Les récepteurs métabotropiques au glutamate (mGluR), qui appartiennent à la classe C des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), sont bien connus pour leurs rôles importants dans les troubles neurologiques et psychiatriques. La compréhension de leur mécanisme d’activation est essentielle pour la mise au point de nouveaux agents thérapeutiques. Récemment, le nombre de structures de RCPG cristallisées a augmenté de façon exponentielle grâce à l'application des méthodes de stabilisation de la protéine. Cependant, certaines ambiguïtés et incohérences ont été révélées au cours des études cristallographiques. En outre, des études en molécules uniques, y compris par transfert d'énergie d’excitation électronique de Förster (smFRET), ont montré la nature très dynamique des RCPG en général, et du domaine d’activation de mGluR en particulier. Ici, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'activation des mGluR entiers en utilisant des techniques de FRET d’ensemble et sur molécules uniques. Les techniques de HTRF ont permis l’optimisation de la préparation des échantillons. Un protocole a été mis au point, permettant d'extraire les mGlu2 entiers dans du détergent, à partir de cellules HEK293T, sans affecter de manière importante la pharmacologie et de la stabilité des récepteurs. Les expériences de FRET en molécules uniques ont été effectuées avec la technique MFD-PIE. Une analyse poussée de ces données, par mesure de l'efficacité de FRET ratiométrique, de durée de vie des fluorophores dans l’état excité, et d’analyse en corrélation (FCS), ont permis de montrer un changement conformationel rapide (sub-milliseconde) des récepteurs mGlu2 entiers. Par ailleurs, le rôle de stabilisation du domaine transmembranaire en faveur de l’état actif a été prouvé. / Metabotropic glutamate receptors (mGluR), which belong to class C of G protein-coupled receptors (GPCR), are well-known for their important roles in neurological and psychiatric disorders. Understanding of receptor activation is essential to decipher the receptor functioning, and thus orientate drugs design for targeted therapeutics. Recently, the number of GPCR crystal structures has increased exponentially thanks to the application of protein stabilization methods. However, these crystallography studies have revealed certain ambiguities and discrepancies, and these approaches do not take into account the dynamic nature of GPCR activation. Indeed, single-molecule studies, including single-molecule FRET (smFRET), have revealed the highly dynamic nature of GPCR in general, and fast conformational changes of mGluR domains in particular. Here, we study the activation mechanism of the full-length mGluR by FRET techniques at ensemble and single-molecule level. Homogenous time-resolved fluorescence (HTRF) was applied for optimizing the sample preparation. An appropriate protocol was established, allowing to extract mGlu2 full-length in detergent from the HEK293T cells without significantly affecting its pharmacology and stability. smFRET experiments were performed using the combination of multiparameter fluorescence detection (MFD) with pulsed interleaved excitation (PIE). Advanced data analysis such as ratiometric FRET efficiency, lifetime-based FRET measurement, and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) revealed that the fast dynamic oscillation in sub-millisecond timescale of the full-length mGlu2, and prove the stabilization role of the transmembrane domain of the full-length receptor in favor of the active state.

Mécanismes d’activation et conséquences fonctionnelles de la dimérisation des récepteurs aux chimiokines<p><p>Les chimiokines sont de petites protéines qui régulent la migration des cellules immunitaires. Elles exercent leur action en se liant à des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dont la fonction est intimement liée à la régulation des cellules immunitaires. Notre laboratoire étudie depuis plusieurs années les relations reliant la structure et la fonction des récepteurs aux chimiokines. Ces dernières années, un nouveau concept est venu révolutionner le mode de fonctionnement des RCPGs. En effet, des travaux ont montré que la plupart des RCPGs sont capables de former des dimères. Le but de cette thèse de doctorat est d’étudier de manière systématique la dimérisation des récepteurs aux chimiokines et d’analyser les conséquences fonctionnelles de la dimérisation. <p><p>Dimérisation des récepteurs humains aux chimiokines et conséquences fonctionnelles<p><p>En utilisant une technique biophysique basée sur un transfert d’énergie de luminescence (BRET) nous avons montré au cours de ce travail de thèse que les récepteurs CCR1, CCR2, CCR5, CCR7 et CXCR4 sont capables de former des homodimères et des hétérodimères. De plus, une dimérisation entre ChemR23, dont le ligand naturel, la chémérine, est structurellement différent des chimiokines, et les récepteurs CCR7 et CXCR4, a également été identifiée. <p><p>D’un point de vue fonctionnel, des expériences réalisées au laboratoire dans le cadre d’un autre travail de thèse ont identifié une forme de compétition croisée entre CCR2, CCR5 et CXCR4 où la liaison de ligands (agonistes ou antagonistes) spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre. Ces effets ont été démontrés sur des cellules recombinantes mais aussi sur des cellules immunes et dans un modèle in vivo. (El-Asmar, 2005; Springael, 2006; Sohy, 2007; Sohy, 2009). Au cours de ce travail, nous nous sommes dans un premier temps focalisés sur les <p>hétéromères de ChemR23 avec CXCR4 et CCR7 et nous avons ensuite étudié plus en profondeur les hétéromères de CCR7. Concernant la dimérisation de ChemR23 avec les récepteurs aux chimiokines CCR7 et CXCR4, nous avons pu mettre en évidence une coopérativité négative de liaison entre les agonistes des récepteurs comme cela avait pu être démontré pour CCR2/CCR5/CXCR4. Par contre, nous n’avons observé aucun effet de compétition hétérologue ou d’inhibition fonctionnelle croisée de l’AMD3100 sur ChemR23 quand il est coexprimé avec CXCR4. De manière additionnelle, nous avons pu observer cette compétition croisée sur des cellules dendritiques murines immatures, démontrant l’existence des effets de l’hétérodimérisation lorsque les récepteurs sont exprimés à un niveau physiologique. Lors de l’étude approfondie des hétéromères de CCR7, nous avons montré que les conséquences fonctionnelles de l’hétérodimérisation de CCR7 sont différentes suivant le récepteur avec lequel il interagit. Pour l’hétérodimère CCR7/CCR2, nous avons identifié une forme de compétition croisée, où la liaison de ligands spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre, rejoignant les effets mis en évidence pour les hétéromères CCR2/CCR5/CXCR4. Ensuite, nous avons montré pour l’hétérodimère CCR7/CCR5 que les ligands de CCR7 sont capables d’inhiber la liaison des ligands spécifiques sur CCR5 mais que l’inverse n’est pas vrai. Enfin, pour l’hétérodimère CCR7/CXCR4, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’inhibition croisée, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. D’autre part, un effet inhibiteur de CCR7 a également été identifié pour les hétéromères CCR7/CCR5 et CCR7/CXCR4. Nous avons pu montrer que l’expression de CCR7 exerce un effet négatif sur la réponse fonctionnelle de certains récepteurs hétérologues comme CCR5 et CXCR4 mais pas CCR2 ou ChemR23.<p><p>L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les interactions entre récepteurs et pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles pour les programmes de recherche de molécules thérapeutiques, qui, jusqu’à présent, ciblaient presque exclusivement un seul et unique récepteur.<p><p>Etude du mécanisme d’activation du récepteur CCR5 et étude de la relation entre activité constitutive et dimérisation.<p><p>De nombreux travaux ont été menés ces dernières années afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Il apparaît que les RCPGs peuvent se trouver dans plusieurs états conformationnels, dont certains sont favorisés par la présence d’agonistes ou d’antagonistes, ou encore d’anticorps reconnaissant des épitopes conformationnels. Certaines mutations peuvent également induire la stabilisation de certaines conformations, actives ou inactives. Pour les RCPGs appartenant à la famille de la rhodopsine, il en a résulté un modèle selon lequel les récepteurs sont maintenus dans une conformation inactive par un ensemble d’interactions ioniques impliquant l’arginine (R3.50) d’un motif DRY conservé, présent à l’extrémité cytosolique du troisième segment transmembranaire. Les interactions responsables de ce qu’on appelle le « DRY-lock » feraient intervenir notamment l’aspartate (D3.49) adjacent de l’arginine et un aspartate ou glutamate (D/E6.30) localisé au sein de l’hélice 6. Selon ce modèle, la liaison d’un agoniste, ainsi que certaines mutations, favoriseraient la rupture de ces interactions ioniques, et une conformation permettant aux récepteurs de se coupler plus efficacement aux protéines G. Des résultats du laboratoire indiquent cependant que ce modèle ne serait pas transposable complètement au récepteur CCR5. <p><p>CCR5 possède intrinsèquement une activité constitutive en absence d'agoniste. Cette activité peut être mise en évidence par l'action d'un des antagonistes de CCR5, le TAK-779, qui s'est révélé posséder une activité de type agoniste inverse. D'autre part, CCR5 possède au sein de l'hélice 6 une arginine en position 6.30 et non pas un glutamate ou un aspartate. Une arginine à cette position ne peut donc contribuer au maintien d’une conformation inactive par interaction avec R3.50 .Dans le but de tester le modèle de « DRY-lock » sur CCR5 et de mieux comprendre les interactions moléculaires impliquées dans l’activation du récepteur, plusieurs récepteurs mutants ont été construits au laboratoire. Tout d’abord, l’arginine 3.50 du motif DRY a été mutée en Asn (R3.50N) afin de rompre les interactions ioniques de ce résidu. L’aspartate 3.49 a été muté en Asn (D3.49N) ou en Val (D3.49V), afin de neutraliser une des interactions du « DRY-lock » (Lagane, 2005). L’arginine 6.30 a été mutée d’une part en Asp (R6.30D) ou en Glu (R6.30E), afin de rétablir une possibilité d’interaction avec R3.50, d’autre part en Ala (R6.30A) et en Gln (R6.30Q) afin de mieux cerner le rôle de la charge de l’arginine. Afin de tester l’hypothèse d’interaction entre le résidu 6.30 et le résidu 2.40, l’aspartate 2 .40 a été mutée en Ala (D2.40A) ou en Arg (D2.40R) et des récepteurs présentant les deux mutations ont également construits (D2.40A/R6.30A et D2.40R/R6.30D). L’ensemble des résultats obtenus par l’analyse de ces mutants a permis de montrer que la nature des interactions entre l’extrémité cytosolique des hélices 3 et 6 influence l’activité du récepteur CCR5 (Springael, 2007). Une interaction forte conduit à une forme de récepteur inactif alors qu’une interaction faible s’accompagne d’une augmentation d’activité constitutive. Cette propriété de CCR5 serait donc partagée avec d’autres récepteurs appartenant à la famille de la rhodopsine. Cependant les interactions inter-hélice stabilisant ces conformations seraient différentes pour CCR5. D’autre part, l’étude de la position 2.40 laisse supposer l'importance du résidu aspartate 2.40 dans le maintien d'une conformation permettant l'activité constitutive du récepteur. Nous avons également testé s’il existait une corrélation entre activité constitutive et capacité du récepteur CCR5 à former des dimères, mais les résultats ne nous ont pas permis de mettre en évidence une quelconque relation entre activité et dimérisation.<p><p> <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Notre travail a permis tout d’abord d’investiguer les effets des nucléotides extracellulaires sur les cellules<p>dendritiques (DCs) qui sont des cellules présentatrices d’antigènes capables d’initier et de réguler la<p>réponse immunitaire. Afin d’avoir une vue globale de l’action des nucléotides extracellulaires sur les DCs,<p>un profil d’expression génique de l’ATPgS – dérivé stable de l’ATP - a été réalisé par microarray dans les<p>cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDCs).<p>Notre groupe a préalablement montré que malgré que l’ATP est considéré comme un signal de danger, il<p>confère des propriétés immunosuppressives aux DCs (Marteau et al, 2005). Nous nous sommes focalisés<p>sur des régulations géniques pouvant être mises en relation avec un action anti-inflammatoire de l’ATP.<p>Nous avons ainsi démontré que l’ATP était capable d’inhiber la sécrétion des chimiokines MCP-1 et MIP-<p>1a initiée par l’action du LPS, ce qui a pour conséquence de diminuer la capacité des DCs à recruter des<p>monocytes ou d’autres DCs. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant que premier auteur<p>(Horckmans et al, 2005).<p>Un grand nombre d’autres gènes régulés liés à la réponse immune et à l’inflammation a été identifiée<p>dans le profil microarray de l’ATPgS. Nous avions notamment pu identifier une augmentation de la<p>sécrétion de VEGF-A en réponse à l’ATP, amplifiée en présence de LPS. Cette régulation est extrêmement<p>intéressante au vu de l’action immunosuppressive du VEGF sur les DCs. Par ailleurs, cette régulation<p>pourrait constituer un lien entre les DCs et l’angiogénese. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant<p>que premier co-auteur dans la revue Journal of Immunology (Bles et al, 2007).<p>En conclusion, nos données nous ont ainsi permis de montrer que les nucléotides adényliques peuvent<p>avoir par leur action sur les cellules dendritiques une action anti-inflammatoire voire pro-angiogénique,<p>en inhibant le recrutement leucocytaire et une action immunosuppressive en stimulant la sécrétion de<p>VEGF.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) représentent une famille génique parmi les plus nombreuses du génome humain avec plus de 1000 représentants identifiés. Ils ont été classés en sous-familles en fonction de leurs homologies de séquence, la structure de leurs ligands et leur rôle physiologique. Ils régulent un très grand nombre de fonctions physiologiques comme la tension artérielle, le métabolisme, la plupart des actions hormonales et de très nombreuses fonctions cérébrales, et constituent de ce fait des cibles privilégiées pour les agents thérapeutiques. <p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

G protein-coupled receptors (GPCRs) are eukaryotic integral membrane proteins that perform transmembrane signal transduction. Due to their pivotal role in a wide range of essential physiological functions GPCRs represent a high proportion of all drug targets. High resolution X-ray structures of GPCRs are however underrepresented in the Protein Data Bank. This is due to their instability in detergent, low expression levels and the presence of misfolded receptors in many heterologous expression systems. The objective of this project was to engineer the angiotensin II type 1 receptor (AT1R), a human GPCR, to make it suitable for structural studies. It was determined that detergentsolubilised AT1R was thermostable with antagonist bound with an apparent Tm of ~45°C, which was sufficiently stable for purification without further thermostabilisation by rational mutagenesis. Two expression systems were then evaluated for large-scale production of AT1R, namely baculovirus-mediated expression in insect cells and mammalian expression in HEK293 cells. Radioligand binding assays showed that only the mammalian system produced sufficient quantities of active AT1R for structural studies. Expression in the mammalian system was further optimised to approximately 6 mg/L. An AT1R-GFP fusion was created to examine membrane localisation using confocal laser scanning microscopy, to assay expression levels, to select highly expressing monoclonal cell lines using fluorescence activated flow cytometry and to develop a fluorescence size-exclusion chromatographybased assay to examine the suitability of 12 different ligands for co-crystallization. AT1R was also engineered to facilitate crystallisation, including C-terminal truncations to remove predicted disordered regions and bacteriophage T4-lysozyme being added to the third intracellular loop to provide additional points of contact for crystallisation, which increased the apparent Tm by approximately 10°C. All modified versions of AT1R were assessed for expression, stability and monodispersity. Additionally a rapid western blotting based assay was developed for the detection of unfolded membrane proteins, which will have wide applicability in the field.

The glycoprotein hormones, Luteinizing Hormone (LH), human Chorionic Gonadotropin (hCG), Follicle Stimulating Hormone (FSH) and Thyroid Stimulating Hormone (TSH) are heterodimeric proteins with an identical α-subunit associated non-covalently with the hormone specific β-subunit and play important roles in reproduction and overall physiology of the organism [1]. The receptors of these hormones belong to the family of G-protein coupled receptors (GPCR) and have a large extracellular domain (ECD) comprising of 9-10 leucine rich repeats (LRR) followed by a flexible hinge region, a seven helical transmembrane domain (TMD) and a C terminal cytoplasmic tail [2]. Despite significant sequence and structural homologies observed between the ECDs of the receptors and the specific β-subunits of the hormones, the hormone-receptor pairs exhibit exquisite specificity with very low cross-reactivity with other members of the family. The TSH receptor (TSHR) is an especially interesting member of this family as it not only recognizes is cognate ligand, i.e. TSH, but also binds to the non-cognate ligands such as autoantibodies. TSHR autoantibodies come in different flavors; inhibitory antibodies that compete with the hormone for receptor binding and block its action, stimulatory antibodies that activate the receptor in a hormone independent manner and neutral antibodies that bind to the receptor but do not directly influence its functions. The inhibitory autoantibodies cause hypothyroidism and are responsible for Hashimoto’s Thyroiditis, whereas the stimulatory autoantibodies cause Graves’ thyrotoxicosis characterized by hyperthyroid condition [3]. The exact epitopes of these autoantibodies are not well delineated although it has been hypothesized that the blocking type- and the stimulatory type- autoantibodies have predominant epitopes in the TSHR ECD that overlap with hormone binding regions [4]. Insights into the mode of hormone or autoantibody binding to the receptor was primarily derived from the crystal structure of FSHR leucine rich repeat domain (LRRD) bound to single chain analog of FSH, and the crystal structures of TSHR LRRD bound to the stimulatory type human monoclonal antibody M22 [5] and the inhibitory type- monoclonal antibody K1-70 [6]. Both these crystal structures propose LRRDs as the primary ligand binding site which interacts with the hormone through its determinant loop in a hand-clasp fashion [7] while the autoantibodies mimics the hormone binding to a large extent [8] . These structures, while providing detailed understanding of the molecular interactions of the LRRs with the hormone, shed little light on the mechanism by which the signal generated at the LRRD are transduced to the downstream effector regions at the distally situated TMD. Hence, while one understands the ligand binding to a large extent, the activation process is not well understood, one of the central objective of the present study. Ligand-receptor interactions are typically studied by perturbing ligand/receptor structure by mutagenesis or by mapping conformational changes by biophysical or computational approaches. In addition to the above-mentioned approaches, the present work also uses highly specific antibodies against different domains of the receptor as molecular probes due to the ability of antibodies to distinguish between conformations likely to arise during the activation process. Use of antibodies to understand the receptor activation process is especially apt for TSHR due to the presence of physiologically relevant TSHR autoantibodies and their ability to influence hormone binding and receptor activation [9, 10]. Chapter 2 attempts to provide a comparison between the interactions of the hormone and the autoantibodies with TSHR. For this purpose, two assays were developed for identification of TSHR autoantibodies in the sera of patients suffering from autoimmune thyroid diseases (AITD), the first assay is based on the ability of TSHR autoantibodies to compete for radiolabeled hormone (The TSH binding inhibition (TBI), assay) and the second based on the capability of stimulatory antibody to produce cAMP in cells expressing TSHR (TSHR stimulatory immunoglobin (TSI) assay). A stable cell line expressing TSHR capable of recognizing both TSH and TSHR autoantibodies was thus created and used for prospective and retrospective analysis of AITD patients. Based on the TBI and TSI profiles of IgGs, purified from AITD patient's sera, it was recognized that TSHR stimulatory and TSH binding inhibitory effects of these antibodies correlated well, indicating overlap between hormone binding and IgG binding epitopes. It was also recognized that stimulatory IgGs are not affected by negative regulatory mechanism that governs TSH secretion substantiating the persistence of these antibodies in circulation. Kinetics of cAMP production by Graves’ stimulatory IgG was found to be fundamentally distinct, where the autoantibodies displayed pronounce hysteresis during the onset of the activation process when compared to the hormone. This could possibly be explained by the oligoclonality of the autoantibody population, a different mechanism of receptor activation or dissimilarity in autoantibody and hormone epitopes. To gain additional insights into the epitopes of TSHR autoantibodies and the regions that might be critical in the activation process, different overlapping fragments encompassing the entire TSH receptor ECD were cloned, expressed in E.coli as GST fusion proteins and purified: 1] the first three LRRs (TLRR 1-3, amino acid (aa) 21-127), 2] the first six LRRs (TLRR 1-6, aa 21-200), 3] the putative major hormone binding domain (TLRR 4-6, aa 128-200), and 4] the hinge region of TSH receptor along with LRR 7 to 9, (TLRR 7-HinR, aa 201-413). The receptor fragment TLRR 7-HinR was further subdivided into LRR 7-9 (TLRR 7-9, aa 201-161) and the hinge region (TSHR HinR, aa 261-413), expressed as N-terminal His-Tagged protein and purified using IMAC chromatography. Simultaneously, the full-length TSHR ECD was cloned, expressed and purified using the Pichia pastoris expression system. ELISA or immunoblot analysis of autoantibodies with the TSHR exodomain fragments suggested that Graves’ stimulatory antibody epitopes were distributed throughout the ECD with LRR 4-9 being the predominant site of binding. Interestingly, experiments involving neutralization of Graves’ IgG stimulated cAMP response by different receptor fragment indicated that fragments corresponding to the TSHR hinge region were better inhibitors of autoantibody stimulated receptor response than corresponding LRR fragments, suggesting that the hinge region might be an important component of the receptor activation process. This was in contrast to prevalent beliefs that considered the hinge region to be an inert linker connecting the LRRs to the TMD, a structural entity without any known functional significance. Mutagenesis in TSHR hinge region and agonistic antibodies against FSHR and LHR hinge regions, reported by the laboratory, recognized the importance of the hinge regions as critical for receptor activation and may not simply be a scaffold [11-13]. Unfortunately, the mechanism by which the hinge region regulates binding or response or both have not been well understood partially due to unavailability of structural information about this region. In addition poor sequence similarity within the GpHR family and within proteins of known structure, make this region difficult to model structurally. In chapter 3, effort is made to model the hinge regions of the three GpHR based on the knowledge driven and Ab initio protocols. An assembled structure comprising of the LRR domain (derived from the known structures of FSHR and TSHR LRR domains) and the modeled hinge region and transmembrane domain presents interesting differences between the three receptors, especially in the manner the hormone bound LRRD is oriented towards the TMD. These models also suggested that the α-subunit interactions in these three receptors are fundamentally different and this was verified by investigating the effects of two α-subunit specific MAbs C10/2A6 on hCG-LHR and hTSH-TSHR interactions. These two α-subunit MAbs had inverse effects on binding of hormone to the receptor. MAb C10 inhibited TSH binding to TSHR but not that of hCG, whereas MAb 2A6 inhibited binding of hCG to LHR but not of hTSH. Investigation into the accessibility of their epitopes in a preformed hormone receptor complex indicated that the α-subunit may become buried or undergo conformational change during the activation process and interaction may be different for LHR and TSHR. Fundamental differences in TSHR and LHR were further investigated in the next chapter (Chapter 4), especially with regards to the ligand independent receptor activation. Polyclonal antibodies were developed against LRR 1-6, TLRR 7-HinR and the TSHR HinR receptor fragments. The LRR 1-6 antibodies were potent inhibitor of receptor binding as well as response, similar to that observed with antibodies against the corresponding regions of LHR. Interestingly, the antibodies against the hinge region of TSHR were unable to inhibit hTSH binding, but were effective inhibitors of cAMP production suggesting that this region may be involved in a later stage of a multi-step activation process. This was also verified by studying the mechanism of inhibition of receptor response and their effect on ligand-receptor association and dissociation kinetics. Hinge region-specific antibodies immunopurified from TLRR 7-HinR antibodies behaved akin to those of the pure hinge region antibodies providing independent validation of the above results. This result was, however, in contrast to those observed with a similar antibody against LHR hinge region. As compared to the TSHR antibody, the LHR antibody inhibited both hormone binding and response. In addition, this antibody could dissociate a preformed hormone-receptor complex which was not observed for TSHR hinge region antibodies. Although unable to dissociate preformed hormone-receptor complex by itself, the TSHR HinR antibodies augmented hormone induced dissociation of the hormone-receptor complex suggesting that this region may be involved in modulation of negative cooperativity associated with TSHR. Molecular dissection of the role of hinge region of TSHR was further carried out by using monoclonal antibodies against LRR 1-3 (MAb 413.1.F7), LRR 7-9 (MAb 311.87), TSHR hinge region (MAb 311.62 and MAb PD1.37). MAb 311.62 which identifies the LRR/Cb-2 junction (aa 265-275), increased the affinity of TSHR for the hormone while concomitantly decreasing its efficacy, whereas MAb 311.87 recognizing LRR 7-9 (aa 201-259) acted as a non-competitive inhibitor of TSH binding. MAb 413.1.F7 did not affect hormone binding or response and was used as the control antibody for different experiments. Binding of MAbs was sensitive to the conformational changes caused by the activating and inactivating mutations and exhibited differential effects on hormone binding and response of these mutants. By studying the effects of these MAbs on truncation and chimeric mutants of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), this study confirms the tethered inverse agonistic role played by the hinge region and maps the interactions between TSHR hinge region [14] and exoloops responsible for maintenance of the receptor in its basal state. Mechanistic studies on the antibody-receptor interactions suggest that MAb 311.87 is an allosteric insurmountable antagonist and inhibits initiation of the hormone induced conformational changes in the hinge region, whereas MAb 311.62 acts as a partial agonist that recognizes a conformational epitope critical for coupling of hormone binding to receptor activation. Estimation of apparent affinities of the antibody to the receptor and the cooperativity factor suggests that epitope of MAb 311.87 (LRR 7-9) may act as a pivot involved in the initial events immediate to hormone binding at the LRRs. The anatgonsitic effect of MAB 311.62 on binding and response also suggested that binding of hormone is conformationally selective rather than an induced event. The hinge region, probably in close proximity with the α-subunit in the hormone-receptor complex, acts as a tunable switch between hormone binding and receptor activation. In contrast to the stimulatory nature of Cb-2 antibody such as MAb 311.62, MAb PD1.37, which identified residues aa 366–384 near Cb-3, was found to be inverse agonistic. Unlike other known inverse agonistic MAbs such as CS-17 [15] and 5C9 [16], MAb PD1.37 did not compete for TSH binding to TSHR, although it could inhibit hormone stimulated response. Moreover, unlike CS-17, MAb PD1.37 was able to decrease elevated basal cAMP of hinge region constitutively activated mutations only but not those in the extracellular loops. This is particularly important as interaction of hinge region residues with those of ECLs had been thought to be critical in maintenance of the basal level of receptor activation and are responsible for attenuating the constitutive basal activity of the mutant and wild-type receptors in the absence of the hormone. This was demonstrated by a marked increase in the basal constitutive activity of the receptor upon the complete removal of its extracellular domain, which returned to the wild-type levels upon reintroduction of the hinge region. However, careful comparison of the activities of the mutants (receptors harboring deletions and gain-of-function mutations) with maximally stimulated wild-type TSHR indicated that these mutations of the receptor resulted primarily in partial activation of the serpentine domain suggesting that only the ECD in complex with the hormone is the full agonist of the receptor. Confirmation of the above proposition has been difficult to verify primarily due to a highly transient conformational change in the tripartite interaction of the hinge region/hormone and the ECLs. The current approaches of using antibodies to probe the ECLs are difficult due to the conformational nature of the antigen as well as difficulty in obtaining a soluble protein. In chapter 5, the ligand induced conformational alterations in the hinge regions and inter-helical loops of LHR/FSHR/TSHR were mapped using the exoloop specific antibodies generated against a mini-Transmembrane domain (mini-TMD) protein. This mini-TMD protein, designed to mimic the native exoloop conformations, was created by joining the TSHR exoloops, constrained through the helical tethers and library derived linkers. The antibody against mini-TMD specifically recognized all three GpHRs and inhibited the basal and hormone stimulated cAMP production without affecting hormone binding. Interestingly, binding of the antibody to all three receptors was abolished by prior incubation of the receptors with the respective hormones suggesting that the exoloops are buried in the hormone-receptor complexes. The antibody also suppressed the high basal activities of gain-of-function mutations in the hinge regions, exoloops and TMDs such as those involved precocious puberty and thyroid toxic adenomas. Using the antibody and point/deletion/chimeric receptor mutants, dynamic changes in hinge region-exoloop interactions were mapped. The computational analysis suggests that mini-TMD antibodies act by conformationally locking the transmembrane helices by restraining the exoloops and juxta-membrane regions. This computational approach of generating synthetic TMDs bears promise in development of interesting antibodies with therapeutic potential, as well as, explains the role of exoloops during receptor activation. In conclusion (Chapter 6), the study provides a comprehensive outlook on the highly dynamic interaction of ligand and different subdomains of the TSHR (and to a certain extent of LHR and FSHR) and proposes a model of receptor activation where the receptor is in a dynamic equilibrium between the low affinities constrained state and the high affinity unconstrained state and bind to the hormone through the LRR 4-6. Upon binding the βL2 loop of the hormone contact LRR 8-10 that triggers a conformational change in the hinge region driving the α-subunit to contact the ECLs. Upon contact, the ECLs cooperatively causes helix movement in the TMH and ultimately in ICLs causing the inbuilt GTP-exchange function of a GPCR.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous virus of the herpes type that infects a high percentage of some populations. One of the most researched genes expressed by HCMV with close homology to human chemokine receptors is the US28 G protein-coupled receptor. Study design: This study was initiated to elucidate the intracellular signalling pathways of an inflammatory factor (IL-6) and an angiogenic factor (STAT3) triggered by the viral US28 oncogene and the presence of US28 in the HCMV viral particle. These pathways were observed by introducing the US28 gene into two human cell lines by infection with a HCMV strain that expresses the US28 gene (wild type), and two HCMV strains where the US28 gene was deleted (ÄUS28 and ÄUS28/UL33). Special attention was directed at the expression of IL-6 after promotion of the US28 gene and subsequent phosphorolation of STAT3. A new US28 antibody was validated and a method developed in an attempt to determine US28 on the viral particle. The following techniques were applied: Cell culture work, two mammalian cell lines were used, HFF’s and U373 MG. Virus stock titre determination to determine the multiplicity of infection. Protein quantitation to determine very small quantities of protein for Western blot analysis. ELISA for the quantitative determination of IL-6. Western blotting for phospho- STAT3 determination and validation of the US28 antibody. Immunocytochemistry was used for back titrations of virally infected cells. Immunofluorescence assay and use of confocal microscopic techniques was used for the location of the US28 gene in the virion and for tSTAT3 translocation to the nucleus. Conclusion: A clear increase in IL-6 secretion (495% ± 1%) was seen, and this was after only an hour in HCMV WT infected cells. From the increase in IL-6 secretion a subsequent increase in STAT3 phosphorylation was detected in the same samples. A clear link has been established between IL-6 and STAT3. A method to determine whether US28 was present in the HCMV viral particle was designed and preliminary results obtained. The results were inclusive. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2011. / Pharmacology / unrestricted

Dans la majorité des cas, l’hypersécrétion de cortisol résulte d’un adénome hypophysaire sécrétant de l’ACTH (maladie de Cushing). Plus rarement, le syndrome de Cushing est la conséquence d’un adénome corticosurrénalien unilatéral ou d’une hyperplasie bilatérale des surrénales (HMBS) sécrétant du cortisol. Ces deux pathologies appartiennent à la catégorie des hypercortisolismes dits ACTH-indépendants en raison des taux plasmatiques effondrés d’adrénocorticotrophine (ACTH). Les mécanismes moléculaires à l’origine de la sécrétion accrue de cortisol par ces lésions sont longtemps restés méconnus. Au cours des dernières années, des avancées considérables ont été réalisées dans la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie du syndrome de Cushing. Deux grands types d’anomalies paraissent impliqués dans la pathogénie de l’hypercortisolisme : des mutations germinales et somatiques activant des voies de signalisation intracellulaires et l’expression illégitime de récepteurs membranaires. Dans la surrénale humaine normale, la sérotonine (5-HT), synthétisée et libérée par les mastocytes sous-capsulaires, stimule la sécrétion des corticostéroïdes via son récepteur 5-HT4. Ce dernier est principalement localisé à la surface des cellules de la zone glomérulée mais faiblement exprimé au niveau des cellules de la zone fasciculée, expliquant l’action stimulante prédominante de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone. Dans la dysplasie micronodulaire pigmentée des surrénales, l’activation de la voie AMPc/PKA par une mutation du gène PRKAR1A est responsable d’une surexpression de la tryptophane hydroxylase (TPH) de type 2, enzyme limitante de la synthèse de 5-HT, et des récepteurs sérotoninergiques 5-HT4, 5-HT6 et 5-HT7 couplés positivement à la voie AMPc/PKA dans les cellules cortisolosécrétrices. Chez l’Homme, la sécrétion de cortisol est physiologiquement stimulée par l’ACTH également via la voie AMPc/PKA. Les patients souffrant de maladie de Cushing, d’un syndrome de Cushing paranéoplasique (paraCS), d’un déficit en 21-hydroxylase ou d’HMBS présentent des taux d’ACTH plasmatique ou intrasurrénalienne élevés. Chez ces patients, nous montrons que la stimulation chronique de la voie AMPc/PKA par l’ACTH provoque une surexpression de la TPH de type 1, du récepteur eutopique 5-HT4 et des récepteurs ectopiques 5-HT6 et 5-HT7 dans les cellules stéroïdogènes. Pour l’un des patients avec paraCS, nous avons pu montrer que les cellules corticosurrénaliennes en culture sécrètent du cortisol en réponse à la 5-HT ou à des agonistes des récepteurs 5-HT4 ou 5-HT7. Par ailleurs, le rôle de la voie Wnt/-caténine dans l’apparition des récepteurs illégitimes reste controversé. Nous avons donc évalué l’expression des récepteurs 5-HT4, 5-HT6, 5-HT7, du LH-R et du GIP-R dans une tumeur corticosurrénalienne avec mutation germinale du gène APC et deux modèles d’activation constitutive de la voie Wnt/-caténine dans le cortex surrénalien, incluant des souris génétiquement modifiées et des cellules corticosurrénaliennes humaines en culture primaire. Nos résultats indiquent que l’activation de la voie Wnt/-caténine favorise une surexpression significative du LH-R dans les 3 modèles étudiés. Globalement, les données issues de notre travail montrent que l’activation de voies de signalisation intracellulaire, comme la voie AMPc/PKA par l’ACTH ou la voie Wnt/-caténine par des mutations génétiques, favorise l’émergence de systèmes de régulation surrénaliens aberrants. Ils indiquent en outre que la 5-HT intrasurrénalienne est impliquée dans l’hypersécrétion de corticostéroïdes associée à différentes pathologies incluant la maladie de Cushing et le syndrome de Cushing paranéoplasique, le bloc en 21-hydroxylase et l’HMBS. Le recours à des inhibiteurs sélectifs de la tryptophane hydroxylase pourrait donc permettre de réduire l’excès de stéroïdes chez les patients atteints de ces affections. / In most cases, cortisol hypersecretion (Cushing’s syndrome; CS) results from ACTH-producing pituitary adenoma (Cushing’s disease). Occasionally, CS is the consequence of a unilateral adrenal adenoma or a bilateral macronodular adrenal hyperplasia (BMAH) producing cortisol. In these conditions, hypercortisolism is referred to as “ACTH-independent” owing to suppressed plasma ACTH levels. The molecular mechanisms underlying the maintenance of cortisol hypersecretion by adrenocortical adenomas and BMAHs in the absence of circulating ACTH has long remained unknown. However, major advances have been made during the past recent years in the comprehension of the pathophysiology of primary adrenal CS. Two main types of molecular defects have been shown to favor cortisol hypersecretion by adrenocortical neoplasms: somatic mutations responsible for activation of intracellular signaling pathways and abnormally expressed (or illegitimate) membrane receptors by tumor cells. In the human adrenal gland, serotonin (5-HT), released by subcapsular mast cells stimulates corticosteroid secretion through activation of its type 4 receptor (5-HT4R). The 5-HT4R is principally expressed in zona glomerulosa cells but weakly expressed in zona fasciculata cells explaining why 5-HT strongly stimulates aldosterone production. Interestingly, in primary pigmented nodular adrenocortical disease (PPNAD) cells, activation of the cAMP/PKA pathway by PRKAR1A mutations triggers upregulation of the 5-HT synthesizing enzyme tryptophan hydroxylase (TPH) type 2 together with the 5-HT4, 5-HT6 and 5-HT7 receptors, positively coupled to cAMP/PKA signaling pathway. 5-HT strongly stimulates cortisol production and inhibition of TPH reduced corticosteroidogenesis in cultured PPNAD cells. In human, cortisol secretion is normally stimulated by ACTH also through activation of the cAMP/PKA signaling pathway. Patients suffering from Cushing’s disease, paraneoplastic Cushing’s syndrome (paraCS), 21-hydroxylase deficiency or BMAH display high plasma or intraadrenal ACTH levels. In these patients, we show that chronic stimulation of cAMP/PKA pathway by ACTH induces TPH type 1 and 5-HT4/6/7 receptors overexpression in steroidogenic cells. In primary cultured adrenocortical cells originating from a patient with paraCS, 5-HT and 5-HT4/7 receptors agonists were able to activate cortisol secretion. On the other hand, the role of Wnt/-catenin signaling pathway in the emergence of illegitimate receptors is still debated. We therefore evaluated 5-HT4, 5-HT6, 5-HT7, LH/hCG and GIP receptors expression in an adrenocortical tumor with APC germline mutation and two experimental models of constitutive activation of β-catenin in adrenocortical cells, namely genetically modified mice and human transfected adrenocortical cells. Our results indicate that Wnt/-catenin pathway activation promotes significant overexpression of LH/hCG receptor in the 3 models investigated. Globally, our data show that activation of intracellular signaling pathways such as the cAMP/PKA pathway by ACTH or Wnt/-catenin by genetic mutations favors the emergence of abnormal regulatory systems in the adrenal cortex. Our results also demonstrate that intraadrenal 5-HT is involved in corticosteroids hypersecretion related to different diseases including Cushing’s disease, paraneoplastic Cushing’s syndrome, 21-hydroxylase deficiency and BMAH. TPH inhibitors may thus represent a new therapeutic approach of corticosteroid excess in patients suffering from these disorders.

L'insuffisance cardiaque est un réel problème de santé publique avec 1 millions de patients souffrant de cette pathologie cette année en France. Elle est définie incapacité de fournir un débit sanguin suffisant à l'organisme. Cette diminution de débit est traduite par la perte de fonction contractile du coeur provoqué par la nécrose des cellules responsable de cette fonction : les cardiomyocytes. Dans cette étude j'ai pu étudier les modifications topographiques et biomécaniques de la membrane du cardiomyocyte vivant en amont de sa rupture lors de la nécrose, par une technologie issue des nanosciences : la microscopie à force atomique (AFM). Mes travaux ont fait apparaitre une membrane très structurée chez le cardiomyocyte sain et une perte de cette architecture dans un temps précoce de l'installation de l'insuffisance cardiaque. L'utilisation de la microscopie électronique à transmission à montrer que les anomalies mises en évidences par AFM ont pour origine un réarrangement mitochondriale. Dans une seconde étude je me suis intéressée à l'organisation oligomérique d'une famille particulière de récepteur transmembranaire, les récepteurs couplés aux protéines G. Ces protéines sont une des cibles privilégiées pour les traitements pharmacologiques de l'insuffisance cardiaque tel que le bêta-bloquants et les vasodilatateurs. Ce mécanisme d'oligomérisation pourrait être la clef des effets secondaires liés à ces traitements. Afin d'étudier la conformation oligomérique, j'ai utilisé la spectroscopie de force à l'échelle de la molécule unique pour mettre en évidence différentes populations oligomérique de ces récepteurs sur la surface membranaire. Les résultats ont montré une distribution des populations oligomériques en fonction des conditions (densité de plasmide codants pour les récepteurs/stimulation avec agoniste synthétique ou naturel). Il est possible qu'il y ait une régulation des voies de signalisations par l'oligomérisation des récepteurs activés. La différence d'activité possible de chaque population oligomérique (monomère/dimère/tétramère/hexamère) semble être une explication plausible aux effets secondaire des agents pharmacologique. Mes travaux de thèse ont permis la mise en évidence de nouvelle piste par une technologie innovante, la microscopie à force atomique, dans le traitement de l'insuffisance cardiaqu / Heart failure is a public health problem with 1 million patients this year in France. This pathology is defined inability to heart pump sufficiently to maintain blood flow to meet the body's needs. This decrease is explicated by the loss of contractile function of the heart, caused by the necrosis of the contractile cells: cardiomyocytes. In this study, I was able to study the topographic and biomechanical modification of the cardiomyocyte membrane upstream of its rupture during necrosis, by technology derived from nanosciences : atomic force microscopy (AFM). My work reveals a highly structured membrane in healthy cardiomyocytes and a loss of this architecture in an early stage of the heart failure installation. In a second study I was interested in the oligomeric organization of a transmembrane receptors family , G protein-coupled receptors. These proteins are a privileged target for the pharmacological treatments on heart failure such as beta- Blockers and vasodilators. This oligomerization mechanism could be the key to the side effects associated with treatments. In order to study the oligomeric conformation, I used single molecule force spectroscopy and I reveal different oligomeric populations of these receptors on the membrane. The results showed a oligomeric populations distribution according the conditions (plasmid density coding for receptors / stimulation with synthetic or natural agonist). It is possible that there is a regulation of the signaling pathways, using the oligomerization for specific activation receptors. The possible difference in activity of each oligomeric population (monomer / dimer / tetramer / hexamer) appears to be a plausible explanation for the side effects of pharmacological agents. My thesis work allowed the discovery of a new track by an innovative technology, atomic force microscopy, in the treatment of heart failure.

Drug addiction, opiates respectively, is a social problem which seriousness is currently on the rise. One of key elements causing addiction is tolerance to increasing doses of drug causing abstinence syndrome during withdrawal and craving. Opioid receptors are members of a large group of receptors coupled with heterotrimeric G-proteins (GPCR), whose properties can be investigated using agonist- stimulated binding [35 S] GTPγS. Many extracellular signals are transferred into a cell through GPCR. Opioid receptor agonists inhibit the activity of adenylyl cyclase and are coupled with G-protein group Gi/Go. This work is devoted to the study of changes in isolated plasma membranes of rat forebrain containing opioid receptors of healthy subjects with membranes acquired from morphine addicted subjects. The rats were long-term morphine treated in increasing doses, to develop the dependency. The comparison is done firstly by binding of [3 H]ouabain to Na,K-ATPase, which proves to be a negative standard of changes, secondly by binding [35 S]GTPγS to G-proteins, thereby providing the functional activity of G-protein in stimulating the binding by the agonist of δ-opioid receptors DADLE or agonist of µ-opioid receptors DAMGO. Furthermore, it has been studied the influence of prostaglandin E1 on binding [35...