Les cellules sont capables de détecter les distributions spatiales de protéines et ainsi de migrer ou s’étendre dans la direction appropriée. Une compréhension de la réponse cellulaire aux modifications de ces distributions spatiales de protéines est essentielle pour l’avancement des connaissances dans plusieurs domaines de recherches tels que le développement, l’immunologie ou l’oncologie. Un exemple particulièrement complexe est le guidage d’axones se déroulant pendant le développement du système nerveux. Ce dernier nécessite la présence de plusieurs distributions de molécules de guidages étant attractives ou répulsives pour connecter correctement ce réseau complexe qu’est le système nerveux. Puisque plusieurs indices de guidage collaborent, il est particulièrement difficile d’identifier la contribution individuelle ou la voie de signalisation qui est déclenchée in vivo, il est donc nécessaire d’utiliser des méthodes pour reproduire ces distributions de protéines in vitro. Plusieurs méthodes existent pour produire des gradients de protéines solubles ou liées aux substrats. Quelques méthodes pour produire des gradients solubles sont déjà couramment utilisées dans plusieurs laboratoires, mais elles limitent l’étude aux distributions de protéines qui sont normalement sécrétées in vivo. Les méthodes permettant de produire des distributions liées au substrat sont particulièrement complexes, ce qui restreint leur utilisation à quelques laboratoires. Premièrement, nous présentons une méthode simple qui exploite le photoblanchiment de molécules fluorescentes pour créer des motifs de protéines liées au substrat : Laser-assisted protein adsorption by photobleaching (LAPAP). Cette méthode permet de produire des motifs de protéines complexes d’une résolution micrométrique et d’une grande portée dynamique. Une caractérisation de la technique a été faite et en tant que preuve de fonctionnalité, des axones de neurones du ganglion spinal ont été guidés sur des gradients d’un peptide provenant de la laminine. Deuxièmement, LAPAP a été amélioré de manière à pouvoir fabriquer des motifs avec plusieurs composantes grâce à l’utilisation de lasers à différentes longueurs d’onde et d’anticorps conjugués à des fluorophores correspondants à ces longueurs d’onde. De plus, pour accélérer et simplifier le processus de fabrication, nous avons développé LAPAP à illumination à champ large qui utilise un modulateur spatial de lumière, une diode électroluminescente et un microscope standard pour imprimer directement un motif de protéines. Cette méthode est particulièrement simple comparativement à la version originale de LAPAP puisqu’elle n’implique pas le contrôle de la puissance laser et de platines motorisées, mais seulement d’envoyer l’image du motif désiré au modulateur spatial. Finalement, nous avons utilisé LAPAP pour démontrer que notre technique peut être utilisée dans des analyses de haut contenu pour quantifier les changements morphologiques résultant de la croissance neuronale sur des gradients de protéines de guidage. Nous avons produit des milliers de gradients de laminin-1 ayant différentes pentes et analysé les variations au niveau du guidage de neurites provenant d’une lignée cellulaire neuronale (RGC-5). Un algorithme pour analyser les images des cellules sur les gradients a été développé pour détecter chaque cellule et quantifier la position du centroïde du soma ainsi que les angles d’initiation, final et de braquage de chaque neurite. Ces données ont démontré que les gradients de laminine influencent l’angle d’initiation des neurites des RGC-5, mais n’influencent pas leur braquage. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse faciliteront l’utilisation de motifs de protéines liées au substrat dans les laboratoires des sciences de la vie, puisque LAPAP peut être effectué à l’aide d’un microscope confocal ou d’un microscope standard légèrement modifié. Cela pourrait contribuer à l’augmentation du nombre de laboratoires travaillant sur le guidage avec des gradients liés au substrat afin d’atteindre la masse critique nécessaire à des percées majeures en neuroscience. / Cells are able to sense spatial distribution of proteins and accordingly migrate or extend in the appropriate direction. Understanding cellular responses to modifications in molecular spatial distributions is essential for advances in several fields such as development, immunology and oncology. A particularly complex example is axonal guidance that occurs during the development of the nervous system, which relies on distributions of attractive and repulsive guidance molecules to correctly wire this intricate network. Since several guidance cues collaborate to development of the nervous system, it is particularly difficult to assess the individual contribution of each cue and the signaling cascade each trigger in vivo; therefore methods to reproduce those distributions individually in vitro are necessary to study in detail the effect of each guidance cue. Several methods exist to produce graded distributions of protein that are either soluble or substrate-bound. A few methods making solution gradients are already widely used in several laboratories to perform experiments with the guidance cues that are normally diffusing in vivo. However, current methods allowing the fabrication of substrate-bound gradients are quite complex, which restrict their use to a few laboratories. First, we present a straightforward method exploiting photobleaching of a fluorescently tagged molecule using a visible laser to generating substrate-bound protein patterns: Laser-assisted protein adsorption by photobleaching (LAPAP). This method allows producing complex patterns of protein with micron spatial resolution and high dynamic range. An extensive characterization of the technique was performed and as proof of functionality, axons from dorsal root ganglions cells were guided on laminin peptide gradients. Secondly, LAPAP was improved in order to produce multicomponent patterns by using lasers at different wavelengths and antibodies conjugated to fluorophores corresponding to these wavelengths. Moreover, to speed-up the fabrication process and simplify the device, we developed widefield illumination LAPAP which uses a spatial light modulator, a light emitting diode and a standard microscope to directly print patterns. This patterning method is relatively simple compared to the original LAPAP setup, since it does not involve controlling the laser power or a motorized stage, but only sends an image of the desired pattern to a spatial light modulator. Finally, we used LAPAP to show how it could be used in automated high-content screening assays to quantify the morphological changes resulting from axon growth on gradients of guidance proteins. We produced thousands of laminin-1 gradients of different slopes and analyzed the variations in neurite guidance of neuron-like cells (RGC-5). An image analysis algorithm was developed to process bright field microscopy images, detecting each cell and quantifying the soma centroid and the initiation, terminal and turning angles of the maximal neurite. This data showed that laminin gradients influence the initiation angle of neurite extension of RGC-5, but does not contribute to its turning. We believe that the results presented in this thesis will facilitate the use of substrate- bound protein patterning in typical life science laboratories, since a confocal microscope or a slightly modified standard microscope is the only specialized equipment needed to fabricate patterns by LAPAP. This could increase the number of laboratories working with substrate-bound protein patterns in order to reach the critical mass necessary for major advances in neuroscience.

Les interfaces haptiques sont des dispositifs relativement récents issus du monde de la robotique et de l'informatique, qui permettent de générer des retours sensoriels à destination de l'utilisateur. Or, il est difficile à l'heure actuelle d'identifier avec précision les influences de ces retours sensoriels sur la réalisation de tâches dans lesquelles ils se trouvent appliqués. Par exemple, pouvons nous utiliser ces dispositifs en vue de fournir une aide (ou un guidage) au geste réalisé ? Le fait d'ajouter des informations tactiles modifie-t-il notre perception de la tâche ? Comment le geste d'un chirurgien sera-t-il modifié en présence d'un dispositif haptique dans un simulateur de chirurgie ? Afin d'apporter des éléments de réponse à ces multiples interrogations, nous avons étudié les effets de l'ajout d'interfaces haptiques ou/et tactiles sur le suivi manuel de trajectoires bidimensionnelles ou tridimensionnelles au mode visuel classique de retour d'informations. Ce travail se situe à la frontière de plusieurs disciplines impliquant la compréhension des mécanismes cognitifs de traitement des informations somesthésique multi sensorielles (psychologie cognitive), l'étude du fonctionnement de ces dispositifs et donc la manière dont les informations numériques sont calculées (informatique et robotique) et la mise en œuvre de ces appareils dans une contexte de simulation (réalité virtuelle). Suite à une première partie bibliographique sur les caractéristiques du toucher, les dispositifs haptique et la problématique de guidage haptique, de nombreuses questions relatives à l'analyse de la performance humaine subsistent. Nos premières contributions quant au choix de méthodes d'analyses et des indices liés à la mesure de la performance du geste manuel sont exposées dans la seconde partie de ce rapport. L'étude proprement dite de l'influence des dispositifs haptique a été conduite dans la troisième partie de ce manuscrit, à travers une série d'expérimentations impliquant des trajectoires bidimensionnelles (geste d'écriture) ou tridimensionnelles (en réalité virtuelle ou dans l'utilisation au sein d'un simulateur de chirurgie), différents types de dispositifs haptiques (vibrotactiles ou à retour d'effort) et de multiples tâches (écriture, manipulation dans une configuration de réalité virtuelle ou encore chirurgie de la base du crâne). Ces expérimentations nous ont permis d'apporter une meilleure compréhension des implications des dispositifs haptiques sur le geste manuel en terme de modification des indices haptiques présents et de guidage haptique. La dernière partie de ce rapport intègre nos résultats de recherches dans une discussion transversale, apportant des tentatives de réponses à la problématique du sujet et un certain nombre de perspectives.

La plupart des environnements de navigation de gestes interventionnels utilisant des aiguilles font l'hypothèse que celles-ci ne se déforment pas durant l'intervention. En pratique, cette hypothèse n'est pas toujours vérifiée car les aiguilles intéragissent avec les tissus lors des insertions et subissent alors des déformations parfois importantes. Cet effet provoque une perte de précision sur le geste réalisé. Ma thèse fait partie du projet ANR GAME-D dont l'objectif est de répondre à cette problématique par l'étude et le prototypage d'une aiguille instrumentée qui permettra à terme aux cliniciens de visualiser la déformation de l'aiguille en 3D et en temps réel. Mes travaux de recherche se focalisent sur la reconstruction de la déformée d'une aiguille instrumentée à partir des capteurs de déformations fixés à sa surface. L'impératif de précision nécessaire à une utilisation clinique du dispositif se heurte alors aux limitations techniques qui restreignent fortement le nombre de capteurs de déformation implantable sur une aiguille. Les méthodes développées pour résoudre cette problématique s'articulent autour de deux thématiques: l'obtention des données de capteurs et leurs exploitations. L'utilisation de la théorie des poutres permet, par l'etude des déformations des capteurs, d'obtenir des informations de déformations supplémentaires tel que la torsion. Elle permet également de développer des méthodes de reconstruction capables d'exploiter ces nouvelles informations et qui se révèlent donc plus précises. Une méthode d'optimisation des positions de capteurs fondée sur des données expérimentales de piqués d'aiguille est proposée. Les positions optimales calculées permettent d'augmenter la significativité des données renvoyées par les capteurs. Le traitement statistiques réalisé à partir des données expérimentales permet d'extraire les caractéristiques des déformations des aiguilles dans les tissus et de les utiliser dans une méthode de reconstruction spécifiquement développé. La représentativité de ces caractéristiques aide alors à la reconstruction de la déformée. / Most of navigation system dedicated to interventional radiology make the assumption that needles stay straight during insertions in tissues. In practice, this hypothesis is not verified as the interactions between needles and surrounding tissues cause the needles to bend, resulting in a loss of accuracy. My PhD thesis is a part of the national projet GAME-D whose goal is to solve that problem by developing and studying instrumented needles which should eventually provide 3D deformed shape of the needle to clinicians in real-time. My reasearch work focus on reconstruction of deformed needle shape from its strain sensors data. Precision needed for clinical use faces technical limitations which restraint number of sensors embedded on the needle. Methods developped to adress this issue fall into one of these two categories: sensors data retrieving and sensors data processing. Use of beam theory to study sensors deformations gives strain information such as torsion. It also allows to develop reconstruction methods able to use these informations to gain accuracy. An optimization method of the sensors positions based on needle insertions experimental data is proposed. Sensors optimal positions make sensors data much more significant. A statistical processing of experimental data is performed to extract deformation features of needles in tissue. It is further used in a a specially built reconstruction method. Representativeness of these features improve the reconstrution of the deformed shape of the needle.

Les environnements actuels de navigation de gestes interventionnels avec aiguille font l'hypothèse de l'indéformabilité de celle-ci. Hypothèse non vérifiée cliniquement avec comme conséquence immédiate une perte de précision du geste réalisé et à plus long terme de potentielles conséquences morbides. En pratique, cette aiguille peut être amenée à se déformer du fait des interactions avec les tissus. Il est donc nécessaire d'incorporer dans les systèmes de navigation des données sur la déformée de l'aiguille à l'aide, par exemple, de jauges de déformation. Ces dernières permettent d'accéder en temps réel à des informations locales de déformation, a partir desquelles il sera possible de reconstruire la déformée de l'aiguille. L'objectif de ce travail consiste donc à l'élaboration d'une nouvelle génération de système de navigation permettant de localiser en 3D et en temps réel, la déformée d'une aiguille instrumentée. / The current environments of navigation of interventional gestures with needle make the assumption of the indeformability of this one. Unchecked hypothesis clinicaly with as immediate consequence a loss of precision of the gesture carried out and longer-term of potential morbid consequences. In practice, this needle can be brought to deform because of the interactions with tissues. It is thus necessary to incorporate in the navigation systems of the data on the bending of the needle to the assistance, for example, of strain gauges. These last ones allow to reach in real time local information of deformation, has to leave of which it will be possible to rebuild the deformation of the needle. The objective of this work thus consists with the development of a new generation of navigation system allowing to localize in 3D and real time, the deformation of an instrumented needle.

Sérotonine (5-HT) neurones du mésencéphale sont nés de jour embryonnaire 10 à 12, et commencent à étendre axones, peu après la neurogenèse, tant rostrale du télencéphale et caudale du tronc cérébral. Ces projections sont très garantis, mais avec un certain degré d'organisation topographique. Dans le télencéphale, le schéma de la 5-HT innervation provenant de la dorsale (B7, B6) ou de la médiane (B5-B8) se distingue des noyaux. Cependant, il n'y a pas d'études de développement détaillées systématiques chez la souris, qui sont le modèle le plus largement utilisé, en particulier pour les études génétiques. Ces données sont importantes pour rassembler afin d'analyser les effets des mutations de la souris sur la voie moléculaire défini des neurones de la sérotonine. De plus, les molécules de guidage qui dirigent ces neurones du raphé 5-HT à différentes cibles ne sont pas connus. Nous avons effectué de nombreuses études sur l'innervation 5-HT visant à détecter la façon dont la partie dorsale et les noyaux du raphé médian sont ciblées sur des régions différentes du cerveau antérieur au cours du développement.Nous avons étudié le rôle de la signalisation ephrinA-EphA dans le ciblage sélectif. Nos résultats démontrent que l'ARNm EphA5 est exprimé sélectivement dans des sous-populations distinctes de neurones du raphé sérotonine. En particulier, EphA5 présentait le plus haut niveau dans les neurones raphé de la sérotonine dorsale (B7). Les résultats des cultures d'explants in vitro et in vivo électroporation analyses indiquent que les ligands de EphA5 (ephrinA5 et ephrinA3) agissent comme des facteurs répulsifs pour les cônes de croissance de l'axone sérotoninergique. Antérograde traçage dans le ephrinA5 - / - souris ont montré des neurones mauvais ciblage du raphé dorsal projections, y compris la projection sérotoninergique. En particulier, notre analyse de tracer les études montrent que le ciblage des dorsales et raphé médian axones à différentes couches du bulbe olfactif est modifié dans le ephrinA5 KO. Cependant, nous ne savons pas à quel stade de développement de ces altérations se produisent, en particulier si cela reflète un changement dans l'orientation des tracts croissant de fibres, ou si cela reflète la maturation de développement en retard quand axones raphé et garantissent des branches dans les régions cibles spécifiques. Nous avons profité d'une nouvelle méthode morphologique, ce qui permet d'analyser l'étiquetage immunocytochimique dans 3_D. 5-HT immunomarquage, dans la projection du cerveau sérotoninergique dans 3_D. Nos résultats montrent que les fibres sérotoninergiques projetant vers le bulbe olfactif besoin d'un calendrier spécial pour entrer la cible. Le profil d'expression de ephrinA5 suggère que ephrinA5 peut être l'un des facteurs qui modulent ce moment... / In mice, serotonin (5-HT) midbrain neurons are born from embryonic day 10 to 12, and start extending axons, shortly after neurogenesis, both rostrally to the telencephalon and caudally to the brainstem. These projections are highly collateralized but with some degree of topographic organization. In the telencephalon, the pattern of 5-HT innervation arising from the dorsal (B7, B6) or the medial (B5-B8) nuclei differs. However, there are no systematic detailed developmental studies in mice, which are the most extensively used model, in particular for genetic studies. Such data are important to gather in order to analyze the effects of mouse mutations on defined molecular pathway of serotonin neurons. Moreover the guidance molecules that direct these 5-HT raphe neurons to different targets are not known. We performed several studies of 5-HT innervation aimed at detecting how the dorsal and median raphe nuclei are targeted to different forebrain regions during development. We investigated the role of ephrinA-EphA signaling in selective targeting. Our results demonstrate that EphA5 mRNA is selectively expressed in distinct subpopulation of serotonin raphe neurons. Particularly, EphA5 exhibited the highest level in dorsal raphe serotonin neurons (B7). The results of in vitro explant cultures and in vivo electroporation analyses indicated that the ligands of EphA5 (ephrinA5 and ephrinA3) act as repellent factors for the serotonergic axon growth cones. Anterograde tracing in the ephrinA5 -/- mice showed mistargeting of dorsal raphe neurons projections, including the serotonergic projection. Particularly, our analysis of tracing studies show that targeting of the dorsal and median raphe axons to different layers of the olfactory bulb is altered in the ephrinA5 KO. However we do not know at what developmental stage these alterations occur, in particular whether this reflects an alteration in the orientation of ascending fiber tracts, or whether this reflects late developmental maturation when raphe axons collateralize and branch in specific target regions. We have taken advantage a new morphological method, which allows analyzing immunocytochemical labeling in 3_D. 5-HT immunolabeling, in whole brain serotonergic projection in 3_D. Our findings show that serotonergic fibers projecting to olfactory bulb require a special timing to enter the target. The expression pattern of ephrinA5 suggests that ephrinA5 can be one of the factors that modulate this timing. Overall, our results show for the first time the implication a guidance molecule for the region-specific and time-specific targeting of serotonin raphe neurons and has implications for the anatomo-functional parsing of raphe cell groups.

Au cours de nos travaux, nous nous sommes intéressés à l’apprentissage de gestes techniques en environnement virtuel. Ces environnements permettent en effet de se former à un geste réalisable dans un environnement réel, en ayant des aides qui ne seraient quant à elle pas disponibles, comme la trace en trois dimensions du geste par exemple, ou la possibilité de voir son geste d’un point de vue différent. Toutefois dans le cadre du guidage de geste, il s’avère que la plupart des métaphores visuelles usuelles ne tiennent pas ou peu compte du problème de dépendance qu’elles génèrent. L’hypothèse de guidage issue des théories sur l’apprentissage moteur, stipule en effet que l’utilisation continue d’aides pendant l’apprentissage génère une dépendance de l’apprenant vis-à-vis de ces aides. Ce dernier n’est alors plus capable de reproduire correctement le geste ou la tâche demandée sans l’aide de ces aides. Néanmoins, en réalité virtuelle l’utilisation d’aides d’apprentissage reste nécessaire pour la formation. Pour répondre à cette problématique nous proposons une nouvelle métaphore dynamique d’interaction 3D en environnement virtuel, basée sur la modalité visuelle. Notre approche consiste à axer l’apprentissage sur le ressenti de l’utilisateur, en nous basant sur une pédagogie essai-erreur dans le cadre théorique du paradigme de l’énaction. Notre métaphore indique à l’apprenant ses erreurs de trajectoire en temps réel, l’incitant implicitement à se corriger. Notre hypothèse est que lorsque l’aide n’est plus affichée, l’apprenant est capable de reproduire le geste convenablement en se basant sur ses sensations passées. Nous avons conduit une première expérimentation afin de vérifier que notre métaphore permet bien de reproduire un geste présenté au préalable tout en corrigeant les erreurs de trajectoire. Puis, dans un second temps une deuxième expérimentation a démontré que la métaphore permettait d’obtenir de meilleures performances et qu’elle réduisait davantage la dépendance que des métaphores usuelles de guidage. / In the light of our work, we were interested in precise gesture learning in virtual environment. In these environments, learners can train in safer and longer training sessions than in real environments, using augmented feedback that wouldn’t be available otherwise—such as a 3D trace of canonical movements or the opportunity to see your gesture from a different point of view. However, in the context of gesture guidance, most of the usual visual metaphors do not tackle the dependency they generate. The guidance hypothesis, from motor learning theories, states that the continuous use of feedback during early phases of learning leads to a dependency on the feedback. Learners are no longer able to properly reproduce the requested gesture or task without the help of this feedback. However, in virtual environments the use of augmented feedback remains necessary for training. To deal with this issue, we propose a new dynamic metaphor for 3D interaction in virtual environments, based on the visual modality. Our approach is focus users’ training on their intrinsic feedback, by using a trial-and-error strategy. Our metaphor shows users’ trajectory errors in real time, implicitly spurring them to correct these errors. We assume that when the metaphor is no longer visible, learners are able to properly reproduce the gesture using their past experiences. We conducted a first experiment to evaluate the capacity of our metaphor to properly guide learners during gesture training. Then, a second experiment showed that the metaphor allowed learners to improve their performance and that it further reduced the dependency than usual guiding metaphors.

Le développement du système nerveux central fait intervenir de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, la différenciation, l'apoptose, la migration neuronale et le guidage axonal. Ces processus sont finement régulés et aboutissent à la formation d'un système nerveux central fonctionnel. Au cours de cette thèse, je me suis principalement intéressé à une molécule chimiotropique, la Nétrine-1 et à ses récepteurs APP (Amyloïd-b Precursor Protein) et DCC (Deleted in Colorectal Cancer). La Nétrine-1 est impliquée à la fois dans le contrôle de la navigation neuronale (ie migration neuronale et guidage axonal) et dans celui de la survie neuronale. Un premier aspect de mon travail a consisté à étudier le rôle d'un nouveau récepteur à la Nétrine-1 : APP. Nous avons donc démontré que APP est un récepteur à la Nétrine-1 impliqué dans le guidage des axones commissuraux. En effet, APP collabore avec DCC afin de stimuler la croissance axonale en réponse à la Nétrine-1. Le second aspect de mon travail a été l'étude du rôle de la Nétrine-1 en tant que facteur de survie neuronale. En effet, son récepteur DCC appartient à la famille des récepteurs à dépendance. En absence de Nétrine-1, DCC ne reste pas inactif, mais déclenche une signalisation pro-apoptotique qui va éliminer la cellule. Nous avons démontré que pendant le développement du système nerveux, la Nétrine-1 inhibe cette signalisation et contrôle la survie des neurones commissuraux. Le contrôle de la signalisation pro-apoptotique de DCC par la Nétrine-1 pourrait ainsi réaliser un contrôle qualité des projections axonales et faciliter l'orientation du cône de croissance lors du guidage du cône de croissance / The development of the central nervous system requires several cellular processes such as proliferation, differentiation, apoptosis, neuronal migration and axon guidance. This whole process is finely regulated and leads to the formation of a functional central nervous system. During my thesis, I have mainly worked on a chemotropic molecule, Netrin-1 and its receptors APP (Amyloid-ß Precursor Protein) and DCC (Deleted in Colorectal Cancer). Netrin-1 is involved in both neuronal navigation (neuronal migration and axonal guidance) and neuronal survival. I have firstly investigated the role of a new Netrin-1 receptor, APP during axonal guidance. We have shown that APP is involved in the guidance of commissural axons. Indeed, APP collaborates with DCC in order to promote axonal outgrowth in response to Netrin-1. Thereafter, I have investigated the role of Netrin-1 as a neuronal survival factor. In fact, the Netrin-1 receptor DCC belongs to the dependence receptor family. In absence of Netrin-1, DCC does not remain inactive, since it triggers a pro-apoptotic signalling pathway. During the development of the central nervous system, we have shown that Netrin-1 blocks the pro-apoptotic signalling pathway and promotes neuronal survival. The Netrin-1 control of DCC pro-apoptotic signalling might carry out a “quality control” of the axonal projection or/and it could promote the steering of the growth cone during axonal guidance

Chez les espèces ayant une symétrie morphologique bilatérale, les connections entre la gauche et la droite au sein du système nerveux sont appelées commissures. Le développement de nouveaux circuits commissuraux et la modification des circuits existants ont accompagné l’émergence de caractéristiques neurobiologiques essentielles. D’un point de vue moléculaire, le guidage des commissures dépend de couplage ligand-récepteur tels que Netrin-1/DCC, responsable de l’attraction des axones commissuraux, et tel que Slit/Robo3, responsable de la répulsion des axones ayant traversé la ligne médiane. Plusieurs commissures ne se développent pas en absence d’un unique récepteur, le Robo3, contestant ainsi une présumée redondance moléculaire. Tout d’abord, il est impérial de caractériser le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette fonction unique de Robo3 chez les mammifères et au cours de l’évolution. Ensuite, nous visons à extrapoler vers une indentification de nouvelles molécules impliquées dans le développement commissural. Nos travaux ouvrent la voie à une réévaluation du contrôle développemental assuré par Robo3 au sein du système commissural des mammifères. Par biochimie fonctionnelle, nous avons observé que Robo3 du mammifère ni se lie, ni ne réagit aux slits. Par ailleurs, Robo3 interagit avec DCC, ce qui produit une phosphorylation intracellulaire sélective de Robo3 par l’entremise de la Nétrine-1. Cette dernière n’a pas d’effet attractif sur les neurones pontiques dépourvus de Robo3; phénomène qui peut être rétabli chez des souris Robo3 -/- par l’expression de Robo3 mammifère, mais non par l’expression de Robo3 non-mammifère. En conclusion, nous démontrons que la fonction de Robo3 a été spécifiquement convertie lors de l’évolution des mammifères. Une telle diversification mécanistique dérivée de l’évolution moléculaire d’un gène spécifique est susceptible d’être à la base de la précision du contrôle des mouvements volontaires chez les mammifères. / In species with bilateral morphological symmetry, connections between left and right in the nervous system are called commissures. The development of novel commissural circuits and modification of existing ones have accompanied the emergence of key neurobiological features in vertebrate evolution. Molecularly, guidance of commissures relies on ligand-receptor pairs such as Netrin-1/DCC mediating attraction of commissural axons to, and Slit/Robo mediated repulsion of post-crossing axons away from the midline. Arguing against assumed molecular redundancy, many commissures fail to develop in absence of a single receptor, Robo3. The objective of the current work is threefold: first, it sets out to characterize the molecular mechanisms underlying this unique function of Robo3 in mammals and evolutionarily across species. Secondly, we aim to extrapolate towards the identification of new molecules important for commissure development to lastly functionally evaluate some of these putative novel commissural signaling pathways. Our work paves the way to a complete reevaluation of Robo3-mediated developmental control in mammalian commissural systems. Using functional biochemistry, we find that mammalian Robo3 does neither bind nor respond to Slits. Moreover, Robo3 interacts with DCC and Netrin-1 selectively triggers intracellular phosphorylation of mammalian Robo3. Netrin-1 fails to attract pontine neurons lacking Robo3 and attraction can be restored in Robo3-/- mice by expression of mammalian, but not nonmammalian, Robo3. Conclusively, we show that Robo3 function has been uniquely converted during mammalian evolution. Such mechanistic diversification through molecular evolution in one specific gene likely underlies fine-tuning of mammalian voluntary movement control.

Au cours des 20 dernières années, l'utilisation de méthode de guidage par imagerie s'est progressivemen imposé comme gold standar dans nombre d'indications Interventionel antidouleur. Les modalités de guidage els plus utilisés sont la fluoroscopie et l'échographie. Le Scanner est relativement sous-utilisé dans le domaine de la prise en charge interventionnelle de la douleur, principalement en raison des difficultés d'accès et de Disponibilités pour les praticiens de la douleur. Au travers de cette thèse, nous avons montré l'intérêt du guidage scanner dans plusieurs indications avec de bons résultats, grâce à des techniques innovantes* L'Évaluation de l'alcoolisation percutanée du ganglion sphéno-palatin dans la prise en charge de ladouleur cranio-faciale réfractaire, chez 42 patients avec taux d'efficacité globale d'alcoolisation du GSP de67,2% et une durée moyenne de soulagement de la douleur de 10,3 mois. L'analyse a montré un tauxd'efficacité élevé chez les patients avec des algies vasculaires de la face (76,5%) et des syndromesdouloureux faciaux persistent (85,7%)* L' Évaluation de l'efficacité d'un méthode simplifiée d'infiltration sous scanner du nerf grandoccipital (NGO) chez 33 patients souffrant d'une névralgie occipitale avec taux de succès clinique de 86%.En cas de succès clinique, la durée moyenne de soulagement de la douleur suivant la procédure était de9,16 mois.*La comparaison deu block vs. neurolyse par radiofréqence du ganglion stellaire sous guidage scannographique dans la prise en charge du Syndrome Douloureux Régional Complexe de Type 1 du membre supérieur chez 67 patients: on retrouve une efficacité supérieure dans le groupe RFN (67,6%, 23/34) par rapport au groupe de block (21,2%, 7/33) avec un OR de 7,76.* L'Évaluation de la neurolysepar RF des nerfs ilio-inguinal et ilio hypogastrique chez les patients souffrant de douleurs ilio-inguinal et à l'aine réfractaire.• pouvait conduire à une amélioration des résultats. Dans tous les cas, le guidage par Scanner est une valeur ajoutée dans certaines indications, car elle permet en toute sécurité, le placement précis, millimétrique, de l'aiguille. Une autre solution possible afin de réduire les risques liés à certains gestes serait le développement d'une L'Étude préliminaire sur 16 patients traités par RFN a montré une réduction significative dela douleur après RFN pendant 11,8 mois.• Une deuxième étude a été menée permettant de comparer l'efficacité de la RFN et à cellede l'infiltration dans la même indication chez 42 patients: La durée moyenne de soulagementde la douleur était statistiquement supérieure (P = 0,005) dans le groupe RF (12,5 mois)comparé au groupe d'infiltration (1,6 mois).Au cours de ces études publiées, nous avons montré que l'application d'une technique existante (neurolyse, infiltration) à une nouvelle indication, ou la modification d'une technique existante après des considérations anatomiques sonde de radiofréquence unidirectionnel, capable de créer une zone d'ablation en demi sphère dont l'orientation serait contrôlable, ce qui permettrait de réduire les risques d'ablation non désirée.Enfin, il est important de rappeler, que la prise en charge interventionnelle de la douleur d'un patient s'intègre dans une prise en charge globale, centrée autour du patient. Ainsi, la prise en charge d'un patient douloureux ne pourra se faire de manière efficace qu'en prenant en compte l'ensemble des aspects de la douleur exprimé par le patient, bien au delà des seules considérations techniques d'un geste interventionnel. / Over the past 20 years, the use of imaging guidance has progressively but very rapidly evolved to become a standard practice to date, with fluoroscopy and Ultrasound being the most popular imaging guiding tools. However, CT guidance is relatively underused in the field of Interventional pain management, mainly due to acces and availabilty issues for pain physicians. Therefore, the objective of this thesis are mulitple :* to evaluate the usefulness of CT scan guidance, in applying existing neurolytic techniques(block.infiltration and neurolysis) to innovative indications, allowed by the use of such an imagingguiding tool.* to evaluate the clinical effectiveness of these novel indications* Finally, to emphasize on the importance of the clinical aspects of Interventional pain managementAfter after having reminded the definitions of the different existing techniques (neural blocks, infiltration, neurolysis) and detailed existing materials (Local anesthestics, Steroids, Chemical Neurolysis, Physical Neurolysis), a brief description of existing indication of Interventional Pain will be made. Emphasis will then be made on the assessment of innovative interventional CT Guided pain techniques in various refractory pain syndromes :- Evaluation of Alcohol percutaneous neurolysis of the sphenopalatine ganglion in the management of refractory cranio facial pain , in 42 patients : overall efficacy rate of alcohol SPN was 67.2% with a mean pain relief duration of 10,3 months. Analysis showed a higher efficacy rate in patients with Cluster Headaches (76.5%) andPersisting Facial Idiopathic Pain (85.7%)- Evaluation of the efficacy of a simplified CT guided greater occipital nerve (GON) infiltration approach inthe management of occipital neuralgia (ON) in 33 patients : Clinical success rate was 86%. In case of clinicalsuccess, mean pain relief duration following procedure was 9.16 months.- Evaluation of CT-guided Stellate Ganglion Blockade vs. Radiofrequency Neurolysis in the Managementof Refractory type I Complex Régional Pain Syndrome of the Upper Limb in 67 patients : analysis performed onthe blockade and RFN groups showed a significantly (P<0.0001) higher success rate in the RFN group (67.6%,23/34) compared with thé blockade group (21.2%, 7/33) with an OR of 7.76.- Evaluation of CT Guided ilio inguinal (II) and ilio hypogastric Radiofrequency Neurolysis (RFN) inpatients with refractory ilio-inguinal and groin pain.* Preliminary Study on 16 patients treated with II RFN showed significant pain reductionafter RFN with a mean pain relief of 11,8 months.* A second study was conducted to compared the effectiveness of RFN and Infiltration in thesame indication in 42 patients : Mean duration of pain relief was statistically significant (P = .005)in the RF group (12.5 months) compared to the infiltration group (1.6 months).Throughout these published studies, we hâve shown that the application of an existing neurolytic technique in a new indication, or modifying an existing technique after anatomical considerations may lead to either higher efficacy rates, longer pain reliefs, or safer procedures. In ail cases, CT guidance is an added value to any procédures as it allows safe, précise accurate and effective needle placement in most procedures. Another possible solution to reduce procedure related risks discussed in this thesis, is the development of a unidirectional radiofrequency probe, capable of producing tissue destruction only on one half on the probe thereby creating a half mooned shaped thermal zone, which would reduce the risk of surrounding unwanted tissue damage. This topic merits further studies and development as possible everyday implications are numerous .

Le bon fonctionnement du système nerveux dépend de la précision avec laquelle sont formées les connexions synaptiques lors du développement embryonnaire et post-natal. La navigation des cônes de croissance vers leurs cibles dépend en dernier lieu de la réorganisation dynamique du réseau d’actine et de microtubules (MTs). Historiquement considérés comme les acteurs principaux de l'élongation axonale, les MTs ont été plus récemment impliqués dans des processus d'orientation du cône de croissance et de guidage axonal, montrant ainsi le rôle capital que les protéines associées aux microtubules (MAPs) peuvent jouer dans la navigation axonale. Notre équipe s’intéresse aux protéines appartenant à un sous-groupe des protéines AAA (pour ATPases Associated with diverse cellular Activities) comprenant trois enzymes de cassure des MTs : la spastin, la katanin et la fidgetin, ainsi que deux protéines apparentées à cette dernière, les fidgetin-like 1 et 2 L’analyse fonctionnelle de fidgetin-like 1 et katanin chez le poisson zèbre a permis de montrer le rôle différentiel de ces protéines dans le guidage axonal des Neurones Moteurs Spinaux (NMS). Finalement, nous avons évalué l’impact d’une modification post-traductionnelle de la tubuline, la polyglutamylation, sur le développement axonal des NMS et l’activité de cassure des microtubules par katanin. Notre étude de deux enzymes de polyglutamylation neuronales, TTLL6 et TTLL11, a mis en évidence le rôle différentiel de ces deux enzymes dans la navigation axonale des NMS, ainsi que l’influence de la polyglutamylation par TTLL6, mais pas par TTLL11, sur l’activité de cassure des MTs par katanin dans ce processus biologique. / The formation of a functional nervous system depends on the accuracy of its network wiring during embryonic and postnatal development. Axon outgrowth and navigation ultimately rely on the reorganization of the microtubule (MT) and actin networks. Historically considered as key players in axon extension, MTs have been gradually shown to play an instructive role in axon guidance decisions, which sheds new light on the potential involvement of MT-associated proteins (MAPs) in these navigational processes. Our team program aims at deciphering the differential role and functional redundancy of a few neuronal MT-associated ATPases, including the MT-severing spastin, katanin and the newly discovered fidgetin-like 1, in SMN axon outgrowth. During my PhD, I have first participated in the functional analysis of fidgetin-like 1, which has revealed that this ATPase controls SMN axon outgrowth via the regulation of MT plus-end dynamics. My main PhD project focused on the involvement of katanin in SMN development, which has established the pivotal role of this MT-severing enzyme in SMN axon targeting. Furthermore, I have explored the potential involvement of a MT post-translational modification, the tubulin polyglutamylation, in SMN axon outgrowth and navigation, and its influence on katanin MT-severing activity. Interestingly, my analysis of two neuronal MT polyglutamylases, TTLL6 and TTLL11, shows that these two enzymes differentially affect SMN axon outgrowth and pathfinding, and reveals the exclusive impact of TTLL6-mediated polyglutamylation on katanin MT-severing activity during this developmental process.