Les tumeurs du cortex surrénalien sont variées et fréquentes dans la population. Bien que des mutations aient été identifiées dans certains syndromes familiaux, les causes génétiques menant à la formation de tumeur du cortex surrénalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie d’entrée de la tumorigenèse du cortex surrénalien. L’événement génétique le plus fréquemment observé dans ces tumeurs est l’expression aberrante d’un ou plusieurs récepteurs couplés aux protéines G qui contrôle la production de stéroïdes ainsi que la prolifération cellulaire. L’événement génétique menant à l’expression aberrante de ces récepteurs est encore inconnu. En utilisant le récepteur au peptide insulinotropique dépendant du glucose (GIP) comme modèle, cette étude se propose d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrénalien. Une partie clinique de cette étude se penchera sur l’identification de nouveaux cas de tumeurs surrénaliennes exprimant le GIPR de façon aberrante. Les patients étudiés seront soumis à un protocole d’investigation in vivo complet et les tumeurs prélevées seront étudiées extensivement in vitro par RT-PCR en temps réel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera également étudiée de cette façon. Une autre partie de l’étude utilisera les nouvelles techniques d’investigation à grande échelle en identifiant le transcriptome de différents cas de tumeurs exprimant le GIPR de façon aberrante. L’importance fonctionnelle des gènes identifiée par ces techniques sera confirmée dans des modèles cellulaires. Cette étude présente pour la première des cas de tumeurs productrices d’aldostérone présentant des réponses aberrantes, auparavant confinées aux tumeurs productrice de cortisol ou d’androgènes surrénaliens. Le cas probant présenté avait une production d’aldostérone sensible au GIP, le GIPR était surexprimé au niveau de l’ARNm et un fort marquage a été identifié dans la tumeur spécifiquement. Dans les surrénales normales, cette étude démontre que le GIP est impliqué dans le contrôle de la production d’aldostérone. Ces résultats ont été confirmés in vitro. Finalement, le profilage à grande échelle des niveaux d’expression de tous les gènes du génome a permis d’isoler une liste de gènes spécifiquement liés à la présence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrénalien. Cette liste inclus la périlipine, une protéine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrénale, dont l’expression est fortement réprimée dans les cas GIP-dépendant. Des études dans un modèle cellulaire démontrent que la répression de ce gène par siRNA est suffisante pour induire l’expression du récepteur au GIP et que cette protéine est impliquée dans la stimulation de la stéroïdogénèse par le GIP. En alliant des méthodes d’investigation in vivo de pointe à des techniques in vitro avancée, cette étude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrénale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques. / Tumors of the adrenal cortex are varied and frequently found in the population. Aside from rare family cases in which mutations have been identified, the genetic events leading to the formation of adrenocortical tumors remain obscure. A subtype of these tumors includes macronodular hyperplasias, now percieved as the entry point of adrenocortical tumorigenesis. The most commonly observed molecular event in these cases is the presence of aberrantly expressed G-protein coupled receptor that drive steroid production and cellular proliferation. The genetic events leading to these aberrant levels of expression are unknown. This study will use the Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) receptor as a model to identify the molecular mecanisms leading to the aberrant expression of the GIP receptor (GIPR) in adrenocortical tumors. The first part of the study will be a clinical investigation of new cases of adrenocortical tumors to screen for aberrant responses to GIP in various types of these tumors. The patients will be evaluated by a thorough clinical investigation protocol and the resected tumors will be extensively analysed in vitro, using real-time RT-PCR, immunohistochemistry, microarray and primary cultures of the tumors. The link between GIP and the normal physiology of the adrenal cortex will also be assessed in normal subjects. The second part of the study will use novel large-scale investigation techniques to determine the transcriptome of different cases of adrenocortical tumors expressing aberrant levels of the GIPR. The functional importance of identified genes will be assessed in cellular models. This study presents the first cases of aldosterone-producing tumors with aberrant responses to hormones, previously confined to cortisol- or androgen producing tumors. The case presented showed an aldosterone production sensitive, among others, to GIP. The GIPR’s mRNA was strongly over expressed and a specific staining was observed in immunohistochemistry. The responses were confirmed in primary cultures of the tumor. In normal adrenals, a role for the control of aldosterone by GIP was also demonstrated. Finally, large-scale profiling of the transcriptome led to the identification of a list of genes with expression levels strictly related to the presence of the GIPR in adrenocortical hyperplasias. One of these genes, perilipin, was strongly repressed specifically in GIP-dependent cases. siRNA techniques were used in a cellular model and confirmed that the repression of perilipin is sufficient to induce the expression of GIPR and that this protein is implicated in the GIP induced steroidogenesis. Allying state-of-the-art in vivo investigation methods to advanced in vitro techniques, the present study identifies novel insights on the link between GIP and the normal adrenal physiology, in normal and pathological conditions.

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression. Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei. These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2 DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets for drug development.

Biochemical processes all involve associations and dissociations of chemical entities. Understanding these is of substantial importance for many modern pharmaceutical applications. In this thesis, longstanding problems with regard to ligand binding are treated with computational methods, applied to proteins of key pharmaceutical importance. Homology modeling, docking, molecular dynamics simulations and free-energy calculations are used here for quantitative characterization of ligand binding to proteins. By combining computational tools, valuable contributions have been made for pharmaceutically relevant areas: a neglected tropical disease, an ion channel anti-drug-target, and GPCR drug-targets. We report three compounds inhibiting cruzain, the main cysteine protease of the protozoa causing Chagas’ disease. The compounds were found through an extensive virtual screening study and validated with experimental enzymatic assays. The compounds inhibit the enzyme in the μM-range and are therefore valuable in further lead optimization studies. A high-resolution crystal structure of the BRICHOS domain is reported, together with molecular dynamics simulations and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry studies. This work revealed a plausible mechanism for how the chaperone activity of the domain may operate. Rationalization of structure-activity relationships for a set of analogous blockers of the hERG potassium channel is given. A homology model of the ion channel was used for docking compounds and molecular dynamics simulations together with the linear interaction energy method employed for calculating the binding free-energies. The three-dimensional coordinates of two GPCRs, 5HT1B and 5HT2B, were derived from homology modeling and evaluated in the GPCR Dock 2013 assessment. Our models were in good correlation with the experimental structures and all of them placed among the top quarter of all models assessed.  Finally, a computational method, based on molecular dynamics free-energy calculations, for performing alanine scanning was validated with the A2A adenosine receptor bound to either agonist or antagonist. The calculated binding free-energies were found to be in good agreement with experimental data and the method was subsequently extended to non-alanine mutations. With extensive experimental mutation data, this scheme is a valuable tool for quantitative understanding of ligand binding and can ultimately be used for structure-based drug design.

Les accouchements prématurés constituent un problème médical majeur en constante augmentation et ce, malgré tous les efforts mis en œuvre afin de contrer le déclenchement des contractions avant terme. Cette thèse relate du ''design'' rationnel d'un nouvel agent thérapeutique (i.e., tocolytique) qui serait capable de 1) arrêter les contractions, et 2) prolonger la gestation. Pour ce faire, une nouvelle cible, la prostaglandine F2α et son récepteur ont été sélectionnés et le peptidomimétisme a été choisi afin de résoudre cette problématique. L'introduction contient un historique rapide de la conception à la synthèse (''drug design'') du peptide parent, le PDC113, premier peptide a avoir démontré des aptitudes tocolytiques suffisantes pour faire du peptidomimétisme. La deuxième partie de l'introduction présente les concepts du peptidomimétisme appliqués au PDC113 qui ont permis d'accéder au PDC113.824, inhibiteur allostérique du récepteur de la prostaglandine F2α, et explique comment ce mime nous a permis d'élucider les mécanismes de signalisation intracellulaire impliqués dans la contraction musculaire lisse. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude structure-activité de mimes de repliement de tour β au sein du mime peptidique original (PDC113.824) dans lequel nous avons remplacé l'azabicycloalkane central (l'indolizidin-2-one) par une série d'autres azabicycloalcanes connus et des acides aza-aminés dont nous avons élaboré la synthèse. Dans un premier temps, une nouvelle stratégie de synthèse en solution de l'aza-glycyl-proline à partir de la diphényle hydrazone et du chloroformate de p-nitrophényle a été réalisée. Cette stratégie a permis d'éliminer les réactions secondaires de cyclisation intramoléculaires communément obtenues lors de l'introduction d'acides aza-aminés avec les protections traditionnelles de type carbamate en présence de phosgène, mais aussi de faciliter l'accès en une étape à des dérivés peptidiques du type aza-glycyle. L'élongation de l'aza-glycyl-proline en solution nous a permis d'accéder à un nouveau mime tetrapeptidique du Smac, un activateur potentiel de l'apoptose au sein de cellules cancéreuses. Par la suite, nous avons développé une stratégie de diversification sélective de l'azote α du résidu azaglycine en utilisant différents types d'halogénures d'alkyle en présence de tert-butoxyde de potassium. Afin de valider le protocole d'alkylation de l'aza-dipeptide, différents halogénures d'alkyle ont été testés. Nous avons également démontré l'utilité des aza-dipeptides résultants en tant que ''building block'' afin d'accéder à une variété d'azapeptides. En effet, l'aza-dipeptide a été déprotégée sélectivement soit en N-terminal soit en C-terminal, respectivement. D'autre part, la libération de l'amine de l'ester méthylique de l'aza-alkylglycyl-proline a conduit à une catégorie de composés à potentiel thérapeutique, les azadicétopipérazines (aza-DKP) par cyclisation intramoléculaire. Enfin, notre intérêt quant au développement d'un nouvel agent tocolytique nous a amené à développer une nouvelle voie de synthèse en solution du PDC113.824 permettant ainsi d'élucider les voies de signalisation intracellulaires du récepteur de la prostaglandine F2α. Afin de valider l'importance de la stéréochimie et d'étudier la relation structure/ activité du mime, nous avons remplacé l'indolizidin-2-one (I2aa) centrale du PDC113.824 par une série d'autres azabicycloalcanes et azadipeptides. Les azabicycloalcanes D-I2aa, quinolizidinone, et indolizidin-9-one ont été synthétisés et incorporés au sein du dit peptide ne donnant aucune activité ni in vitro ni ex vivo, validant ainsi l'importance du tour β de type II' pour le maintien de l'activité biologique du PDC113.824. Finalement, l'insertion d'une série de dérivés aza(alkyl)glycyl-prolyles a mené à de nouveaux inhibiteurs allostériques du récepteur de la PGF2α, l'un contenant l'azaglycine et l'autre, l'azaphénylalanine. Cette thèse a ainsi contribué, grâce à la conception et l'application de nouvelles méthodes de synthèse d'aza-peptides, au développement de nouveaux composés à potentiel thérapeutique afin d'inhiber le travail prématuré. / Premature birth is a steadily increasing major medical problem, in spite of efforts made to counter the onset of preterm contractions. This thesis describes the rational design of a new therapeutic agent (i.e., tocolytic) capable of 1) stopping uterine contractions, and 2) prolonging gestation. The prostaglandin F2α receptor was explored for tocolytic development and a peptidomimetic approach was developed to produce modulators of this novel target. A brief discussion introduces the impact of preterm birth and history on the design and synthesis of a peptide lead, PDC113, to address this unmet medical need. Subsequently, the peptidomimetic approach is described for converting PDC113 to the small molecule PDC113.824, which was shown to be an allosteric modulator of prostaglandin F2α receptor, which mediates intracellular signalling pathways involved in uterine contraction. This thesis presents the design, synthesis and structure-activity relationship study of the peptide mimic PDC113.824, in which we have replaced the central β-turn mimic moiety, the indolizidin-2-one amino acid, by a series of other previously reported azabicycloalcane turn mimics and novel aza-amino acids. To accomplish the latter, new solution-phase methods for synthesizing aza-glycyl-proline analogs were developed starting from diphenyl hydrazone and p-nitrophenyl chloroformate. This strategy has surmounted side reactions such as the intramolecular cyclization commonly obtained with traditional coupling reactions employing alkyl-carbazates and phosgene, facilitating access to aza-glycyl-proline derivatives by a one step reaction. The modification of the aza-glycyl-proline using conventional strategies led to a new Smac mimic (a proapoptotic molecule), with potential as a tetrapeptide activator of apoptosis in cancer cells. Subsequently, we focused on the diversification of the aza-glycine residue by selective alkylation using different alkyl halides in the presence of potassium tert-butoxide. To validate the alkylation protocol, various alkyl groups were employed, and the usefulness of the resulting aza-dipeptides as ''building blocks'' was examined. Conditions were developed for selectively unmasking the protecting groups at the N- and C-terminal of the aza-dipeptide. In addition, removal of the amine protection of aza-alkylglycyl-proline methyl ester gave access to a class of compounds with therapeutic potential, the aza-diketopiperazines (aza-DKP), by intramolecular cyclization. Finally, our interest in developing a new tocolytic agent led us to develop a new solution-phase synthetic route to PDC113.824 for elucidating the intracellular signalling pathways of prostaglandin F2α receptor. To explore the importance of stereochemistry and to study the relationship between structure and activity, we replaced the central indolizidin-2-one (I2aa) of PDC113.824 by a series of others azabicycloalcanes and aza-dipeptides. The D-I2aa, quinazolidinone and indolizidin-9-one analogs were synthesized and incorporated into the mimic; however, none exhibited activity neither in vitro nor ex vivo, thus indicating the importance of a type II' β-turn for maintaining biological activity of PDC113.824. Finally, the synthesis of a series of aza(alkyl)glycyl-prolyl analogs led to new allosteric modulators of the PGF2α receptor, one containing aza-glycine and another aza-phenylalanine. This results reported in this thesis have contributed to the development of novel agents with promise for inhibiting preterm labor by the conception and application of new methods for making aza-peptides.

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Le VIP (ou vasoactive intestinal peptide) est un neuropeptide actif au niveau du syst¨¨me nerveux central et p¨¦riph¨¦rique (syst¨¨mes cardiovasculaire, respiratoire, tractus gastro-intestinal¡­). Il agit sur ces tissus cibles par interaction avec les r¨¦cepteurs VPAC1 et VPAC2, pour lesquels il poss¨¨de une haute affinit¨¦. Ces r¨¦cepteurs appartiennent ¨¤ la classe II des r¨¦cepteurs ¨¤ 7 h¨¦lices transmembranaires coupl¨¦s aux prot¨¦ines G, distincte de celle des r¨¦cepteurs apparent¨¦s ¨¤ la rhodopsine. En r¨¦ponse au VIP, ils stimulent pr¨¦f¨¦rentiellement l'ad¨¦nylate cyclase. Seul le r¨¦cepteur VPAC1 est capable, lorsqu'il est exprim¨¦ ¨¤ haute concentration, d¡¯augmenter les concentrations de calcium intracellulaire :G*i participe ¨¤ cette interaction. L'exposition des deux r¨¦cepteurs au VIP n'aboutit pas seulement ¨¤ leur activation :elle induit une succession de m¨¦canismes cellulaires intrins¨¨ques responsables d'une diminution de la capacit¨¦ du r¨¦cepteur ¨¤ r¨¦pondre ¨¤ un agoniste :la d¨¦sensibilisation. <p>Diff¨¦rents processus peuvent contribuer ¨¤ la d¨¦sensibilisation d¡¯un r¨¦cepteur :le d¨¦couplage du r¨¦cepteur de la prot¨¦ine G, la s¨¦questration du r¨¦cepteur, ou encore leur "down regulation", r¨¦sultat ¨¤ plus long terme de la perte d'une partie du pool total de r¨¦cepteurs. Les m¨¦canismes impliqu¨¦s d¨¦pendent du r¨¦cepteur consid¨¦r¨¦ et de l'¨¦quipement prot¨¦ique de la cellule. <p>Il a ¨¦t¨¦ r¨¦cemment montr¨¦ que le r¨¦cepteur VPAC1 humain ¨¦tait phosphoryl¨¦ (en position S447) en r¨¦ponse ¨¤ l¡¯agoniste, que la ¦Â-arrestine ¨¦tait transloqu¨¦e ¨¤ la membrane plasmique et que l¡¯internalisation qui s¡¯en suivait induisait un ph¨¦nom¨¨ne dynamine-d¨¦pendant. Aucune information plus pr¨¦cise n¡¯est r¨¦f¨¦r¨¦e dans la litt¨¦rature. <p>Ce travail de th¨¨se a donc consist¨¦ en une ¨¦tude plus approfondie de la phosphorylation, l¡¯internalisation et la r¨¦cup¨¦ration du r¨¦cepteur VPAC1 humain.<p><p>Dans un premier temps, nous nous sommes consacr¨¦ ¨¤ l¡¯¨¦laboration d¡¯un anticorps monoclonal sp¨¦cifique anti-r¨¦cepteur afin de visualiser le r¨¦cepteur. Nous avons eu recours ¨¤ l¡¯immunisation g¨¦n¨¦tique qui consiste ¨¤ injecter l¡¯antig¨¨ne sous forme d¡¯ADN. <p>Une majorit¨¦ des souris immunis¨¦es ont produit des anticorps. L¡¯une d¡¯entre-elle a permis de g¨¦n¨¦rer un anticorps monoclonal, lequel a ¨¦t¨¦ compl¨¨tement caract¨¦ris¨¦ :les r¨¦sultats obtenus par FACS montrent qu¡¯il est sp¨¦cifique, s¨¦lectif et que son ¨¦pitope est localis¨¦e au sein de l¡¯extr¨¦mit¨¦ amino-terminale du r¨¦cepteur (figure 1). Il n¡¯interf¨¨rent pas avec la liaison du ligand et ne modifie en rien l¡¯activation du r¨¦cepteur par celui-ci. Cet anticorps monoclonal ne permet pas de d¨¦tecter le r¨¦cepteur par Western Blott, mais est capable de l¡¯immunopr¨¦cipiter. <p><p>Dans un second temps, nous avons abord¨¦ l¡¯¨¦tude de la phosphorylation, de l¡¯internalisation et du trafficking du r¨¦cepteur VPAC1 humain.<p> / Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’architecture polarisée des neurones est mise en place est maintenue grâce à un adressage hautement contrôlé de protéines vers l’axone ou vers le compartiment somatodendritique. Parmi ces protéines, les récepteurs aux protéines G (RCPG) neuronaux sont des cibles pharmacologiques clés. Cependant, leur pharmacologie est généralement étudiée dans des lignées cellulaires non polarisées et les résultats obtenus dans ces systèmes ne caractérisent pas correctement les effets physiologiques de l’activation des RCPG présents dans le cerveau. Par conséquent, un des principaux sujets de recherche de notre équipe est de comprendre comment la polarité neuronale influe sur la pharmacologie des RCPG, en étudiant l’un des RCPG les plus abondants dans le cerveau : le récepteur cannabinoïque de type-1 (CB1R). Les études précédentes de notre groupe ont suggéré que CB1R acquiert une polarisation axonale grâce à un adressage transcytotique : après leur synthèse, ces récepteurs apparaissent sur la membrane plasmique somatodendritique d’où ils sont rapidement enlevés par endocytose constitutive puis adressés à la membrane plasmique axonale où ils s’accumulent du fait d’une endocytose réduite. Au début de ma thèse, nous avons directement mesuré cette endocytose différentielle et le transport transcytotique de CB1R en utilisant des neurones de rats mis en culture dans des dispositifs microfluidiques. De plus, nous avons montré que des traitements pharmacologiques prolongés peuvent fortement changer la distribution de RCPG à la surface neuronale. Ces résultats démontrent que l’équilibre endocytotique dépendant du compartiment neuronal, qui est contrôlable pharmacologiquement, est important pour la distribution des RCPG neuronaux. Dans une seconde partie, nous avons étudié si le trafic différentiel de CB1R entre axones et dendrites est corrélé avec une pharmacologie différentielle. CB1R est majoritairement couplé à des protéines de type Gi/o et est connu pour inhiber la production d’AMPc. Nous avons donc développé l’imagerie par Föster Resonance Energy Transfer (FRET) appliqué aux cultures de neurones d’hippocampe de rats afin de mesurer la modulation de la voie de signalisation AMPc/PKA en aval de CB1R endogènes dans l’ensemble des compartiments neuronaux : somata, dendrites, mais aussi dans les axones matures très fins. Nos résultats montrent que CB1R possède une pharmacologie différente entre les dendrites et les axones. Notamment, son activation conduit à une diminution plus forte de l’activité basale de la PKA dans les axones comparé aux dendrites, lié au plus grand nombre de récepteurs présents sur la membrane de ce compartiment. De plus, nous démontrons que, contrairement aux récepteurs axonaux, les CB1R somatodendritiques inhibent constitutivement la voie AMPc/PKA. Cette différence est due à la distribution polarisée de la DAGLipase, l’enzyme synthétisant l’endocannabinoïde principal, le 2-arachidonoyglycerol (2-AG). De plus, l’inhibition pharmacologique de la DAGL modifie l’efficacité de plusieurs agonistes de CB1R dans le compartiment somatodendritique mais pas dans l’axone. Cet effet pourrait être dû à une modulation allostérique. Dans une troisième partie, nous avons étudié si les résultats ci-dessus peuvent être généralisés à d’autres RCPG. Etant donné que l’adressage axonal et la pharmacologie in vitro des récepteurs sérotoninergiques 5-HT1B montrent de fortes similitudes avec ceux de CB1R, nous avons étudié la pharmacologie de ces récepteurs en utilisant la technique de FRET développée précédemment. De façon similaire, nous avons trouvé une pharmacologie différentielle entre l’axone et les dendrites. / Polarized neuronal architecture is achieved and maintained mainly through highly controlled targeting of proteins to axons versus to the somatodendritic compartment. Among these proteins, neuronal G protein coupled receptors (GPCRs) are key therapeutic targets. However, their pharmacology is generally studied in non-polarized cell lines, and results obtained in such systems likely do not fully characterize the physiological effects of brain GPCR activation. Therefore, a main research subject of our group is to understand how neuronal polarity influences GPCR pharmacology, by studying one of the most abundant GPCR in the brain: the type-1 cannabinoid receptor (CB1R). Previous studies of the group suggested that CB1Rs achieve axonal polarization through transcytotic targeting: after their synthesis, these receptors appear on the somatodendritic plasma membrane from where they are removed rapidly by constitutive endocytosis and then targeted to the axonal plasma membrane where they accumulate due to relatively reduced endocytosis rate. At the beginning of my PhD project we directly demonstrated this differential endocytosis and transcytotic transport of CB1Rs by using cultured neurons in microfluidic devices. Moreover, we showed that chronic pharmacological treatments may strongly change neuronal GPCR distribution on the neuronal surface. These results demonstrate that subdomain-dependent steady-state endocytosis, which is pharmacologically controllable, is important for GPCR distribution in neurons. In a second part, we asked if differential traffic of CB1Rs between axons and dendrites is correlated with differential pharmacology. CB1R is predominantly coupled to Gi/o proteins and is known to inhibit cAMP production. Thus, we developed live Föster Resonance Energy Transfer (FRET) imaging in cultured hippocampal neurons in order to measure basal cAMP/PKA pathway modulation downstream of endogenous CB1Rs in all neuronal compartments: in somata, in dendrites but also in the very thin mature axons. Our results show that CB1R displays differential pharmacology between axon and dendrites. Notably, its activation leads to a stronger decrease of PKA activity in axons compared to dendrites, due to increased number of membrane receptors in this compartment. Moreover, we demonstrate that somatodendritic CB1Rs constitutively inhibit cAMP/PKA pathway, while axonal receptors do not. This difference is due to polarized distribution of DAGLipase, the enzyme that synthesizes the major endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG). Moreover, blocking DAGL by pharmacological treatment modifies somatodendritic, but not axonal effects of several CB1R agonists, possibly through allosteric action. In a third part, we asked if the above results may be generalized to other GPCRs. Because the axonal targeting and in vitro pharmacology of 5-HT1B serotonin receptors demonstrate strong similarities with CB1Rs, we studied their neuronal pharmacology by using the previously developed FRET technique. We found similar differential responses to pharmacological treatments between axon and dendrites. In a fourth part, we investigated the role of the threonine 210 (T210) residue in the constitutive activity of neuronal CB1R. We showed that the hypoactive mutant T210A-CB1R do not constitutively recruit signaling pathways even in somatodendritic compartment, where 2-AG is present. This result demonstrates that T210 is necessary for constitutive CB1R activation by 2-AG.Finally, previous results of our group demonstrated the involvement of CB1R in neuronal development. Notably, CB1R activation was shown to have an overall inhibitory effect on the development of polarized neuronal morphology. We established a bibliographic review on this subject. The published literature data suggest that not only neuronal polarization influences both CB1R traffic and pharmacology but CB1Rs also contribute to the achievement of neuronal polarization. (...)

Les accouchements prématurés constituent un problème médical majeur en constante augmentation et ce, malgré tous les efforts mis en œuvre afin de contrer le déclenchement des contractions avant terme. Cette thèse relate du ''design'' rationnel d'un nouvel agent thérapeutique (i.e., tocolytique) qui serait capable de 1) arrêter les contractions, et 2) prolonger la gestation. Pour ce faire, une nouvelle cible, la prostaglandine F2α et son récepteur ont été sélectionnés et le peptidomimétisme a été choisi afin de résoudre cette problématique. L'introduction contient un historique rapide de la conception à la synthèse (''drug design'') du peptide parent, le PDC113, premier peptide a avoir démontré des aptitudes tocolytiques suffisantes pour faire du peptidomimétisme. La deuxième partie de l'introduction présente les concepts du peptidomimétisme appliqués au PDC113 qui ont permis d'accéder au PDC113.824, inhibiteur allostérique du récepteur de la prostaglandine F2α, et explique comment ce mime nous a permis d'élucider les mécanismes de signalisation intracellulaire impliqués dans la contraction musculaire lisse. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude structure-activité de mimes de repliement de tour β au sein du mime peptidique original (PDC113.824) dans lequel nous avons remplacé l'azabicycloalkane central (l'indolizidin-2-one) par une série d'autres azabicycloalcanes connus et des acides aza-aminés dont nous avons élaboré la synthèse. Dans un premier temps, une nouvelle stratégie de synthèse en solution de l'aza-glycyl-proline à partir de la diphényle hydrazone et du chloroformate de p-nitrophényle a été réalisée. Cette stratégie a permis d'éliminer les réactions secondaires de cyclisation intramoléculaires communément obtenues lors de l'introduction d'acides aza-aminés avec les protections traditionnelles de type carbamate en présence de phosgène, mais aussi de faciliter l'accès en une étape à des dérivés peptidiques du type aza-glycyle. L'élongation de l'aza-glycyl-proline en solution nous a permis d'accéder à un nouveau mime tetrapeptidique du Smac, un activateur potentiel de l'apoptose au sein de cellules cancéreuses. Par la suite, nous avons développé une stratégie de diversification sélective de l'azote α du résidu azaglycine en utilisant différents types d'halogénures d'alkyle en présence de tert-butoxyde de potassium. Afin de valider le protocole d'alkylation de l'aza-dipeptide, différents halogénures d'alkyle ont été testés. Nous avons également démontré l'utilité des aza-dipeptides résultants en tant que ''building block'' afin d'accéder à une variété d'azapeptides. En effet, l'aza-dipeptide a été déprotégée sélectivement soit en N-terminal soit en C-terminal, respectivement. D'autre part, la libération de l'amine de l'ester méthylique de l'aza-alkylglycyl-proline a conduit à une catégorie de composés à potentiel thérapeutique, les azadicétopipérazines (aza-DKP) par cyclisation intramoléculaire. Enfin, notre intérêt quant au développement d'un nouvel agent tocolytique nous a amené à développer une nouvelle voie de synthèse en solution du PDC113.824 permettant ainsi d'élucider les voies de signalisation intracellulaires du récepteur de la prostaglandine F2α. Afin de valider l'importance de la stéréochimie et d'étudier la relation structure/ activité du mime, nous avons remplacé l'indolizidin-2-one (I2aa) centrale du PDC113.824 par une série d'autres azabicycloalcanes et azadipeptides. Les azabicycloalcanes D-I2aa, quinolizidinone, et indolizidin-9-one ont été synthétisés et incorporés au sein du dit peptide ne donnant aucune activité ni in vitro ni ex vivo, validant ainsi l'importance du tour β de type II' pour le maintien de l'activité biologique du PDC113.824. Finalement, l'insertion d'une série de dérivés aza(alkyl)glycyl-prolyles a mené à de nouveaux inhibiteurs allostériques du récepteur de la PGF2α, l'un contenant l'azaglycine et l'autre, l'azaphénylalanine. Cette thèse a ainsi contribué, grâce à la conception et l'application de nouvelles méthodes de synthèse d'aza-peptides, au développement de nouveaux composés à potentiel thérapeutique afin d'inhiber le travail prématuré. / Premature birth is a steadily increasing major medical problem, in spite of efforts made to counter the onset of preterm contractions. This thesis describes the rational design of a new therapeutic agent (i.e., tocolytic) capable of 1) stopping uterine contractions, and 2) prolonging gestation. The prostaglandin F2α receptor was explored for tocolytic development and a peptidomimetic approach was developed to produce modulators of this novel target. A brief discussion introduces the impact of preterm birth and history on the design and synthesis of a peptide lead, PDC113, to address this unmet medical need. Subsequently, the peptidomimetic approach is described for converting PDC113 to the small molecule PDC113.824, which was shown to be an allosteric modulator of prostaglandin F2α receptor, which mediates intracellular signalling pathways involved in uterine contraction. This thesis presents the design, synthesis and structure-activity relationship study of the peptide mimic PDC113.824, in which we have replaced the central β-turn mimic moiety, the indolizidin-2-one amino acid, by a series of other previously reported azabicycloalcane turn mimics and novel aza-amino acids. To accomplish the latter, new solution-phase methods for synthesizing aza-glycyl-proline analogs were developed starting from diphenyl hydrazone and p-nitrophenyl chloroformate. This strategy has surmounted side reactions such as the intramolecular cyclization commonly obtained with traditional coupling reactions employing alkyl-carbazates and phosgene, facilitating access to aza-glycyl-proline derivatives by a one step reaction. The modification of the aza-glycyl-proline using conventional strategies led to a new Smac mimic (a proapoptotic molecule), with potential as a tetrapeptide activator of apoptosis in cancer cells. Subsequently, we focused on the diversification of the aza-glycine residue by selective alkylation using different alkyl halides in the presence of potassium tert-butoxide. To validate the alkylation protocol, various alkyl groups were employed, and the usefulness of the resulting aza-dipeptides as ''building blocks'' was examined. Conditions were developed for selectively unmasking the protecting groups at the N- and C-terminal of the aza-dipeptide. In addition, removal of the amine protection of aza-alkylglycyl-proline methyl ester gave access to a class of compounds with therapeutic potential, the aza-diketopiperazines (aza-DKP), by intramolecular cyclization. Finally, our interest in developing a new tocolytic agent led us to develop a new solution-phase synthetic route to PDC113.824 for elucidating the intracellular signalling pathways of prostaglandin F2α receptor. To explore the importance of stereochemistry and to study the relationship between structure and activity, we replaced the central indolizidin-2-one (I2aa) of PDC113.824 by a series of others azabicycloalcanes and aza-dipeptides. The D-I2aa, quinazolidinone and indolizidin-9-one analogs were synthesized and incorporated into the mimic; however, none exhibited activity neither in vitro nor ex vivo, thus indicating the importance of a type II' β-turn for maintaining biological activity of PDC113.824. Finally, the synthesis of a series of aza(alkyl)glycyl-prolyl analogs led to new allosteric modulators of the PGF2α receptor, one containing aza-glycine and another aza-phenylalanine. This results reported in this thesis have contributed to the development of novel agents with promise for inhibiting preterm labor by the conception and application of new methods for making aza-peptides.

Background: A large number of human inherited and acquired diseases and phenotypes are caused by mutations in G protein-coupled receptors (GPCR). Genome-wide association studies (GWAS) have shown that variations in the ADGRD1 (GPR133) locus are linked with differences in metabolism, human height and heart frequency. ADGRD1 is a Gs protein-coupled receptor belonging to the class of adhesion GPCRs. Results: Analysis of more than 1000 sequenced human genomes revealed approximately 9000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the human ADGRD1 as listed in public data bases. Approximately 2.4 % of these SNPs are located in exons resulting in 129 non-synonymous SNPs (nsSNPs) at 119 positions of ADGRD1. However, the functional relevance of those variants is unknown. In-depth characterization of these amino acid changes revealed several nsSNPs (A448D, Q600stop, C632fs [frame shift], A761E, N795K) causing full or partial loss of receptor function, while one nsSNP (F383S) significantly increased basal activity of ADGRD1. Conclusion: Our results show that a broad spectrum of functionally relevant ADGRD1 variants is present in the human population which may cause clinically relevant phenotypes, while being compatible with life when heterozygous.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第18443号 / 理博第4003号 / 新制||理||1577(附属図書館) / 31321 / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)准教授 今元 泰, 教授 高田 彰二, 教授 森 和俊 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM