustained activation of signaling pathways reliant on this interaction constitute an essential driving force for apoptosis evasion of B-CLL cells. Targeting NTSR2 could represent a promising strategy for treating B-CLL malignancy.

La plus grande famille de récepteurs membranaires est constituée par des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG). Ces récepteurs sont impliqués dans un grand nombre de réponses cellulaires physiologiques et pathologiques et représentent la ciblé de une grande majorité des produits thérapeutiques. La fonction d’un récepteur est déterminée par la quantité de récepteur fonctionnel à la surface cellulaire, qui dépend de différents paramètres comme le niveau de biosynthèse, l’export vers la surface cellulaire à partir de stocks intracellulaires, l’endocytose et les modifications post-transcriptionelles (ex. phosphorylation). Le nouveau concept d’export régulé pour les RCPG présent l’importance physiologique de la rétention de récepteurs, leur relargage, leur interaction avec les partenaires chaperonnes et les escortes. Les études présentées ici concernent les mécanismes d’export régulé de deux RCPG, le récepteur métabotropique de l’acide γ-amino butyrique (GABAB) et le récepteur de chimiokines CC 5 (CCR5). GABAB est un récepteur constitué de deux sous-unités GB1 et GB2 et CCR5 est probablement un homo-dimer. GB1 ainsi que CCR sont retenus dans des compartiments intracellulaire (RE et appareil Golgi) d’où ils sont relâchés en réponse à un signal extern (CCR5) ou/et en interagissant avec protéines d’escorte (comme CD4 pour CCR5 et GB2 pour GB1). L’objectif de ces études était de comprendre le mécanisme de rétention de ces récepteurs et leur régulation. Dans ce contexte, nous avons déterminé en utilisant des approches biophysiques et biochimiques que ces récepteurs interagissent de façon spécifique avec les membres de Prenylated Rab Acceptors Family (PRAF). Ces protéines sont résidentes dans le RE (PRAF2 et PRAF3) et dans le appareil Golgi (PRAF1) où elles fonctionnent comme de gatekeepers pour les récepteurs. Nous avons pu démontrer que PRAF2 interagie de manière spécifique avec des motifs de rétention connus pour leur implication dans la rétention de récepteurs. Cette interaction détermine une rétention au niveau de RE donc régule de façon négatif l’export vers la membrane cellulaire. Dans le cas de récepteur GABAB, l’interaction de GB2 avec GB1 permet la libération de GB1 de sa rétention par PRAF2 par simple compétition. La modification de l’équilibre stoichiométrique entre les gatekeepers PRAF et les protéines d’escorte pour les récepteurs induit des modifications de la fonction du récepteur in vitro et in vivo. Les PRAFs sont ubiquitaires et peuvent interagir avec plusieurs RCPG représentant dans ce cas des régulateurs majors de la fonction de RCPG dans des conditions physiologiques et pathologiques. / The largest family of membrane receptors is constituted by conserved seven-membrane domain spanning receptors, the G-protein coupled receptors (GPCRs). They are involved in numerous cell responses and diseases thus being a major drug target. Receptor function is determined by the amount of active receptors at the cell surface, which depends on various parameters, such as the biosynthetic rate, the export to the cell surface from internal stores, the endocytosis and post-transcriptional modifications (i.e. phosphorylation). Only recently, the importance of the regulated export has emerged, shedding new light on the physiological role of receptor retention, release, chaperoning and escorting. This work concerns the regulated export mechanisms of two members of the GPCRs family, the chemokine receptor 5 (CCR5) and the metabotropic receptor of the g amino butyric acid (GABAB). Whereas CCR5 is likely a homo-dimer of 2 identical protomers, GABAB is an obligatory hetero-dimer of 2 distinct subunit known as GB1 and GB2. Both CCR5 and GB1 are retained in intracellular compartments (the ER and the Golgi) from which they are released in response to external signals (CCR5) and/or interaction with “private escort proteins” (CD4 for CCR5 and GB2 for GB1). The main goal of our work was to understand the mechanism of retention of these receptors and its regulation. In this context, we determined using biochemical and biophysical approaches that these GPCRs specifically interact with the members of the Prenylated Rab Acceptor Family (PRAF). These proteins are resident either in the ER (PRAF2 and PRAF3) or in the Golgi apparatus (PRAF1) where they function as receptor gatekeepers. Indeed, we could document for PRAF2 that this protein likely interacts directly with previously identified receptor retention motifs and inhibits receptor egress from the ER and subsequent trafficking to the plasma membrane. In the context of the GABAB receptor, PRAF2-dependent retention of GB1 can be overridden by GB2 via simple competition. Perturbing the stoichiometry of PRAF gatekeepers respective to that of receptors significantly perturbs receptor function both in vitro and in vivo. Because PRAFs are ubiquitous and seem to interact with many other GPCRs, they might represent major regulators of receptor function both in physiological and pathological conditions.

Mon laboratoire d’accueil avait montré que la densité de CCR5 à la surface des cellules cibles du VIH détermine très fortement leur infectabilité par les souches virales R5, et que les signaux d’activation cellulaire induits par la fixation virale et transitant par CCR5 favorisent une infection productive des cellules primaires. L’hypothèse de notre travail était que d’autres récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) exprimés dans les lymphocytes T CD4+ CCR5+ pourraient également influer sur le cycle de réplication des virus R5. Pour tester cette hypothèse, les RCPGs co-exprimés avec CCR5 dans les cellules T CD4+ ont été identifiés, puis la capacité des plus exprimés d’entre eux à s’hétérodimériser avec CCR5 et à perturber l’infection par le VIH a été déterminée. Au cours de cette thèse, j’ai initié l’étude de deux de ces récepteurs, EBI2 et A2A, et j'ai participé à l’étude d’un troisième, S1P1.J’ai montré que la présence d’EBI2 ou d’A2A qui chacun s’hétérodimérise avec CCR5, augmente la production virale dans des cellules HOS ou MT4, comme c’est le cas pour S1P1. Étudiant les changements au niveau des étapes du cycle viral provoqués par l’expression ou la stimulation de ces RCPGS, j’ai mis en évidence que le principal effet est une augmentation de la transcription virale. De plus, nous avons montré que la signalisation via S1P1 active le facteur de transcription NFKB et par là le promoteur du VIH. De plus, la stimulation de ce récepteur dans un modèle de cellules infectées de façon latente permet la réactivation du virus. Ce résultat ouvre la possibilité de tester la capacité d’agonistes de S1P1 à éliminer les cellules servant de réservoir chez les personnes vivant avec le VIH. / It was shown in the laboratory that CCR5 density at the surface of primary CD4+ T cells strongly determines their R5 HIV-1 productive infectability. This is due to the fact that viral envelope - CCR5 interaction triggers signals that boost the viral life cycle. Our working hypothesis was that other G-protein coupled receptors (GPCR) co-expressed with CCR5 might also modulate HIV replicative cycle. To test this hypothesis, the GPCR coexpressed with CCR5 in CD4+ T cells have been identified, and the ability of the most highly expressed of them to dimerize with CCR5 and to interfere with the infection has been determined. During this thesis, I have initiated the study of two of these GPCR, EBI2 and A2A, and participated in the study of another one, S1P1.I have shown that the presence of EBI2 or A2A that each heterodimerize with CCR5, boosts the viral production in HOS and MT4 cells, similarly to S1P1. Analyzing the stages of HIV life cycle modified by the expression and triggering of these GPCR, I unveiled that the major effect was an increase in HIV genome transcription. Furthermore, we have shown that S1P1 signaling activates the transcription factor NFKB and thereby the HIV promoter. Moreover, triggering S1P1 in an in vitro model of HIV reservoir cells results in the reversion of the viral latency. These findings suggest that S1P1 agonists might be used as latency reversing agents to purge the HIV reservoir.

GASP1 modulerait le trafic intracellulaire des RCPG après endocytose provoquée par les ligands. Au cours de ce travail nous nous sommes focalisés sur l’interaction de GASP-1 avec le récepteur beta2-adrénergique (B2AR) et ses conséquences fonctionnelles. Les agonistes du récepteur B2AR sont des bronchodilatateurs puissants utilisés dans le traitement de l’asthme. Avec le Dr N. Frossard, nous avons montré qu'un traitement chronique avec un agoniste B2AR induit le développement d'une hyper-réactivitée bronchique chez les souris sauvages mais pas chez les KO GASP1. Ce phénotype n’est pas relié à une différence dans la dégradation du récepteur B2AR entre les souris sauvages et KO GASP-1 mais est corrélé avec une augmentation du niveau de collagène dans les poumons des souris sauvages. Nos résultats indiquent que GASP1 joue un rôle important dans ce phénomène adaptatif qui serait relié à un remaniement des tissus bronchiques dépendant de cette protéine. / GASP1 have been shown to modulate the postendocytic sorting of different GPCRs.In order to better understand the role of GASP1 in regulating the activity and intracellular traffic king of GPCRs, we have focused our project on the functional consequences of the interaction between GASP1 and beta2-adrenergic receptor (B2AR). B2AR agonists are potent bronchodilators used in the treatment of asthma. With Dr. N. Frossard, we have shown that achronic treatment with a B2AR agonist induces the development of bronchial hyperresponsiveness in wild-type but not in KO GASP1 mice. Furthermore, we have shown that this phenotype is not related to a difference of B2AR receptor degradation between wild type and KO animals but correlates with an increase in collagen levels in the lungs of wild type mice that is not observed in GASP1KO animals. Altogether, our data suggest thatGASP1 is critically involved in these adaptations, which could be related to a GASP1-dependent modification of lung tissues.

La dilution isotopique, SID pour « Stable Isotope Dilution », est une méthode largement utilisée pour la quantification de peptides et protéines en spectrométrie de masse, généralement associée aux techniques d’ionisation ambiante. Les travaux de cette thèse sont donc consacrés à l’application de la méthodologie de la dilution isotopique (SID) en spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) pour la mesure d’interaction récepteur/ligand en pharmacologie. En effet, un nombre important de pathologies mettent en jeu des récepteurs membranaires tels que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en interaction avec différents ligands, souvent peptidiques. En particulier, le récepteur V1A est impliqué dans l’activité vasoconstrictrice de l’hormone peptidique AVP (Arginine VasoPressine) et la contraction de cellules musculaires ainsi que dans certains comportements sociaux. Ce récepteur a été choisi comme modèle d’étude nécessitant le marquage par voie chimique du ligand Homo-HO-LVA (pour « Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist »), sélectionné pour sa forte affinité envers le récepteur V1A afin d’introduire l’entité permettant le dosage en SID/MALDI. Cette méthodologie est mise en œuvre via la génération d’une liaison covalente de la matrice HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid), couramment utilisée pour l’analyse peptidique pour obtenir le peptide modifié (JMV4854) par acylation en position N-terminale. Le but est alors de tirer profit de l’utilisation conjointe de ce marquage et de la matrice neutre HCCE (4-hydroxy-α-cyanocinnamate de méthyle) pour la détection spécifique et sensible de composés jusqu’à des concentrations picomolaires. L’étape stratégique de quantification par dilution isotopique nécessite un étalonnage et une validation statistique avant de pouvoir passer à l’application pharmacologique. Celle-ci consiste à mesurer l’affinité du JMV4854 pour le récepteur V1A par des expériences thermodynamiques de mesure de constantes de dissociation (Kd) afin de déterminer par la suite des constantes de dissociation de molécules non marquées via des expériences de compétition. Un second modèle de récepteur, le CCKB-R (cholecystokinine B receptor), a ensuite été étudié pour valider la méthodologie de quantification. Devant le regain d’intérêt des laboratoires pharmaceutiques pour les expériences cinétiques de mesure de constantes de dissociation, il serait intéressant d’y appliquer cette méthodologie. Celle-ci présente un potentiel intéressant en tant qu’alternative aux méthodologies actuellement incontournables que sont la radioactivité et la fluorescence. Un second d’axe d’étude a été initié avec un marquage conçu pour diriger la fragmentation de peptides pour des mesures en spectrométrie de masse en tandem par ionisation Electrospray (ESI-MS/MS). Des modifications par introduction en position N-terminale des peptides d’une charge fixe ont été envisagées. Des études préliminaires (synthèse d’ions préformés par incorporation d’une entité pyridinium) ont montré un comportement prometteur en fragmentation ouvrant de nouvelles perspectives de quantification. / The SID methodology, for Stable Isotope Dilution, is a widely applied methodology for peptides and proteins analysis in mass spectrometry, usually associated with atmospheric pressure ionisation techniques. This thesis is consequently devoted to the application of SID methodology in matrix assisted laser desorption/ionisation (MALDI) mass spectrometry to quantify receptor/ligand interaction in pharmacology. Indeed, a great number of pathologies involve membrane receptors like G protein coupled receptors (GPCR) in interaction with several ligands, frequently peptides. Particularly, the V1A receptor, is related to vasoconstriction activity of the peptide hormone AVP (arginine vasopressine) and contraction of muscular cells as well as many social behaviors. This receptor was chosen as model, requiring the chemical labelling of the ligand Homo-HO-LVA (Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist), selected for its high affinity towards the V1A receptor in order to introduce the entity on which relies the quantification in SID/MALDI. This methodology is applied through the covalent binding of HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid) matrix, usually encountered in peptide analysis, to obtain the modified peptide (JMV4854) through N-terminal acylation. The objective is to take advantage of the use of both HCCA tagging and HCCE (4-hydroxy-α-cinnamic methyl ester) matrix for the specific and sensitive detection of compounds down to picomolar concentrations. Importantly, quantification with SID requires a calibration protocol and a statistical validation before pharmacological assays. This consists in the measurement of JMV4854 affinity towards V1A-R through thermodynamic experiments in order to quantify the dissociation constant (Kd) and determine afterwards constants for untagged molecules by competitive binding assays. Furthermore, a second receptor model, CCKB-R (cholecystokinine B receptor), was then studied to validate the quantification methodology. Facing the renewed interest in pharmaceutic industry of kinetic experiments for dissociation constant measurement, it would be interesting to apply this new methodology to drug discovery, representing a relevant alternative to current “gold-standard” methodologies such as radioactivity and fluorescence. A second field of research has been initiated with a covalent labelling designed to enhance peptide fragmentation for electrospray-based (ESI-MS/MS) tandem mass spectrometry measurements. Preliminary studies with the synthesis of pre-formed ions like N-terminal substitution with pyridinium entities gave very promising results opening the way of other quantification strategies.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), constituent la plus grande famille de protéines membranaires dans le génome humain. Les RCPGs sont des protéines de signalisation, qui exercent leur action à la surface des cellules, en réponse à une grande variété de stimuli extérieurs. Ils jouent un rôle primordial dans de nombreuses fonctions physiologiques et sont donc impliqués dans une multitude de pathologies comme les maladies cardiovasculaires, métaboliques, neurodégénératives, psychiatriques et oncologiques. L'attribution du prix Nobel de chimie 2012 aux professeurs Robert Lefkowitz et Brian Kobilka pour leurs travaux et avancées spectaculaires dans le champ de recherches des RCPGs, souligne encore leur importance. Les RCPGs constituent également la plus importante cible thérapeutique, avec 30% des médicaments actuellement disponibles sur le marché qui exercent leur action via un RCPG. Cependant, la découverte de nouveaux ligands reste un chalenge. Le but est de développer des approches basées sur la RMN à l’état liquide, qui auront un impact positif sur la recherche de ligand de RCPGs, grâce à l’étude et la caractérisation de récepteur pleine taille, solubilisés en micelles de détergents ou enchâssés en bicouches lipidiques natives / G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of membrane proteins in the human genome. GPCRs act as cell surface signalling proteins and respond to a variety of external signals. They play a pivotal role in many physiological functions and are therefore associated with a multitude of diseases, including cardiovascular, metabolic, neurodegenerative, psychiatric, and oncologic diseases. The 2012 noble Prize in Chemistry was awarded jointly to Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka for studies of GPCRs, highlighting the importance of this protein superfamily. GPCRs constitute also the most important family of drug targets in the human body, with 30% of current drugs acting on GPCRs. However, drug discovery targeting GPCRs remains difficult, owing to the restricted structural information on GPCRs related to the instability of these proteins when isolated from their cell membrane environments. There is also a lack of knowledge for the structural and functional consequences of the interactions of small-molecule compounds with GPCR. The aim is to develop methods to study and characterize a full GPCR solubilized in detergents or in native lipid bilayers, both in its free form and in small molecule bound forms, using liquid-state NMR experiments. The aim is to develop NMR-based approaches that will strongly impact the structure-based drug discovery process for the GPCR family

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors 34 (GPR34) in Mikroglia untersucht. Dieser Rezeptor weist eine hohe Expression auf Gliazellen auf, jedoch ist über dessen Aufgabe innerhalb dieser Zellpopulation bisher nichts bekannt. In bisherigen Arbeiten wurde dem GPR34 eine Rolle in der Immunantwort zugeschrieben. Knock-out (ko)-Mäuse, welche mit Cryptococcus neoformans infiziert wurden, zeigten im Vergleich zum infizierten Wildtyp (wt) eine deutlich höhere Pathogenlast in verschiedenen Geweben u.a. im Gehirn, was für eine inadäquate Immunantwort spricht. In dieser Arbeit konnte mittels morphologischer Studien gezeigt werden, dass eine GPR34- Defizienz zu einer veränderten Gestalt der Mikroglia im Cortex sowie der Retina führt. Mikrogliazellen aus ko-Mäusen sind kleiner und deutlich weniger ramifiziert. Mit Hilfe von Transkriptomanalysen wurde eine große Vielfalt an unterschiedlich exprimierten Genen zwischen ko- und wt-Tieren identifiziert. Hierunter befanden sich Gene, die die Motilität, aber auch die Phagozytose der Mikroglia beeinflussen. Um den Einfluss der GPR34-Defizienz auf diese Vorgänge zu untersuchen, wurden zahlreiche funktionelle Untersuchungen an murinen Mikrogliazellen durchgeführt. Mittels basalen Motilitätsstudien aber auch unter Stimulation durch Laserläsion und Läsion des entorhinalen Cortex konnten keine Unterschiede in der Beweglichkeit von Mikroglia aufgedeckt werden. Jedoch zeigten ko- Mikrogliazellen des Cortex und der Retina eine deutlich geringere Phagozytoseaktivität. Dies ist ein möglicher Erklärungsansatz für die beschriebene erhöhte Pathogenlast in den GPR34- defizienten Tieren. Da die Phagozytoseaktivität von Mikroglia in neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose oder der Alzheimer´schen Demenz eine bedeutende Rolle spielt, sollte zukünftig die Relevanz des GPR34 bei diesen Erkrankungen untersucht werden.

Die meisten membranständigen Rezeptoren in Säugetieren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Sie sind entscheidend beteiligt an der Verarbeitung von sensorischen Reizen, an der Wirkung von Signalmolekülen, an Zellwachstum, Zellreifung und Entzündungsprozessen. Dennoch sind für viele GPCR die molekularen und auch physiologischen Funktionen nicht bekannt. Die Erforschung dieser Rezeptorproteine ist von großer medizinischer Relevanz, da deren Fehlfunktion eine mögliche Ursache für Krankheiten ist und sich GPCR häufig als pharmakologische Zielmoleküle eignen. Mit 33 Mitgliedern bilden die Adhesion GPCR die zweitgrößte Klasse von GPCR im Menschen, die bisher allerdings am wenigsten erforscht wurde. Sie sind bedeutsam für das Immunsystem, die zelluläre Organisation während der Embryonalentwicklung, die Angiogenese und die Entstehung von Tumoren. Adhesion GPCR besitzen im Transmembranbereich die typische Struktur von GPCR, unterscheiden sich jedoch von klassischen GPCR aufgrund ihrer sehr großen und komplexen N Termini. Die Frage, ob diese Rezeptorfamilie funktionell an G-Proteine koppelt, blieb lange unbeantwortet. Für einige wenige Rezeptoren der Subfamilie wurde die Bindung von Liganden beschrieben, dennoch fehlt für diese bisher der Beweis einer Rezeptoraktivierung. Unsere Arbeitsgruppe konnte zum ersten Mal eine Gαs vermittelte Adenylylcyclase (AC) Aktivierung durch den Adhesion GPCR GPR133 zeigen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden in dieser Arbeit die Signalkopplungswege der drei Adhesion GPCR GPR126, GPR56 und CD97 mittels verschiedener in vitro Methoden untersucht, um eine G-Protein-vermittelte Kopplung zu beweisen und weiter zu spezifizieren. Eine Grundlage bildeten die erfolgreiche Entwicklung einer Klonierungsstrategie und der Nachweis einer suffizienten Expression der Adhesion GPCR sowohl intrazellulär, als auch an der Membran. Durch die N-terminale Integration eines Rhodopsin Epitops gelang eine Steigerung der Zellmembranexpression für GPR126 und GPR56. Weiterhin wurden eine funktionelle Kopplung von GPR126 und GPR56 an das Gs-Protein sowie von GPR126 an das Gi-Protein bewiesen. Da eine G-Protein-gekoppelte Signaltransduktion somit für zwei weitere Adhesion GPCR gezeigt werden konnte, kann diese als etabliert für die gesamte Rezeptorklasse gelten.:Inhaltsverzeichnis 3 Abbildungsverzeichnis 4 Tabellenverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis 6 1 Einleitung 8 1.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und die Verarbeitung von Signalen 9 1.2 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit unbekannter Funktion 11 1.3 Die Adhesion G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 14 1.3.1 Die Struktur von Adhesion GPCR 14 1.3.2 Signaltransduktion von Adhesion GPCR 17 1.3.3 Der Adhesion GPCR GPR126 18 1.3.4 Der Adhesion GPCR GPR56 19 1.3.5 Der Adhesion GPCR CD97 20 2 Ziele und Fragestellungen 24 3 Materialien und Methoden 25 3.1 Chemikalien, Materialien, Plasmide, Primer 25 3.2 Verwendete Mikroorganismen und Zellen 26 3.3 Klonierung der Adhesion GPCR GPR126, GPR56 und CD97 26 3.3.1 Isolation von RNA 26 3.3.2 Herstellung von cDNA durch Reverse Transkription 27 3.3.3 Klonierungsstrategie und Primer-Design 27 3.3.4 Topo-Klonierung 29 3.3.5 Selektionierung der Klone 31 3.3.6 Integration von tags und pcDps-Klonierung 31 3.4 Rezeptor-Expression und Funktionsanalyse in Säugerzellen 33 3.4.1 Zellkultur und Transfektion 33 3.4.2 Oberflächen-ELISA 34 3.4.3 Sandwich-ELISA 35 3.4.4 cAMP-Akkumulationsassay 36 3.4.5 Inositolphosphat-Akkumulationsassay 38 3.4.6 G12/13-vermittelte Veränderung des Zytoskeletts 39 3.5 Statistische Auswertung der Daten 41 4 Ergebnisse 42 4.1 Zellmembranexpression von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 42 4.2 Gesamt-Zell-Expression von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 43 4.3 Aktivierung des AC/cAMP-Signalweges durch Adhesion GPCR exprimiert in COS 7-Zellen 45 4.3.1 Untersuchung der basalen GPR126-induzierten cAMP-Bildung 46 4.3.2 Untersuchung der basalen GPR56-induzierten cAMP-Bildung 48 4.3.3 Untersuchung der basalen CD97-induzierten cAMP-Bildung 50 4.4 Aktivierung des PLC/IP3-Signalweges durch Adhesion GPCR exprimiert in COS-7-Zellen 52 4.4.1 Untersuchung der basalen IP3-Bildung durch Adhesion GPCR 52 4.4.2 Untersuchung der IP3-Bildung von Adhesion GPCR mit Gαqi4-Co-Expression 54 4.4.3 Untersuchung der IP3 Bildung von Adhesion GPCR mit Gαqs4 Co-Expression 56 4.5 G12/13-vermittelte Veränderung des Zytoskeletts von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 58 5 Diskussion 62 5.1 Entwicklung einer erfolgreichen Klonierungsstrategie für Adhesion GPCR 62 5.2 Sicherung der Expression von Adhesion GPCR 63 5.2.1 Artifizielle Steigerung der Oberflächenexpression durch das Rho-Epitop 65 5.3 G-Protein-Kopplung der Adhesion GPCR 66 5.3.1 Der GPR126 aktiviert Gs- und Gi-Proteine 67 5.3.2 Der GPR56 aktiviert Gs-Proteine 69 5.3.3 G-Protein-Kopplung des CD97 71 5.3.4 Untersuchung einer G12/13-vermittelten Veränderung des Zytoskeletts 73 5.4 Ausblick 76 6 Zusammenfassung der Arbeit und Schlussfolgerungen 77 7 Literaturverzeichnis 79 8 Anlagen 86 Selbstständigkeitserklärung 89 Lebenslauf 90 Veröffentlichungen 91 Danksagung 92

Les chimiokines sont des petites protéines qui régulent la migration et le "homing" des cellules leucocytaires. Elles jouent également un rôle clef dans le développement de certains cancers en régulant les phénomènes de prolifération, d'angiogenèse ou encore de migration des cellules métastatiques. À ce jour, environs 40 chimiokines et plus de 19 récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été répertoriés. De nombreuses études ont montré que les récepteurs liant les chimiokines pouvaient s'associer sous forme de complexes homo et hétéromériques. Les conséquences fonctionnelles associées à l'hétéromérisation sont diverses et fonction de la nature des récepteurs étudiés, du type de cellules sur lesquelles ces récepteurs sont exprimés et de l'expression relative des récepteurs. Cependant, le rôle physiologique exact de l’hétéromérisation des récepteurs aux chimiokines, et des RCPGs de manière générale, resteencore peu connu. Nous avons tenté de répondre à cette question dans ce travail de doctorat en étudiant plus particulièrement l’hétéromérisation de CXCR4 et CCR7 au cours du développement des lymphocytes B. Nous avons montré que le récepteur CXCR4 est exprimé à la surface des lymphocytes B à tous les stades de leur développement et qu’une diminution de l’expression de CXCR4s’opère lors de la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures. Cette transition s’accompagne d’une «uprégulation » du récepteur CCR7 qui est le plus fortement exprimé à la surface des lymphocytes B matures. Nous avons par ailleurs montré que la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures s’accompagne d’une forte inhibition de CXCR4, les cellules B matures étant totalement réfractaires à la migration dans un gradient de CXCL12. Cette perte totale de fonctionnalité ne pouvant pas s’expliquer par la diminution partielle de l’expression de CXCR4, nous avons testé si l’expression du récepteur CCR7 pouvait contribuer à la perte de fonction de CXCR4 observée. Dans un premier temps, nous avons comparé la capacité de CXCR4 à induire la chimiotaxie des lymphocytes B matures provenant de souris sauvages ou de souris CCR7KO déficientes pour l’expression de CCR7. Nous avons montré que l’absence de CCR7 permet de récupérer une migration significative des lymphocytes B matures dans un gradient de CXCL12. De manière intéressante, l’absence de CCR7 affecte spécifiquement la fonction de CXCR4 mais pas celle des récepteurs CXCR5 et CCR6 également exprimés à la surface des lymphocytes B matures. De plus, l’inhibition de CCR7 des lymphocytes B matures sauvages par des anticorps bloquant ne permet pas de reproduire l’effet de l’absence de CCR7. Ce résultat suggère que la signalisation du récepteur CCR7 ne serait pas impliquée. Nous avons également montré que l’absence de CCR7 s’accompagne d’un nombre plus important de lymphocytes B matures dans la moelle osseuse des souris CCR7KO, en parfait accord avec le rôle connu de CXCR4 dans la rétention des progéniteurs hématopoïétiques au sein de la moelle osseuse. Nous avonségalement montré que l’expression du récepteur humain CCR7 dans la lignée lymphocytaire Pré-B humaine Nalm-6 ou dans des cellules CHO-K1 exprimant le récepteur CXCR4 suffit à induire une perte de fonctionnalité de CXCR4. Tout comme pour les lymphocytes B maturesmurins, cette inhibition s’exerce en absence de toute stimulation de CCR7. Nous avons aussi montré que l’expression de récepteurs CCR7 mutants incapables de lier les chimiokines CCL19 et CCL21 (mutant CCR7NT) ou d’induire une signalisation (mutants CCR7D(R/A)Y et CCR7(N/A)PXXY) sont toujours capables d’induire l’inhibition de CXCR4, ce qui confirme qu’une signalisation CCR7 n’est pas nécessaire pour induire le phénomène de la régulation de CXCR4. Ce résultat montre aussi que les fonctions de signalisation et de régulation de CCR7peuvent être découplées.Nous avons également tenté d’identifier le mécanisme moléculaire associé à l’inhibition de CXCR4 par CCR7. Grâce à l’utilisation de biosenseurs BRET mesurant l’activation des protéines G, nous avons montré que l’expression de CCR7 inhibe fortement l’activation de la protéine Gαi2 connue pour jouer un rôle important dans la migration des lymphocytes. Ce résultat permet donc d’expliquer la perte de migration détectée dans les lymphocytes B coexprimant CXCR4 et CCR7. Cependant, nous avons aussi montré que l’expression de CCR7 n’empêche pas l’interaction physique de la protéine Gαi2 avec le récepteur CXCR4. Nous avons alors émis l’hypothèse que CCR7 exercerait son effetinhibiteur sur CXCR4 en interagissant physiquement avec lui et en altérant sa capacité à activer la protéine Gαi2. Nous avons montré par différentes techniques que le récepteur CCR7 interagit avec CXCR4 et que la conformation du complexe formé par CXCR4 et la protéineGαi2 est différente suivant que cette interaction a lieu au sein d’un homomère CXCR4/CXCR4 ou d’un hétéromère CXCR4/CCR7. L’ensemble de ces données suggère donc que l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 change la conformation du complexe CXCR4/Gαi2 et la capacité de CXCR4 à activer la protéine Gαi2. De manière intéressante, l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 inhibe également l’activation de la protéine Gαi1 mais pas celle de la protéine Gαi3. Ce résultat très intéressant suggère que l’hétéromérisation CXCR4/CCR7 ne serait pas simplement associée à une inhibition de la fonction de CXCR4 mais plutôt à une modulation de son profil d’activation. Cette hypothèse suggère donc que le récepteur CCR7 jouerait le rôle de modulateur allostérique endogène de CXCR4 capable de moduler l’activation de certaines voies de signalisation tout en en laissant d'autres fonctionnelles. Cependant, le manque de temps ne nous a pas permis de confirmer le maintiend’un signal dépendant de Gαi3 dans les cellules coexprimant CXCR4 et CCR7.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le récepteur aux chimiokines CCR7 exercerait le rôle de modulateur allostérique de CXCR4 au cours du développement des lymphocytes B et que cette fonction nécessiterait l’interaction physique de CXCR4 et CCR7.À notre connaissance, ces résultats constituent la première indication que l’hétéromérisation de récepteurs aux chimiokines peut jouer un rôle dans un processus physiologique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished