Les microorganismes du domaine du vivant Archaea sont très divers sur le plan biologique et sont présents dans de nombreux types d'écosystèmes. Ils sont majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Parmi les virus d'archées, ceux infectant les espèces d'un phylum majeur des archées, Crenarchaeota, constitué d'hyperthermophiles, forment un groupe exceptionnel. En effet, leurs morphotypes sont uniques, variés, et complexes. Le contenu de leur génome est également unique. Enfin, la plupart de ces virus se maintiennent dans la cellule hôte en état porteur, une relation chronique qui permet un équilibre entre production de virions et division cellulaire. J'ai d'abord démontré que le virus de crenarchée Sulfolobus islandicus rod-shaped virus 2 est un virus virulent, et non chronique comme il avait été suggéré. Un mécanisme de lyse unique a été découvert. La paroi cellulaire est modifiée en plusieurs points, avec l'apparition de structures pyramidales saillantes. Celles-ci s'ouvrent en fin de cycle infectieux, permettant aux virions, assemblés auparavant dans le cytoplasme, de quitter la cellule. Puis j'ai travaillé sur des échantillons de sources géothermiques de la péninsule de Kamchatka (Russie) et contribué à l'isolement et la caractérisation d'un virus de morphotype filamenteux. Des protéines structurales supplémentaires ont ainsi été identifiées. Enfin, des mots courts exceptionnels ont été identifiés dans un grand nombre de génomes d'archées et de leurs éléments extra-chromosomiques. Ce sont potentiellement des motifs fonctionnels non-codants, impliqués dans des mécanismes biologiques importants. Typiquement, les motifs palindromiques sont évités dans les génomes / The microorganisms from the Archaea domain are very diverse at the biological level and they are present in many types of ecosystems. They are dominant in the so-called extreme environments. Among their viruses, those infecting species of the Crenarchaeota phylum, a major archaeal phylum comprising hyperthermophiles, form an exceptional group. Indeed, their morphotypes are unique, diverse, and complex. Their genome content is also unique. Finally, most of these viruses persist in the host cell in a carrier state, a chronic relationship allowing an equilibrium between virion production and cell division. I first proved that Sulfolobus islandicus rod-shaped virus 2 is a virulent virus, and not chronic, as had previously been suggested. A unique lysis mechanism was discovered. The cell wall is modified in several locations, with the appearance of pyramidal prominent structures. Those burst open at the end of the infection cycle, allowing the virions, previously assembled in the cytoplasm, to leave the cell. Then, I worked on environmental samples from geothermal springs of the Kamchatka peninsula (Russia) and contributed to the isolation and characterization of a virus of filamentous morphotype. Additional structural proteins were in particular identified. Finally, short exceptional words were identified in a great number of genomes from archaea and their extra-chromosomal elements. These are potentially functional non-coding motifs involved in important biological mechanisms. Typically, palindromic motifs are avoided in the genomes

Des souches de Vibrio appartenant au clade Splendidus sont retrouvées de manière récurrente lors des mortalités estivales d'huîtres juvéniles. La souche V. tasmaniensis LGP32 est un pathogène intracellulaire facultatif des hémocytes d'huître, dont elle altère les fonctions de défense. Nous montrons ici que LGP32 se comporte comme un pathogène intravacuolaire qui survit au sein de larges vacuoles intrahémocytaires. Il induit des effets cytopathiques tels qu'une perméabilisation membranaire et un lessivage du contenu cytosolique des hémocytes. Cette cytotoxicité est dépendante de l'invasion hémocytaire. Par ailleurs, à l'intérieur du phagosome, LGP32 sécrète des vésicules de membrane externe (OMVs). Chez LGP32, ces OMVs jouent un rôle protecteur contre les défenses de l'hôte et servent de véhicules pour la délivrance de facteurs de virulence aux cellules de l'hôte. En effet, elles sont capables de titrer les peptides antimicrobiens et présentent un fort contenu en hydrolases (25% du protéome des OMVs). Une sérine protéase, nommée Vsp car elle est uniquement sécrétée par voie vésiculaire participe à la virulence de LGP32 en infections expérimentales mais ne dégraderait pas les peptides antimicrobiens. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié une série de gènes impliqués dans la réponse anti-oxydante et l'efflux de cuivre, qui sont surexprimés dans les stades intracellulaires précoces de LGP32. La génomique fonctionnelle a montré que ces deux fonctions importantes sont requises pour la survie intracellulaire, la cytotoxicité et la virulence de LGP32. Leur grande conservation parmi les vibrios laisse supposer qu'elles puissent contribuer à la survie intracellulaire d'autres espèces de Vibrio. / Vibrio strains belonging to the Splendidus Clade have been repeatedly found in juvenile diseased oysters affected by summer mortalities. V. tasmaniensis LGP32 is an intracellular pathogen of oyster hemocytes which has been reported to alter the oxidative burst and inhibit phagosome maturation. We show here that LGP32 behaves as an intravacuolar pathogen that survives within large cytoplasmic vacuoles. LGP32 induces cytotoxic effects such as membrane disruptions and cytoplasmic disorders. Cytotoxicity was shown to be entirely dependent on LGP32 entry into hemocytes. Moreover, LGP32 releases outer membrane vesicles (OMVs) inside the phagosome. LGP32 OMVs were found to be protective against host defenses and to serve as vehicles for the delivery of LGP32 virulence factors to oyster immune cells. Indeed, OMVs conferred a high resistance to antimicrobial peptides. They also displayed a high content in hydrolases (25 % of total proteome) among which a serine protease, named Vsp for vesicular serine protease, was found to be specifically secreted through OMVs. Vsp was shown to participate in the virulence phenotype of LGP32 in oyster experimental infections but did not degrade AMPs entrapped in OMVs. By developing a transcriptomic approach, we identified a series of Vibrio antioxidant and copper efflux genes whose expression is strongly induced within oyster hemocytes. Construction of isogenic deletion mutants showed that resistance to reactive oxygen species and copper efflux are two important functions required for LGP32 intracellular survival, cytotoxic effects and virulence. Their high conservation among vibrios suggests they could contribute to intracellular survival of other Vibrio species.

Ces travaux de recherche présentés ici traitent de la synthèse d’une nouvelle classe d’assemblages de coordination de platine luminescents. En raison du savoir-faire du groupe, deux stratégies ont été suivies: (i) La première approche consiste en l’auto-assemblage d’une nouvelle famille de métallocages de platine de formule [Pt2L4][OTf]4 contenant divers ligands bidentés rigides. Les structures moléculaires de plusieurs complexes ont été déterminées. Les propriétés d'absorption et d'émission de ces assemblages ont été étudiées. De plus, la cage Pt2L4 (L=5-methoxy-1,3-bis(pyridin-3-ylethynyl)benzène) a montré des propriétés intéressantes en tant que molécule hôte envers une série de complexes métalliques plan-carrés agissant comme invités. Remarquablement on a déterminé la structure moléculaire d’un rare exemple dans lequel l’anion complexe dithiobenzène or(III) [Au(bdt)2]-1 a été encapsulé. Le comportement en solution a également été déterminé. De plus (ii) dans une seconde approche, on a décrit la synthèse d’un unique type d’assemblages de platine luminescents contenant un nouvel organométalloligand comportant une fonction chirale. L’organométalloligand permet un contrôle précis de la chiralité de l’assemblage au niveau supramoléculaire aussi bien que la modulation des interactions intermoléculaires Pt···Pt et π-π. En effet, plusieurs structures moléculaires analysées par diffraction des rayons X, ont été obtenues et confirment ce comportement. Les propriétés de luminescence de ces composés ont été étudiées en solution et à l’état solide. Elles ont montré que ces composés agissent en tant qu’intenses émetteurs rouges avec de bons rendements quantiques. De plus les propriétés chiroptiques de ces complexes de platine énantiopurs ont été étudiées aussi bien que leurs propriétés de luminescence par lumière polarisée. / The PhD research work presented herein deals with the synthesis of novel class of luminescent coordination platinum assemblies. Owing to the now-how of the group two strategies were followed: (i) The first approach consists in the self-assembly of novel family the platinum metallacages of the formula [Pt2L4][OTf]4 containing various rigid bidentate ligands. The molecular structures of several complexes were determined. The absorption and emission properties of these metallacages were investigated. Moreover the Pt2L4 (L = 5-methoxy-1,3-bis(pyridin-3-ylethynyl)benzène) showed interesting properties as host molecule towards a series of square planar metal complexes acting as guests. Remarkably the molecular structure of a rare host-guest system in which the anion dithiobenzene gold(III) complex [Au(bdt)2]-1 was encapsulated is determined. The solution behavior was also investigated. Moreover (ii) in a second approach the synthesis of a unique type of luminescent platinum assemblies containing a novel organometalloligand bearing chiral function is described. The organometalloligand allows a fine control of the chirality of the assemblies at the supramolecular level as well as the modulation of the intermolecular Pt···Pt and π-π interactions. Indeed several X-ray molecular structures were determined and confirmed this behavior. The luminescent properties of these compounds were investigated in solution and in solid state and showed that these compounds act as deep red emitters with good quantum yields. Furthermore the chiroptical properties of the enantiopure platinum complexes were investigated as well as their circular polarized luminescence (CPL) properties.

Dans une première partie de mon projet de thèse, je me suis intéressée aux hybridations interspécifiques et à l’histoire évolutive des espèces de pommiers en Europe. L’analyse de génomes complets m’a permis de confirmer que l’ancêtre du pommier cultivé est bien le pommier sauvage asiatique M. sieversii, mais aussi que de nombreuses variétés cultivées originaires de l’Europe forment un groupe génétique distinct de cette espèce sauvage. Ces variétés montrent des traces d’introgressions par le pommier sauvage européen M. sylvestris et une structuration de populaton selon un axe est-ouest. Les introgressions depuis le pommier cultivé sont également abondantes dans les populations de pommier sauvage européen M. sylvestris, et menacent leur intégrité génétique. Les niveaux des introgressions étaient corrélés aux activités anthropiques d’exploitation des pommiers et les hybrides n’avaient pas de réduction détectable de valeur sélective sur les caractères mesurés. Notre étude de la phylogéographie du pommier sauvage européen dans l’ensemble de son aire de distribution nous a permis de détecter des groupes génétiques différenciés résultant de l’histoire climatique passée de la planète. Ces groupes représentent autant d’unités de conservation différentes.Dans une seconde partie, j'ai étudié la coévolution entre espèces de plantes et espèces de champignons pathogènes dans deux systèmes différents. Je me suis tout d'abord intéréssée à l’histoire évolutive combinée des pommiers cultivés et sauvages d’Asie centrale et du champignon causant la tavelure, Venturia inaequalis. Dans les montagnes du Kazakhstan, le pommier cultivé a été réintroduit au cours des deux derniers siècles, créant une zone de contact secondaire, non seulement entre M. domestica et M. sieversii, mais aussi entre les populations de V. inaequalis de types agricole et sauvage. Alors que l’invasion des populations sauvages par le pommier cultivé semble encore limité géographiquement, le pathogène de type agricole est largement répandu dans les forêts et sur l’hôte sauvage. Cependant, le nombre d’hybrides détectés chez le pathogène reste limité, probablement en raison de barrières intrinsèques à la reproduction, puisque les deux types de pathogènes infectent les mêmes arbres hôtes. Dans un second temps, j’ai comparé les structures génétiques et spatiales à l’échelle européenne de la plante Silene latifolia et de son pathogène Microbotryum lychnidis-dioicae. Notre jeu de données constitué du génotype d’un pathogène et de la plante qu’il infectait nous a permis de comparer la structure à très fine échelle et celle-ci apparait remarquablement congruente. Trois groupes phylogéographiques ont été identifiés chez les deux organismes, correspondant à l’histoire de contraction-expansion des aires de distribution des espèces tempérées lors de la dernière glaciation. Une structure génétique plus fine a également été détectée chez le pathogène, suggérant la possibilité d’une histoire plus complexe. / In the first part of my thesis project, I studied the evolutive history of apple tree species in Europe, including interspecific hybridizations. Analyses of whole genome data confirmed that the progenitor species of the cultivated apple tree was M. sieversii, a Central Asia wild apple tree, but also that a high proportion of European cultivated varieties form a genetic group distinct from the wild species. These varieties show traces of introgressions from M. sylvestris and of population subdivision along an East-West axis. Microsatellite markers also showed that introgressions from the cultivated apple were also quite frequent in wild apple tree populations and thus threaten their genetic integrity. We found that introgression levels were correlated to anthropic activities of apple tree cultivation and gave rise to hybrids with no detectable reduced fitness on the traits measured. Our study of the European wild apple tree phylogeography allowed us to detect differentiated genetic groups resulting from the past climatic history of the planet and which should be considered as different evolutionary significant units in conservation.In the second part of my thesis project, I studied coevolution between plant species and their pathogenic fungi in two different systems. I first compared the evolutive history of cultivated and wild apple trees in Central Asia and that of their scab pathogen, Venturia inaequalis. In the Kazakhstan Mountains, the cultivated apple tree has been reintroduced back from Europe during the last two centuries. This created a secondary contact zone, not only between the two apple tree species, but also between the agricultural and the wild types of V. inaequalis. While the invasion of natural populations by the cultivated apple trees still seems geographically limited, the agricultural pathogen is widespread in the forests and on the wild host trees. However, the number of hybrids in the pathogen was limited, probably because of intrinsic reproductive barriers since no ecological barriers were found. I also compared spatial genetic structures at the European scale in the plant Silene latifolia and its anther-smut pathogen Microbotryum lychnidis-dioicae. Our dataset included genotypes from the pathogens and the plants on which they were collected, and the population structures appeared remarquably congruent. Three phylogenetic groups were identified in these both species, corresponding with the temperate species range contraction-expansion cycles during the past glaciations. A substructure was identified in the pathogen suggesting the possibility of a more complex history.

Listeria monocytogenes est un pathogène intracellulaire facultatif responsable d’une infection sévère d’origine alimentaire, la listériose. L’étude du processus d’infection cellulaire de cette bactérie a permis d’élucider divers mécanismes impliqués dans les interactions hôte-pathogène et dans le fonctionnement de la cellule eucaryote. En particulier, L. monocytogenes a été l’un des modèles pionniers dans la découverte du ciblage de la chromatine et de régulateurs nucléaires par des microbes. L’étude d’un facteur de virulence de L. monocytogenes, LntA, a permis l’identification d’un de ces régulateurs : BAHD1. En recrutant des protéines impliquées dans la formation de l’hétérochromatine, telles HDAC1/2 et HP1, BAHD1 stimule la formation d’une chromatine compacte à effet répressif. Lors d’une infection de cellules épithéliales par L. monocytogenes, BAHD1 réprime la réponse immunitaire stimulée par les interférons, une fonction inhibée par LntA. BAHD1 demeurant peu étudiée, mon doctorat a eu pour premier objectif de poursuivre la caractérisation de ce régulateur épigénétique. Par ailleurs, des données préliminaires suggéraient qu’un facteur de virulence de Listeria récemment découvert, InlP, avait la potentialité d’être, comme LntA, une nucléomoduline. Mon deuxième objectif a été d’explorer cette hypothèse.Les résultats de mon premier axe montrent que BAHD1 interagit avec MIER1 et que cette interaction est cruciale pour l’association de BAHD1 aux HDAC1/2. Nous reportons également que BAHD1 modifie la chromatine en changement la méthylation et l’acétylation des histones, ainsi que la méthylation de l’ADN, au niveau d’un gène cible, ESR1. Ces résultats nous permettent de proposer que BAHD1 forme, avec MIER1, un échafaudage assemblant un nouveau complexe de remodelage de la chromatine associé aux HDAC1/2 : le complexe BAHD1. Nous avons ensuite étudié un rôle de BAHD1 dans un organe ciblé par la Listeria, le cerveau. Nos résultats indiquent qu’une déficience totale en BAHD1 altère le transcriptome global de cet organe chez la souris. Les gènes majoritairement surexprimés sont impliqués dans des fonctions du système nerveux, le métabolisme et des troubles neurologiques. Les gènes majoritairement sous-exprimés sont impliqués dans des voies de l’immunité innée, dont des gènes de réponses aux interférons. Par ailleurs, une haplo-déficience en Bahd1 provoque des troubles comportementaux. En comparaison des souris Bahd1+/+, les souris Bahd1+/- souffrent d’une anxiété accrue et d’altérations du réflex de sursaut acoustique. Ces résultats suggèrent qu’une dérégulation de BAHD1, par des stimuli de l’environnement ou par des stimuli infectieux, pourrait avoir des effets neuro-pathologiques.Le second axe de ma thèse concernait l’étude des interactions d’InlP avec des protéines nucléaires de l’hôte, identifiées par un crible double-hybride. Nous montrons d’abord qu’InlP est une internaline atypique, avec des répétitions riches en leucine caractérisées par un motif LPX2. Nous identifions, ensuite, deux protéines nucléaires ciblées par InlP : le facteur d’épissage et suppresseur de tumeur RBM5 et le corépresseur RERE. Quand InlP est produite de façon ectopique dans les cellules humaines, elle se localise dans le noyau, où elle altère la formation de corps nucléaires enrichis en RERE. Dans des cellules sur-exprimant RBM5, InlP inhibe l’effet pro-apoptotique de RBM5 et stimule la formation de corps nucléaires denses associés à RBM5. Ces résultats suggèrent qu’InlP est une nucléomoduline agissant sur la l’assemblage et le désassemblage de compartiments de stockage de protéines cibles impliquées dans la synthèse et l’épissage d’ARNs de l’hôte.Ce travail ouvrent des perspectives dans la compréhension des interactions hôte-pathogène et dans une meilleure connaissance des mécanismes patho-épigénétiques, ainsi qu’en biologie cellulaire, dans la compréhension de la dynamique des organites nucléaires sans membrane. / Listeria monocytogenes is an optional intracellular pathogen responsible for a severe foodborne infection called listeriosis. The study of the cellular infection process of this bacterium has shed light on various mechanisms involved in host-pathogen interactions and in the functioning of the eukaryotic cell. In particular, L. monocytogenes has emerged as one of the pioneering models in the discovery of microbial targeting of chromatin and nuclear regulators. The study of a virulence factor of L. monocytogenes, LntA, allowed the identification of one of these regulators : BAHD1. By recruiting proteins involved in the formation of heterochromatin, such as HDAC1/2 and HP1, BAHD1 stimulates the formation of a compact chromatin with a repressive effect. When epithelial cells are infected with L. monocytogenes, BAHD1 suppresses the immune response stimulated by interferons, a function inhibited by LntA. Since BAHD1 is still under-researched, the first objective for my thesis was to further characterize this epigenetic regulator. In addition, preliminary data suggested that a recently discovered virulence factor of Listeria, InlP, had the potential to be, like LntA, a nucleomodulin. My second objective was to explore this hypothesis.The results of my first axis show that BAHD1 interacts with MIER1 and that this interaction is crucial for the association of BAHD1 with HDAC1/2. We also report that BAHD1 modifies chromatin by changing histone methylation and acetylation, as well as DNA methylation, at a target gene, ESR1. These results allow us to propose that BAHD1 form, with MIER1, a scaffold assembling a new chromatin remodeling complex associated with HDAC1/2 : the BAHD1 complex. We then studied the role of BAHD1 in an organ targeted by Listeria, the brain. Our results indicate that a total deficiency in BAHD1 alters the overall transcriptome of this organ in mice. Most of the overexpressed genes are involved in nervous system functions, metabolism and neurological disorders. The predominantly downregulated genes are involved in innate immunity pathways, including interferon response genes. In addition, a haplodeficiency in Bahd1 causes behavioral problems. Compared to Bahd1+/+ mice, Bahd1+/- mice suffer from increased anxiety and changes in acoustic startle reflex. These results suggest that deregulation of BAHD1, through environmental or infectious stimuli, may have neuro-pathological effects.The second axis of my thesis focused on the study of InlP interactions with host nuclear proteins, identified by a double-hybrid screen. First, we show that InlP is an atypical internalin, with leucine-rich repeats characterized by an LPX2 motif. We then identify two nuclear proteins targeted by InlP: the splicing factor and tumor suppressor RBM5 and the corepressor RERE. When InlP is produced ectopically in human cells, it is localized in the nucleus, where it alters the formation of nuclear bodies enriched in RERE. In RBM5-overexpressing cells, InlP inhibits the pro-apoptotic effect of RBM5 and stimulates the formation of dense nuclear bodies associated with RBM5. These results suggest that InlP is a nucleomodulin acting on the assembly and disassembly of target protein storage compartments involved in the synthesis and splicing of host RNAs.This work opens perspectives in the understanding of host-pathogen interactions and in a better knowledge of patho-epigenetic mechanisms, as well as in cell biology and the understanding of membraneless nuclear organelles dynamics.

Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) is a beta-coronavirus from the coronaviridae family. In contrast to SARS-CoV-2, HCoV-OC43 causes upper respiratory tract disease. However, because of their close phylogenic proximity but distinct pathologies, HCoV-OC43 is a very interesting surrogate to study and compare beta coronaviruses. As all viruses, the latter hijack cell machinery proteins to complete their life cycle. Cellular proteins, particularly those incorporated into virions are of particular interest since they often play a vital role in the virus life cycle. Our goal is to employ the proteomic pipeline we developed for HSV-1 to characterize the host proteins associated with highly purified extracellular HCoV-OC43 particles and finally expand it to SARS-CoV-2. To this end, high purity in sufficient yields is crucial as mass spectrometers pick up contaminants. The proteins present in cell culture medium serum, as well as the proteins carried by the exosomes produced by the cells or by the exosomes present in the cell culture media serum, are of particular concern. We utilized a series of methods to eliminate cell culture serum protein contaminations, enrich the viral particles, and separate exosomes from viral particles. For example, we have obtained an efficient separation of concentrated HCoV-OC43 virions from exosomes using density gradient fractionation. Mass spectrometry results on the purified fractions validated the enrichment of viral particles in the virus fraction and the lack of viral proteins in the mock samples. Most interestingly, we detected 69 host proteins unique to the virus fraction (compared to the mock), mostly regulating the RNA metabolism pathway followed by metabolite interconversion, protein modifying enzymes, and protein-binding activity modulator pathways. Since we also purified extracellular exosomes in the process, we probed whether the virus alters their protein content. Mass spectrometry revealed 51 unique proteins exclusively found in exosomes produced by HCoV-OC43 infected cells. These included translational proteins, metabolite interconversion enzymes, and scaffold proteins. Our preliminary RNA interference studies showed that knocking down 14 of these host proteins altered HCoV-OC43 titers. Studying host-virus protein interactions allows us to gain a deeper understanding of how viruses take advantage of host cells, and how we can develop novel viral therapeutics. / Le coronavirus humain OC43 (HCoV-OC43) est un bêta-coronavirus de la famille des coronaviridae. Contrairement au SRAS-CoV2, le HCoV-OC43 provoque une maladie des voies respiratoires supérieures. Cependant, en raison de leur proximité phylogénique étroite mais leur pathologie distincte, HCoV-OC43 est un substitut fort intéressant pour étudier et comparer les bêta-coronavirus. Comme tous les virus, ces derniers détournent les protéines de la machinerie cellulaire pour compléter leur cycle de vie. Les protéines cellulaires, en particulier celles incorporées dans les virions, sont particulièrement intéressantes puisqu'elles jouent souvent un rôle vital dans le cycle de vie du virus. Notre objectif est d'utiliser le pipeline protéomique que nous avons développé pour le HSV-1 afin de caractériser les protéines hôtes associées à des particules virales extracellulaires de HCoV-OC43 hautement purifiées et d'étendre cette approche au SRAS-CoV2. À cette fin, une pureté élevée avec des rendements suffisants est cruciale car les spectromètres de masse détectent les contaminants. Les protéines présentes dans le sérum du milieu de culture cellulaire, ainsi que les protéines portées par les exosomes produits par les cellules ou par les exosomes présentes dans le sérum du milieu de culture cellulaire, sont particulièrement concernées. Nous avons utilisé une série de méthodes pour éliminer les contaminations par les protéines sériques des cultures cellulaires, enrichir les particules virales et séparer les exosomes des virus. Nous avons ainsi obtenu une excellente séparation des virions HCoV-OC43 concentrés des exosomes en utilisant le fractionnement par gradient de densité. Les résultats de spectrométrie de masse sur les fractions purifiées ont validé l'enrichissement en particules virales dans la fraction virale et l'absence de protéines virales dans les échantillons contrôles. Plus intéressant encore, nous avons détecté 69 protéines hôtes uniques à la fraction virale (par rapport aux cellules non-infectées). Ces protéines sont principalement associées à la voie du métabolisme de l'ARN suivie de l'interconversion des métabolites, des enzymes modifiant les protéines et des voies modulatrices de l'activité de liaison aux protéines. Puisque nous avons séparés les exosomes des virus, nous en avons profiter pour évaluer si le virus altère leur contenu protéines. La spectrométrie de masse a de facto identifié 51 protéines uniques aux exosomes produits par les cellules infectées par HCoV-OC43. Celles-ci régulent des voies des protéines traductionnelles, des enzymes d'interconversion des métabolites et des voies des protéines d'échafaudage. Nos études préliminaires sur l’interférence ARN ont montré que l’inactivation de 14 de ces protéines hôtes modifiait le titre de HCoV-OC43. L'étude des interactions hôte-protéine virale nous permet de mieux comprendre comment les virus tirent parti des cellules hôtes et comment nous pouvons développer de nouvelles thérapies virales.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 décembre 2023) / Les forêts, les agents pathogènes et leurs interactions sont de plus en plus affectés par des facteurs liés au changement climatique et à la mondialisation. Ces changements influencent la répartition géographique des agents pathogènes, la gravité de leurs dommages et les impacts de leurs origines indigènes ou invasives. Dothistroma septosporum est un champignon ascomycète présent sur plusieurs continents (Europe, Afrique, Amériques); cet agent pathogène était auparavant considéré comme étant endémique sur les pins dans l'ouest de l'Amérique du Nord. Des épidémies récentes de cette maladie dans l'hémisphère nord ont été observées et semblent être directement liées au changement climatique, qui favorise la propagation de l'agent pathogène et la gravité de la maladie. Par conséquent, l'expansion des connaissances quantitatives sur la façon dont le changement climatique entraîne le développement de D. septosporum est cruciale. Dans le premier chapitre, nous analysons les gènes différentiellement exprimés de D. septosporum au cours de l'infection et comparons les interactions sensibles et tolérantes avec son hôte, Pinus contorta. On a inoculé D. septosporum à des individus de P. contorta et des échantillons du tissu infecté ont été prélevés au cours des stades précoce, moyen et tardif de l'infection. L'expression de gènes différentiellement exprimés a été comparée entre les hôtes sensibles et tolérants à la maladie. Nous avons identifié de nombreux gènes candidats qui sont différentiellement exprimés, dont ceux qui jouent un rôle dans la virulence, notamment de nombreux gènes encodant des transporteurs, facteurs de transcription et CAZymes. Ces gènes ont également été précédemment observés dans d'autres interactions pathogènes. Pour le chapitre deux, nous avons identifié les gènes et les SNPs liés à la croissance de D. septosporum à différentes températures à l'aide d'une analyse d'association à l'échelle du génome (GWA). La croissance de chaque isolat de D. septosporum provenant de l'ouest de l'Amérique du Nord a été mesurée sur une gélose à l'extrait de malt à 3 % pendant 5 semaines et le taux de croissance calculé. La contribution des SNPs a été évaluée par une analyse de régression avec un modèle linéaire. Nous avons identifié des gènes d'intérêt, associés au taux de croissance; les produits de ces gènes sont dans des classes bien connues, comme des transporteurs et la régulation du métabolisme. Les gènes candidats identifiés par GWA qui jouaient un rôle dans la croissance étaient plus répandus à des températures plus élevées (20ºC et 25ºC) en raison du meilleur ajustement des modèles par rapport à 15ºC. Une population « à risque » recueillie à Vancouver, en Colombie-Britannique, qui a un génotypage européen, a été identifiée à partir des données phénotypiques. La population de Vancouver surpasse les autres populations à toutes les températures de 15ºC, 20ºC et 25ºC. Enfin, le chapitre trois utilise des modèles de distribution des espèces (SDM) pour projeter la probabilité de propagation de D. septosporum selon plusieurs scénarios de changement climatique. La méthode « Ensemble » a été utilisée pour prendre en compte plusieurs modèles uniques, ce qui augmente la puissance de prédiction. Les données d'occurrence de l'agent pathogène ont été divisées en deux populations génétiquement distinctes, représentant les populations côtières et intérieures de l'ouest de l'Amérique du Nord. La population côtière a montré une plus grande probabilité de propagation par rapport à son homologue de l'intérieur, mais les deux semblent augmenter avec le temps et se déplacer vers le sud-est sous les climats futurs. Dans l'ensemble, les cartes de prédiction des distributions futures ont montré une augmentation de la superficie totale pour les deux populations au milieu et à la fin du siècle, 2050 et 2100, respectivement. / Forests, pathogens, and their interactions are increasingly affected by factors related to climate change and globalization. These changes are influencing geographical distribution of pathogens, the severity of their damages and the impacts that pathogens have on their native or invasive ranges. Dothistroma septosporum is an ascomycete fungus that is endemic on pines in Western North America and a pathogen with worldwide distribution. Recent outbreaks of this disease in the Northern hemisphere have been observed and appear to be directly linked to the changing climate, which aids the spread and severity of the pathogen. Therefore, the expansion of quantitative knowledge on how climate change drives the development D. septosporum is crucial. In the first chapter, we analyse differentially expressed genes of D. septosporum during infection and compare both susceptible and tolerant interactions with its host, Pinus contorta. Susceptible and tolerant P. contorta were artificially inoculated with D. septosporum and samples of the infected tissue were collected during its early, middle, and late stages of infection. The expression of differentially expressed genes for susceptible hosts were analysed at each time point and further investigated. We identified many candidate genes that play a role in virulence, including many transporters, transcription factors, and CAZymes. These genes have also been previously observed in other pathogenic interactions. For Chapter Two, we use genome-wide association (GWA) analysis to identify genes and SNPs related to growth of D. septosporum at three different temperatures: 15ºC, 20ºC and 25ºC. We monitored the growth of D. septosporum isolates from across Western North America on 3% malt extract agar for 5 weeks and extracted the growth rate by fitting the observations on a linear model. A « risk » population collected from Vancouver, BC, which has a European genotyping, was identified from the phenotypic data. The Vancouver population outperforms other populations at all three temperatures tested. The GWA showed that candidate genes involved in growth were more prevalent at higher temperatures (20oC and 25ºC) compared to 15ºC. These candidate genes include transporters and genes involved with regulation of metabolism. Finally, Chapter Three discusses our use of species distribution models (SDM) to project the likelihood of D. septosporum spread under several climate change scenarios. Ensemble forecasting techniques were used as opposed to single models to improve prediction power. Occurrence data of the pathogen was divided into two genetically distinct populations, representing the coastal and interior populations of Western North America. The coastal population showed a higher likelihood.

L'espèce Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera : Plutellidae) défoliatrice des choux constitue surtout un problème dans les régions tropicales et subtropicales. La lutte chimique a rapidement montré ses limites du fait de l'apparition de résistance dans les populations. Des moyens de lutte alternatifs ont été mis en place, impliquant principalement des insectes parasitoïdes, parmi lesquels Oomyzus sokolowskii (Kurdjumov) (Hymenoptera : Eulophidae) et Cotesia vestalis (Haliday) (Hymenoptera : Braconidae) qui sont les plus couramment utilisés en raison de leur spécificité envers P. xylostella. Afin de contribuer à une meilleure connaissance du contrôle de la teigne en région tropicale, nous avons étudié les relations hôteparasitoïde entre P. xylostella et O. sokolowskii d'une part, et P. xylostella et C. vestalis d'autre part, en conditions de laboratoire et sur le terrain au Sénégal et au Bénin. Au Sénégal, quatre espèces de parasitoïdes sont présentes sur les chenilles : O. sokolowskii, Apanteles litae, C. vestalis et Brachymeria citrae. Au Bénin, seule l'espèce C. vestalis est présente. Au Sénégal comme au Bénin, les facteurs climatiques contribuent au développement de la teigne et les précipitations ne régulent pas les populations du ravageur. Dans ces deux pays, la teigne n'est pas contrôlée par ses ennemis naturels. La lutte biologique par conservation y est à prendre en considération et l'utilisation de plantes compagnes cultivées en association avec le chou peut être envisagée pour réduire les populations de la teigne. Les études en laboratoire ont montré qu'Oomyzus sokolowskii est un parasitoïde larvo-nymphal performant. ConcernantC. vestalis, les femelles détectent et reconnaissent leur hôte grâce aux lipides cuticulaires émis par les chenilles. Des marqueurs moléculaires (isozymes et ISSR) ont confirmé une forte variabilité entre les populations de P. xylostella à l'échelle mondiale, les populations d'Australie et du Japon étant très différentes des autres et formant deux groupes distincts. La structuration des populations semble influencée par le type de climat : tropical et non tropical.

Le nicotinamide est une vitamine fournie par l'alimentation et utilisée en thérapie dans le traitement de certaines pathologies humaines. Chez Leishmania, un protozoaire parasite responsable des leishmanioses, cette vitamine présente une action toxique contre le parasite et une action synergique avec l'antimoine, la principale molécule utilisée dans le traitement des leishmanioses. En recherchant le mode d'action de cette vitamine, nous avons observé qu'elle était en réalité un précurseur essentiel à la synthèse du NAD+ chez le parasite, un cofacteur responsable de la plupart des réactions d'oxydoréduction chez tous les êtres vivants. Leishmania étant en effet dépourvu des voies de synthèse de novo du NAD+, il doit le générer à partir de précurseurs qu'il importe depuis son environnement (nicotinamide, nicotinamide riboside, acide nicotinique). Cette auxotrophie du parasite pour le NAD+ révèle donc un rôle ambivalent du nicotinamide, à la fois toxique à fortes concentrations et pourtant essentiel à sa survie en tant que précurseur majeur du NAD+. À partir des bases de données, nous avons reconstitué l'ensemble de la voie de synthèse du NAD+ chez Leishmania. Parmi les enzymes impliquées, nous avons identifié une nicotinamidase qui n'a pas d'homologue chez les mammifères, et qui assure la conversion du nicotinamide en acide nicotinique, première étape à la synthèse du NAD+. Cette enzyme étant un candidat intéressant pour le développement de molécules ciblant spécifiquement le parasite, nous avons réalisé la caractérisation fonctionnelle de ce gène. Son inactivation induit une diminution importante de la concentration en NAD+ chez le parasite et provoque un arrêt de la prolifération en culture, ainsi qu'une incapacité des mutants à établir une infection durable chez la souris. L'obtention de la structure de la nicotinamidase de L. infantum nous offre désormais la possibilité de développer des inhibiteurs spécifiques contre cette nouvelle cible thérapeutique. / Nicotinamide is a vitamin provided by food that is already used in human therapy. In Leishmania protozoan parasites, this molecule shows toxic activity against parasites and has synergistic activity with antimonials, the main drugs used to treat leishmaniasis. By investigating the mode of action of this cheap vitamin, we discovered that nicotinamide is in fact the main precursor of NAD+ synthesis in Leishmania, a redox cofactor essential for all living cells. Leishmania are indeed devoid of a de novo NAD+ pathway and must synthesize it by scavenging precursors from their environment (nicotinamide, nicotinic acid and nicotinamide riboside). This NAD+ auxotrophy reveals a mixed pattern of activity of nicotinamide in Leishmania, i.e. toxic at high concentrations but also essential for parasite survival through its role in NAD+ synthesis. All enzymes of the Leishmania NAD+ salvage pathway were then identified from genome databases. We focused on a putative nicotinamidase, which has no homolog in mammals and governs the conversion of nicotinamide to nicotinic acid, the first step in the NAD+ salvage pathway. Since this enzyme could be considered as an attractive therapeutic target to develop specific parasite inhibitors, we performed a functional analysis of the corresponding gene. Targeted deletion of the nicotinamidase encoding gene induced a marked drop in parasite NAD+ content and a phenotype with strongly delayed growth. Additionally, these mutants are unable to establish durable infections in mice. The crystal structure of the nicotinamidase from L. infantum will allow us to develop specific inhibitors against this new therapeutic target.

Flavobacterium psychrophilum est l’agent pathogène des flavobactérioses d’eau froide touchant essentiellement les salmonidés dont la truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss d’élevage. Cette bactérie Gram négative a un très fort impact économique en aquaculture car elle peut causer jusqu'à 70 % de mortalité dans les bassins d’élevage. La flavobactériose se décline sous deux formes pathologiques : la maladie de l’eau froide touchant les poissons adultes et le syndrome de l’alevin de truite arc-en-ciel touchant les juvéniles.Au cours de se travail, une méthode de PCR quantitative a été proposée. Elle permet en moins de trois heures de détecter et de quantifier un nombre de copies du gène codant l’ARNr 16S de la bactérie dans les tissus du poisson. Cette méthode a été testée sur différentes suspensions bactériennes (F. psychrophilum, autres flavobactéries, autres pathogènes) afin d’en valider la spécificité. La sensibilité de la méthode de détection a été évaluée à 1 et 2 bactéries par PCR en fonction de la matrice biologique utilisée.Une étude écotoxicologique a été menée et montre d’une part que F. psychrophilum est une bactérie hyper-sensible au cadmium comparée aux autres bactéries Gram négatives. Sa croissance est diminuée d’un facteur 2 en présence d’une contamination au Cd à 0,4 µM. D’autre part, nous avons constaté qu’une contamination de truites juvéniles par 1 µg CdCl2/L (2 mois) et une injection de 5 × 107 flavobactéries par individu (1 mois) ne provoque aucune mortalité. L’expression génique mesurée sur ses poissons démontre que le cadmium peut avoir des effets contradictoires sur le système immunitaire du poisson, pouvant soit exacerber ou diminuer la réponse immunitaire selon l’organe considéré. Un travail comparatif de la prévalence de la flavobactérie dans 7 sites aquacoles d’Aquitaine a démontré que la flavobactérie est omniprésente et que sa pathogénicité est contrôlée par le système immunitaire des poissons en bonne santé apparente. L’expression génique mesurée sur les poissons malades et apparemment sains nous apporte deux informations importantes : 1/ les gènes codant pour la métallothionéine A et l’interleukine 1-β sont de bons bio-marqueurs de la maladie et 2/ la répression des gènes codant pour le complexe majeur d’histocompatibilité 2-β, le facteur de croissance transformant β, le cluster de différentiation 8-α et l’immunoglobuline T dans la rate des poissons malades montre un effondrement du système immunitaire acquis nous permettant d’émettre l’hypothèse que ce phénomène déclenche l’apparition de la maladie. Ainsi, F. psychrophilum aurait un comportement de pathogène à virulence latente.Afin d’imaginer de nouvelles mesures prophylactiques et pour mieux comprendre la pathogénicité de la bactérie, une analyse du protéome de la membrane externe couplée à l’annotation du génome séquencé a été effectuée. Il a été identifié entre autres 1/ des protéines d’adhésion et d’invasion des tissus et 2/ des protéines d’acquisition de métabolites de l’hôte. De plus, un nombre important de protéines immunogènes chez la truite potentiellement utilisable dans un cocktail vaccinant a été détecté. Afin de chercher un vecteur pour ce cocktail, des nanoparticules d’acide γ-glutamique et phénylalanine d’environ 100 à 200 nm de diamètre ont été synthétisées. Ces dernières constituent une approche séduisante pour vacciner les poissons avec des antigènes de F. psychrophilum encapsulés puis incorporés dans la nourriture. / Flavobacterium psychrophilum is the causative agent of cold water flavobacteriosis, a condition affecting mostly salmonid fish, including the farmed rainbow trout Oncorhynchus mykiss. This Gram negative bacterium can cause up to 70% mortality in breeding tanks and has a very strong economic impact on the fish farming industry. Flavobacteriosis can take two pathological forms: the cold water disease affecting adult fish and the rainbow trout fry syndrome affecting juveniles.In the present study, a method of quantitative PCR was devised that allowed for the detection and the quantification, within three hours, of the 16S rRNA copy number in fish tissues. This method’s specificity was confirmed through the use of various bacterial suspensions (F.psychrophilum, others flavobacteria and others pathogens) and its detection limit was estimated to be 1 and 2 bacteria in broth and in biological matrices, respectively.An ecotoxicological study was then performed that showed that, on the one hand, F. psychrophilum is cadmium hypersensitive compared to others Gram negative bacteria because its growth rate, compared to a control, is decreased by a factor 2 at a cadmium concentration of 0,4 µM. On the other hand, we observed that subjecting rainbow trout juveniles to a concentration of 1 µg CdCl2/L for2 months prior to an injection of 5 × 107 F. psychrophilum by fish didn’t lead to any mortality. The gene expression which was measured on these fish demonstrated that cadmium can have contradictory effects on the immune system of fish, which could enhance or decrease the immune response depending of the organ. A comparative work of the prevalence of flavobacteria in 7 fish farms within the Aquitaine region (France) demonstrated that the bacterium was endemic and present in asymptomatic fish. Gene expression levels were measured on diseased and asymptomatic fish and demonstrated that the genes metallothionein A and interleukine 1-β were good biomarkers of the disease and that repression of the genes major histocompatibility complex 2-β, transforming growth factor -β, cluster of differentiation α and immunoglobulin T in the spleen of diseased fish was indicative of a collapse of the acquired immune system. We therefore hypothesized that this event marked the beginning of the disease and that F. psychrophilum is mostly an opportunistic pathogen.To prepare the development of new prophylactic techniques and to understand better the bacterium pathogenicity, an analysis of the outer membrane proteome coupled with sequencing of the bacterial genome was also performed. Furthermore, a significant number of immunogenic proteins were identified as good candidates for the preparation of a vaccine. Finally, γ-glutamic acid and phenylalanine nanoparticles of about 100 - 200 nm in diameter were synthesized to serve as potential vector for this vaccine. These nanoparticles should be tested to administrate F. psychrophilum antigens to fish through the digestive route.