Compte tenu de l'absence de traitement pharmacologique efficace contre la maladie d'Alzheimer (MA), le développement d'approches thérapeutiques alternatives telles que le régime cétogène (« ketogenic diet » : KD) pourrait être envisagé. Le KD est un régime riche en graisses, basé sur la production de corps cétoniques (« ketone nodies » : KB) dans le sang. En raison des effets bénéfiques du KD sur le système nerveux central et de l'absence de données publiées sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), nous avons utilisé une approche in vivo / in vitro pour étudier l'effet du KD et des KB sur la BHE. Pour l'étude in vivo, le sang de souris 129Sv a été récolté afin d’effectuer le dosage du beta-hydroxybutyrate et du glucose. Les capillaires cérébraux ont été isolés de cortex des souris, et des RT-qPCR ont été effectuées pour évaluer l'expression de l'ARNm des transporteurs / récepteurs impliqués dans la synthèse et le transport de KB, de glucose et du peptide bêta amyloïde. Les analyses transcriptionnelles ont été réalisées également dans un modèle in vitro de BHE, composé de cellules endothéliales dérivées de cellules souches hématopoïétiques (BLECs) en état de cétose. Après confirmation de l'intégrité des jonctions cellulaires des BLECs, Enfin, des expériences de transport de peptides beta amyloïde fluorescents après traitement avec les KBs ont été réalisées in vitro. Nos résultats montrent que les KBs modulent la physiologie de la BBB et l'expression de certains transporteurs et récepteurs du peptide bêta amyloïde, renforcent ainsi notre motivation à décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires au niveau vasculaire et plus précisément au niveau de la BHE. / Given the current absence of an effective pharmacologic treatment for Alzheimer’s disease (AD), the development of alternative therapeutic approaches (such as the ketogenic diet, KD) might be considered. The KD is a low-carbohydrate, high-fat diet based on the production of ketone bodies (KBs) in the blood. In view of the KD’s beneficial effects on the central nervous system and the lack of published data on the blood brain barrier (BBB), we used an in vivo/in vitro approach to investigate the effect of the KD and KBs on the BBB. For the in vivo study, blood from 129Sv mice was assayed for beta-hydroxybutyrate and glucose dosage. Brain capillaries were isolated from mouse cortices, and RT-qPCR assays were used to evaluate the mRNA expression of transporters/receptors involved in the synthesis and transport of KBs, glucose and beta-amyloid peptide. The mRNA assays were also performed in an in vitro BBB model, based on brain-like endothelial cells (BLECs). After a ketotic state had been established and the BLECs’ integrity had been confirmed, we evaluated the mRNA expression of KB-, glucose- and amyloid-beta-related genes. Lastly, the transport of fluorescently labelled beta-amyloid peptide across the BBB was studied after treatment with KBs. Our results showed that KBs modulate the physiology of the BBB by regulating the expression of certain beta-amyloid peptide transporters/receptors and amyloid peptide-synthesizing enzymes. These data suggest that it is possible to modulate key molecular players in beta-amyloid peptide transport and synthesis at the BBB, and thus open up new perspectives for studying KB-related therapeutic approaches.

Grâce à ses propriétés, la barrière hémato-encéphalique (BHE) est un élément clé dans la régulation de l’homéostasie cérébrale. Des altérations de la BHE peuvent promouvoir le développement de maladie neurodégénérative telle que la maladie d’Alzheimer (MA). La MA est la forme de démence la plus répandue chez les personnes âgées et est associée à des facteurs de risque tels que le gène ABCA7. Certains variants de ce gène ainsi qu’une perte de fonction de la protéine sont associés à une accumulation cérébrale excessive de peptides β-amyloïdes (Aβ) ainsi qu’à des perturbations de l’homéostasie du cholesterol. Ce transporteur est exprimé au niveau de la BHE mais ses fonctions y sont peu connues. Nous nous sommes donc intéressés au rôle du transporteur ABCA7 au niveau de la BHE. Pour cela, nous avons mis au point un modèle in vitro murin de BHE dans lequel le gène Abca7 est sous-exprimé, en utilisant la technique d’interférence par l’ARN. Nos résultats montrent que la sous expression du gène Abca7 est associée à une régulation négative de plusieurs effecteurs impliqués dans la formation des lipoprotéines. L’efflux du cholestérol et le transport de peptides Aβ sont modifiés dans les cellules sous exprimant Abca7. Le knockdown du gène Abca7 entraine également des modifications d’expression transcriptionnelle de certaines enzymes impliquées dans les métabolismes du cholestérol et des peptides Aβ. Ainsi, ces travaux mettent en évidence un rôle du transporteur ABCA7 dans la MA via son implication dans l’homéostasie cellulaire du cholestérol et le métabolisme des peptides Aβ au niveau de la BHE et suggèrent que ce transporteur pourrait être une cible thérapeutique pour la MA. / Due to these properties, Blood Brain Barrier (BBB) regulates exchanges of molecules between blood and brain and thus plays a key role in the regulation of cerebral homeostasis. Vascular dysfunctions as altered BBB can promote the development of neurodegenerative disease as Alzheimer's disease (AD). This disease is the most common form of dementia in the elderly, characterized by two mains pathological hallmarks in brain, the senile plaques and the neurofibrillary tangles. AD is associated with different environmental and genetic risk factors, as ABCA7 gene. It has been reported that variants in this gene are closely linked to excessive accumulation of amyloid- (Aβ) and disturbed cholesterol homeostasis. This transporter is expressed at brain level in endothelial cells constituting the BBB but its function at this barrier has not previously been studied. We thus investigated the role of ABCA7 at the BBB level. For this purpose, we have developed a murine in vitro BBB model in which AbcA7 gene is down regulated, using small RNA interference technique. Our results show that the decrease of AbcA7 gene expression is associated with a down regulation of several apolipoproteins and transporters involved in lipoprotein formation. Cellular cholesterol efflux and transport of Aβ peptides are modified in BBB silenced cells. The knockdown of AbcA7 also modified the transcriptional expression of enzyme involved in cholesterol and Aβ metabolisms. So, these works defined a role for ABCA7 in AD through its involvement in cellular cholesterol homeostasis and Aβ metabolism at the BBB level, suggesting that this transporter could be a potential therapeutic target.

Devant l'impact des maladies neurodégénératives sur la société, les thérapies par ultrasons focalisés apparaissent comme des techniques prometteuses combinant non invasivité, précision spatiale millimétrique et capacité d'atteindre les structures profondes du cerveau. Cependant, des travaux sont encore nécessaires pour renforcer les effets de la neuromodulation, comprendre les mécanismes sous-jacents et contrôler la sûreté de la technique avant d'entreprendre des essais cliniques. Dans cette thèse, la propagation des ultrasons dans le cerveau de rongeurs et de singes a été étudiée numériquement afin d'estimer l'intensité acoustique dans le cerveau, la répartition spatiale des ondes dans la boîte crânienne et l'élévation de température. Afin d'évaluer physiologiquement les effets des ultrasons à l'échelle cellulaire, l'activité de neurones uniques a été mesurée sur des macaques éveillés pendant une neuromodulation ultrasonore. Puis, la durée de l’effet de modulation a été augmentée grâce à une prolongation du tir sur des singes exécutant une tâche visuelle. L'imagerie fonctionnelle par IRM a ensuite permis de faire ressortir des changements de connectivité entre l'aire stimulée et des régions du cerveau éloignées.Enfin, les avantages de la neurostimulation par ultrasons ont été combinés avec l'efficacité d'un agent neuroactif. En utilisant des microbulles conjointement aux ultrasons, la barrière hémato-encéphalique a été ouverte localement et réversiblement dans le cortex visuel de macaques anesthésiés pour permettre le passage d'un neurotransmetteur inhibiteur dans le cerveau. La baisse d'amplitude des réponses EEG du cortex visuel à des stimuli démontre la faisabilité de la délivrance locale et non invasive de neuromodulateurs dans le cerveau. Ainsi, les paramètres ultrasonores ont été optimisés grâce aux simulations numériques et à des expériences in vivo pour renforcer les effets de neuromodulation tout en contrôlant les effets indésirables, avec l'objectif de se diriger vers des applications thérapeutiques et proposer de nouveaux outils pour des études de connectivité cérébrale / Considering the extent of neurodegenerative diseases consequences on the society, focused ultrasound appears as a promising technique combining non-invasiveness, millimetric spatial accuracy and ability to reach deep brain structures. However, efforts still need to be made to amplify the effects of focused ultrasound neuromodulation, understand its mechanism and control the safety of the technique before moving towards human trials.The ultrasound propagation inside the brain of rodents and monkeys was first studied numerically to estimate the maximum intensity in the brain, the pressure distribution in the skull cavity and the thermal rise. To evaluate physiologically the ultrasound effects at the cellular level, the activity of individual neurons was measured on awake macaques during ultrasonic neuromodulation. To further increase the duration of the modulation, a longer sonication was tested successfully on macaques performing a visual task. Functional MRI was then used to highlight the connectivity changes between the stimulated area and distant cerebral regions. Finally, the advantages of ultrasound neurostimulation were combined with the efficiency of a neuroactive agent (GABA). Using microbubbles and ultrasound, the blood brain barrier was opened locally and reversibly in the visual cortex of anesthetized macaques to deliver an inhibitory neurotransmitter in the brain. The amplitude of the EEG response of the visual cortex to stimuli decreased after GABA injection, demonstrating the feasibility of delivering neuroactive drugs non-invasively and locally to any brain region.Overall, ultrasound parameters were optimized with both numerical tools and in vivo experiments to amplify neuromodulation effects while controlling the safety. This work opens the way to the development of novel therapeutic applications and new tools for connectivity studies

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, est une compo- sante cruciale de l'unité neuro-glio-vasculaire car elle est responsable du maintien de l'homéostasie cérébrale. En limitant l'accès de nombreuses molécules au parenchyme cérébral, cette structure protège efficacement le système nerveux central (SNC) de composés toxiques, mais empêche ainsi de nombreux médicaments d'atteindre leur cible. La difficulté à étudier les caractéristiques et la perméabilité de la BHE in vivo a mené les scientifiques à développer différents modèlesin vitro de BHE. Notre modèle, qui consiste en une coculture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été largement caractérisé : il exprime les caractéristiques de laBHEin vivoet s'est avéré utile dans l'étude des interactions cellulaires au sein de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques. Le modèle de coculture initialement développé a été complété par l'addition de péricytes cérébraux afin de former des tricultures. En effet, les péricytes apparaissent aujourd'hui comme des acteurs importants de la BHE, mais sont souvent absents des modèles in vitro. Réunir les trois principales populations cellulaires formant la BHE(cellules endothéliales, cellules gliales et péricytes cérébraux) semble nécessaire afin de reproduire encore plus finement la configuration retrouvéein vivo, dans le but de comprendre les interactions cellulaires ayant cours au sein de la BHEen conditions physiologiques et pathologiques. Sur la base de notre coculture originelle, deux tricultures ont été mises en place : alors que dans la première les péricytes sont culti- vés à distance des cellules endothéliales, ces deux types cellulaires sont étroitement associés dans le second. Les deux modèles ont été caractérisés en terme de morphologie et d'expression de marqueurs endothéliaux, de perméabilité paracellulaire et d'expression de pompes d'efflux, démontrant qu'ils représentent tous deux des modèles pertinents de BHE. Ils permettront d'étudier la contribution des péricytes au phénotype de BHE et à sa réponse en conditions pathologiques, prenant en considération la composante glio-vasculaire. Dans la majorité des cas, l'utilisation des modèlesin vitro de BHE au cours des processus de découverte de médicaments vise à prédire si de potentielles molécules thérapeutiques à visée cérébrale peuvent atteindre le SNC, permettant leur effet pharmacologique au niveau de leur cible centrale. Cependant, ces modèles ne présentent généralement pas un débit suffisant pour évaluer rapidement la perméabilité du grand nombre de composés générés par l'industrie pharmaceutique lors des étapes précoces de la découverte de médicaments. A partir de notre coculture d'origine, un premier modèle a été développé pour l'adapter au criblage de molécules en réduisant son format (24 puits au lieu de 6 puits) ainsi que son coût, le temps de culture et les besoins techniques associés. Cette procédure comprend toutefois une étape critique de trypsinisation des cellules endothéliales. Nous avons souhaité rendre ce modèle encore plus facile d'utilisation en le fournissant congelé, afin que l'utilisateur final consacre un minimum de temps et de ressources techniques. Toutes ses caractéris- tiques montrent qu'il constitue un modèle in vitro de BHE pertinent et fiable pouvant répondre au besoin de criblage de composés des groupes pharmaceutiques et des petites entreprises de biotechnologie. Le travail réalisé a permis d'adapter notre modèle deBHEoriginel à deux problématiques. D'une part, la simplification de la procédure associée à sa mise en place permet de répondre aux besoins de l'indus- trie pharmaceutique de générer des données de perméabilité à grande échelle, lors des phrases précoces de la découverte de médicaments. D'autre part, l'intégration des péricytes cérébraux au sein du modèle permet d'étudier les interactions cellulaires mises en jeu au sein de la composante glio-vasculaire. Ces modèles pourront donc respectivement contribuer au développement de médicaments à visée cérébrale dont la perméabilité à travers laBHEpourra être optimisée, et à l'étude les intercommunications cellulaires mises en jeu au niveau de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques.

Les cellules endothéliales (CE) vasculaires cérébrales jouent un rôle important en tant que composantes structurales et fonctionnelles de la barrière hémato-encéphalique. L'angiogenèse tumorale, un processus important pour la croissance tumorale et pour le processus métastasique, régule le recrutement des CE qui, lorsqu'activées, prolifèrent et se différencient pour générer des structures capillaires afin de livrer les nutriments et l'oxygène au sein du compartiment tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis de cibler, d'un point de vue pharmacologique, l'angiogenèse tumorale cérébrale. Dans le premier volet de cette étude, nous avons évalué l'impact anti-angiogénique in vitro de l'AD4-015, un inhibiteur du transporteur du glucose-6-phosphate (G6PT), sur les CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une inhibition de la migration cellulaire, de la tubulogenèse in vitro et de l'inhibition de la sécrétion et de l'expression génique de la métalloprotéinase matricielle-9 induite par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un carcinogène promoteur de tumeur. L'expression de la cyclooxygénase-2 (cox-2) était aussi inhibée. L'inhibition pharmacologique de G6PT pourrait être une importante avenue thérapeutique ciblant la néo-vascularisation tumorale. Dans le deuxième volet de notre étude, nous avons investigué les effets du 2-déoxy-D-glucose (2DG), un analogue du glucose ayant comme rôle d'inhiber la glycolyse par la déplétion d'ATP, sur les propriétés angiogéniques des CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une diminution de la tubulogenèse conséquente à une diminution du niveau d'ATP. L'induction de l'expression de cox-2 et de GRP78 a été potentialisée par la combinaison du 2DG avec le PMA. Le niveau de la sécrétion de protéine et de l'expression génique de MMP-9 a été diminué en présence du 2DG, un phénomène impliquant la signalisation par le facteur nucléaire kappa-B. Nous fournissons donc des preuves que l'ATP est nécessaire au processus de la tubulogenèse et nous établissons un lien entre le stress du réticulum endoplasmique et l'inflammation. Dans le troisième volet de notre étude, nous avons investigué les propriétés inhibitrices de plusieurs flavonoïdes et la voie de signalisation du facteur nucléaire kappa-B, qui est une voie commune pour la régulation de l'expression de cox-2 et de MMP-9. Nous avons observé une diminution de l'expression génique et des niveaux de protéines de cox-2 et de MMP-9 par la fisetine, l'apigénine et la lutéoline. Il a également été démontré qu'il y a inhibition des niveaux de phosphorylation d'IkB prouvant leur impact sur l'activité de phosphorylation des IkB kinases. Nos résultats démontrent donc que la perturbation de la barrière hémato-encéphalique pourrait être minimisée par certains flavonoïdes qui agissent comme des inhibiteurs de la voie de signalisation de NF-kB. Collectivement, nos résultats démontrent les effets de différents inhibiteurs sur la tubulogenèse médiée par les CE vasculaires cérébrales. Dans le futur, ceci permettra le ciblage pharmacologique de l'angiogenèse tumorale cérébrale avec l'utilisation de molécules inhibitrices comme l'analogue de la mumbaistatine, le 2DG et certains flavonoïdes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules endothéliales vasculaires cérébrales, angiogenèse, cox-2, MMP-9.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La barrière hémato-encéphalique (BHE) représente un obstacle physiologique à l'acheminement de molécules thérapeutiques dans le traitement des tumeurs cérébrales. Une approche afin de faciliter le transport au-delà de la BHE implique l'activation des récepteurs des kinines. Notre objectif était de caractériser la perméabilisation pharmacologique de la BHE avec des analogues synthétiques stables des récepteurs B1 et B2 des kinines (rB1 et rB2) chez le rat Fischer implanté d'un gliome F98. Pour ce faire, une série de peptides agonistes a été développée et synthétisée dans nos laboratoires. Les meilleurs candidats ont ensuite été sélectionnés pour leur affinité et activité envers leur récepteur spécifique, ainsi que leur durée d'action et leur résistance au métabolisme enzymatique. Nous avons ensuite caractérisé l’expression du rB1 et du rB2 dans notre modèle animal. Les deux sous-types de récepteurs ont été détectés sur les cellules tumorales et les cellules endothéliales de la vascularisation tumorale (RT-PCR et immunohistochimie). Nous avons évalué la perméabilité de la BHE avant et après l'infusion (i.a. ou i.v.) des différents agonistes choisis à l'aide de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) dynamique avec des agents de contraste de différents poids moléculaire (Magnevist™ 0,5 kDa et Gadomer™ 17 kDa). Les images pondérées T[indice inférieur 1] ont été analysées pour la présence ou l'absence d'augmentation du contraste à l'intérieur et aux environs de la tumeur et traitées mathématiquement pour obtenir le volume de distribution de l'agent de contraste (CADV). Ces CADV ont ensuite été comparés pour mettre en évidence une perméabilisation vasculaire induite par les agonistes. Nos résultats montrent que les agonistes du rB1 (NG29) et du rB2 (R523) augmentent, de façon dose-dépendante, les CADV du Gd-DTPA et du Gadomer. L'augmentation du CADV induite par le NG29 a été annulée par l'antagoniste sélectif du rB1 R892 et l'inhibiteur des cyclooxygénases méclofénamate, alors que celle induite par le R523 a été annulée par l'antagoniste sélectif du rB2 HOE140 et l'inhibiteur des NO synthases L-NA. Enfin, nous avons évalué l'impact d'une co-stimulation des deux récepteurs sur la perméabilité de la BHE. Cette double activation a été faite soit par co-injection des agonistes rB1 et rB2, ou à l’aide d'un nouvel agoniste rB1/rB2 hétérodimérique, développé dans nos laboratoires. Ces différentes approches ont un effet additif sur la perméabilité de la BHE. L’ensemble de nos résultats soutiennent l’utilisation des agonistes synthétiques des rB1 et rB2 (administrés seuls ou en combinaison) afin d'améliorer l'acheminement de macromolécules thérapeutiques aux tumeurs cérébrales.

Le MSRV (Multiple Sclerosis Associated Retro Virus) fait partie de la famille de rétrovirus endogènes humains HERV-W. Une protéine d'enveloppe provenant du MSRV est retrouvée chez la plupart des patients atteints de sclérose en plaque (SEP). Cette protéine (Env-ms) a des propriétés pro-inflammatoires sur les cellules immunitaires et pourrait donc jouer un rôle dans la pathogenèse de la SEP en exacerbant la diapédèse leucocytaire observée dans le système nerveux central (SNC) des patients. Cette étude vise principalement à analyser les effets de Env-ms sur la barrière hémato-encéphalique (BHE) au niveau moléculaire et fonctionnel. Nous avons pu démontrer que l'enveloppe recombinante du MSRV était capable de stimuler plusieurs paramètres inflammatoires sur un modèle humain de BHE in vitro, la lignée HCMEC/D3. En effet, Env-ms induit une surexpression d'ICAM-1, une protéine impliquée dans l'adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales, d'une manière dose dépendante ainsi qu'une production dose dépendante de cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-6 et l'IL-8. De plus, par une approche utilisant des siRNAs, nous avons pu montrer que Env-ms était reconnue par le récepteur TLR4, un récepteur de l'immunité innée exprimé par les cellules endothéliales. Nous avons aussi montré par des essais fonctionnels que Env-ms stimulait de manière significative l'adhésion de cellules immunitaires activées à la monocouche de cellules endothéliales. Enfin, nous avons aussi mesuré les effets de Env-ms sur des cultures primaires de cellules endothéliales HUVEC et nous avons pu montrer que les propriétés pro-inflammatoires de la protéine d'enveloppe étaient similaires à celles observées sur le modèle HCMEC/D3 Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle le MSRV pourrait être impliqué dans la pathogenèse de la SEP ou bien dans le maintien d'un niveau d'inflammation élevé favorisant le désordre immunitaire observé chez les patients. Le MSRV pourrait également jouer un rôle dans d'autres maladies inflammatoires chroniques. / The MSRV (Multiple Sclerosis Associated Retro Virus) belongs to the human endogenous retrovirus HERV-W family. An envelope protein originating from the MSRV was found in most patients with multiple sclerosis (MS). This protein (Env-ms) has pro-inflammatory properties on several immune cells and could therefore play a role in the MS pathogenesis by promoting the leukocyte diapedesis observed in the central nervous system of patients. Our study aims to analyze the effects of Env-ms on the blood-brain barrier (BBB) at a molecular and functional level. We have demonstrated that the recombinant MSRV envelope was able to strongly stimulate several inflammatory parameters on a human BBB in vitro model, the HCMEC/D3 cell line. Indeed, Env-ms induced overexpression of ICAM-1, a major mediator of leukocyte adhesion to endothelial cells, in a dose-dependent manner and a strong dose-dependent production of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8. Furthermore, using a silencing approach with siRNAs, we have shown that Env-ms was recognized via the TLR4 receptor, a pattern recognition receptor of innate immunity present on endothelial cells. Indeed, the knock down of TLR4 abolishes the pro-inflammatory effects of Env-ms. We have also shown using functionnal assays, that the treatment of brain endothelial cells with Env-ms significantly stimulated the adhesion of activated immune cells to the monolayer of endothelial cells. We also assessed the effects of Env-ms on primary endothelial cells HUVECs and we observed that the pro-inflammatory properties of the envelope protein were similar to those observed on HCMEC/D3. These findings support the hypothesis that MSRV could be involved in the pathogenesis of MS disease or at least in maintenance of inflammatory conditions thus fueling the auto-immune disorder. The MSRV could also play a role in other chronic inflammatory diseases.

Chez les vertébrés, le système cardiovasculaire est composé d’un réseau hiérarchisé de vaisseaux sanguins couplés à la pompe cardiaque. Ce système tubulaire se ramifie dans chaque organe afin d’y acheminer l’oxygène et les nutriments et d’éliminer les sous-produits métaboliques. Au-delà de cette fonction ancestrale et malgré sa continuité anatomique, les segments constituant ce système sont fortement hétérogènes, s’adaptant localement à la fonction de chaque organe. Cette spécification organotypique se manifeste le plus distinctement par la barrière hémato-encéphalique (BHE), un ensemble de propriétés protectrices adoptées par l’endothélium cérébral. Il est établi que tant la formation du système vasculaire cérébral que sa maturation en BHE résultent d’une intense et complexe communication entre le système neural et vasculaire, et que cette communication reste active jusque chez l’adulte.Au cœur de cette thématique, le GPR124, un GPCR d’adhésion orphelin, fut caractérisé à l’entame de ce travail de thèse comme le premier facteur endothélial spécifiquement impliqué dans la vascularisation du système nerveux central chez les mammifères. Malgré cette découverte pionnière pour le domaine, la nature des signaux activant le Gpr124 ainsi que les mécanismes de signalisation de ce récepteur restaient totalement élusifs et ont été explorés au cours de ce travail de doctorat.Nous avons ainsi déterminé que le Gpr124 est requis pour l’activation de la voie Wnt/β-caténine dans l’endothélium cérébral et que cette voie est essentielle à l’angiogenèse cérébrale en contrôlant sélectivement les cellules de tête du bourgeon angiogénique. Nous avons également identifié Reck comme partenaire d’interaction essentiel du Gpr124. Le complexe Gpr124/Reck confère aux cellules la capacité unique de discriminer parmi les différents membres de la famille de ligands Wnt et ainsi de transduire spécifiquement les signaux Wnt7a/b angiogéniques dérivant du système neural.Notre étude a permis de développer un modèle moléculaire et cellulaire intégratif expliquant le contrôle neural de l’invasion vasculaire cérébrale chez les vertébrés. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le développement de l’uvéite auto-immune expérimentale (UAE) se fait en plusieurs étapes, commençant par l’activation en périphérie de lymphocytes T auxiliaires auto-réactifs spécifiques d’antigènes rétiniens, leur migration vers l’œil, où ils sont réactivés de façon antigène-spécifique et CMH II (complexe majeur d’histocompatibilité de classe II)-dépendante pour enfin induire la rupture de la barrière hémato-rétinienne (BHR), permettant le recrutement aspécifique de cellules inflammatoires responsables des dommages tissulaires. Tous ces processus représentent des cibles potentielles pour des thérapies biologiques ciblées. Dans cette perspective, notre travail a pour but d’approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans le recrutement de cellules inflammatoires, la présentation locale d’antigènes rétiniens et la rupture de la BHR interne lors de l’induction de l’UAE par transfert adoptif.L’expression de molécules d’adhésion par les cellules de la BHR joue un rôle central dans l’infiltration de cellules inflammatoires dans l’œil. Dans ce contexte, nous avons d’abord montré qu’à l’instar de ce que nous avions démontré pour VCAM-1, l’expression d’ICAM-1 est fortement induite dans la rétine durant l’UAE, avec une intensité et une extension corrélées à la sévérité de la maladie. Cependant, alors que VCAM-1 est uniquement inductible, une expression basale d’ICAM-1 est détectée dans la rétine naïve. Le ligand d’ICAM-1, LFA-1, est exprimé de façon ubiquitaire par les cellules immunes circulantes, contrairement au ligand de VCAM-1, VLA-4, qui n’est exprimé que par une minorité de cellules. Par ailleurs, nous avons observé une répartition tissulaire différente de ces deux molécules d’adhésion dans la rétine. En effet, si ICAM-1 prédomine dans l’épithélium pigmentaire rétinien, VCAM-1 est fortement exprimé au niveau des lésions de vasculite, à la fois sur les cellules endothéliales et gliales péri- vasculaires. Ces 2 sites correspondent respectivement à la BHR externe et interne. Ces différences majeures en termes de distribution rétinienne des molécules d’adhésion pourraient refléter des voies d’entrée distinctes pour les cellules inflammatoires lors de leur pénétration dans l’œil.Comme les lymphocytes T auto-réactifs n’induisent la maladie qu’après avoir localement reconnu leur antigène, nous nous sommes ensuite intéressés à identifier les cellules présentatrices d’antigène (CPA) potentielles exprimant du CMH II dans la rétine lors de l’UAE. Nous avons tout d’abord observé une forte induction de l’expression de molécules du CMH II dans la rétine lors de l’inflammation intraoculaire, corrélée avec la sévérité de la maladie. Celle-ci est associée avec l’induction de l’expression de molécules de co-stimulation, particulièrement sur les cellules exprimant fortement le CMH II. L’expression la plus forte de CMH II se retrouve dans la rétine interne, au niveau des vaisseaux enflammés et s’étend vers les couches externes de la rétine et l’espace sous-rétinien dans les uvéites sévères. Nous avons identifié 3 populations de CPA potentielles exprimant le CMH II dans la rétine :des cellules CD45-CD11b- non-hématopoïétiques exprimant faiblement le CMH II et des cellules CD45+CD11b+ hématopoïétiques exprimant plus fortement le CMH II, pouvant être subdivisées en cellules Ly6C+ et Ly6C-. L’analyse bio-informatique à l’aveugle du transcriptome de ces 3 populations mène à une ségrégation claire des échantillons, avec un enrichissement en marqueurs de macrophages et de microglie dans les cellules Ly6C+ et Ly6C-, respectivement. Cependant, l’expression de Ly6C ne permet pas une ségrégation absolue entre macrophages infiltrants et microglie résidente. L’analyse fonctionnelle à l’aide de DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) révèle que les 2 populations de cellules hématopoïétiques sont plus compétentes dans la présentation d’antigène associée au CMH II et l’activation des lymphocytes T que les cellules non-hématopoïétiques.Paradoxalement, nos données n’ont pas mis en évidence d’expression de CMH II par les principales cellules de la BHR que sont les cellules endothéliales et les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. Cependant, il est bien établi que les cellules endothéliales rétiniennes subissent un changement majeur de phénotype lors du développement d’une UAE. Afin d’investiguer de façon globale les mécanismes sous-jacents à la rupture de la BHR interne, nous avons étudié la régulation de l’expression génique des cellules endothéliales rétiniennes lors de l’uvéite non-infectieuse. En accord avec les données de nos travaux précédents, l’analyse du transcriptome des cellules endothéliales rétiniennes n’a pas mis en évidence d’expression de CMH II lors de l’UAE. En revanche, cette approche nous a permis d’identifier 65 gènes modulés dans les cellules endothéliales rétiniennes lors du développement d’une UAE, confirmant non seulement l’implication de certaines molécules dont le rôle pathogénique est déjà connu, mais procurant également une liste de nouveaux gènes candidats et de voies fonctionnelles potentiellement associées à la rupture de la BHR lors d’une uvéite non- infectieuse. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished