Ce travail porte sur l'étude expérimentale de deux mécanismes de translocations d'acides nucléiques au travers d'une membrane lipidique : la translocation, forcée électrophorétiquement, d'oligomères au travers d'un pore d'alpha-hémolysine et la translocation passive d'un ADN génomique hors de la capside du bactériophage T5. La première partie de la thèse porte sur l'ouverture de molécules d'ADN double brin à travers le nanopore d'alpha hémolysine. Les temps de passage individuels de molécules d'ADN à travers le pore sont mesurés expérimentalement en fonction de la séquence, de la longueur et de la force appliquée sur l'ADN. Les distributions obtenues sont confrontées à un modèle décrivant le passage de l'ADN par la diffusion d'une fourche d'ouverture dans un paysage énergétique unidimensionnel, déterminé par la séquence de la molécule. La deuxième partie porte sur un système in vitro reconstituant les étapes initiales d'infection du bactériophage T5. L'interaction de T5 avec son récepteur membranaire FhuA purifié en détergent, génère une séquence d'événements qui conduit à l'éjection du génome viral hors de la capside : (i) fixation du récepteur ; (ii) activation conduisant à l'ouverture d'un canal d'ADN ; (iii) éjection de l'ADN. La dynamique des trois étapes est mesurée à l'aide d'expériences en population et en virus unique. La dernière étape est comparée à un modèle physique qui révèle une dynamique fortement hors d'équilibre à l'initiation de l'éjection. Enfin, FhuA est reconstitué dans des vésicules lipidiques géantes afin de suivre l'éjection par microscopie de fluorescence et par électrophysiologie à travers une membrane lipidique.

Le parvovirus H-1 (PVH-1) montre plusieurs propriétés anti-cancéreuses. Il se réplique préférentiellement dans les cellules transformées humaines (oncotropisme). Ceci peut mener à la destruction de ces cellules (oncolyse) et à la libération, dans le milieu extracellulaire, de particules virales néo-formées, pouvant à leur tour infecter et détruire les cellules transformées avoisinantes. Ces propriétés observées in vitro sont complétées par des données in vivo, qui montrent que le PVH-1 protège les animaux de laboratoire du développement tumoral (oncosuppression). Toutes ces caractéristiques font du PVH-1 une potentielle alternative thérapeutique aux traitements antimitotiques actuels. L'éventuelle utilisation du PVH-1 en clinique nécessite cependant une connaissance plus approfondie de son mode de fonctionnement. Nous nous sommes intéressés en particulier à deux problèmes rencontrés avec les traitements actuels, afin de voir si le PVH-1 pouvait y apporter une réponse satisfaisante. La spécificité des molécules actuelles est relativement limitée, et celles-ci peuvent donc porter atteinte aux cellules saines de l'organisme. Dans une cellule humaine non transformée, le PVH-1 ne présente généralement pas d'effet délétère. En effet, le promoteur parvoviral P4 n'y est pas activé, et la protéine NS1, principal acteur de la toxicité induite par le PVH-1, n'est donc pas produite. Nous avons cependant cherché à savoir ce qu'il adviendrait si la protéine NS1 venait à être exprimée dans une cellule normalement insensible à l'infection parvovirale. Pour cela, nous avons utilisé un modèle permettant l'expression ectopique de NS1, contrôlée par un promoteur fort, constitutivement actif, dans un type particulier de cellules embryonnaires humaines, non immortalisées et présentant un phénotype normal, les cellules MRC-5. Nos travaux montrent que, dans ce modèle, l'expression massive de la protéine NS1 induit des modifications importantes du réseau d'actine du cytosquelette et la mort de ces cellules. L'utilisation d'une construction permettant l'expression d'une forme de NS1 mutée au niveau de son résidu de sérine en position 473 empêche à la fois les déformations du cytosquelette et la mort cellulaire. En revanche, alors que les cellules MRC-5 SV2, équivalents transformés des MRC-5, meurent sous l'effet de la surexpression des formes native et mutante de NS1, la mutation de la sérine 473 empêche l'induction de la déformation du cytosquelette. Un autre problème rencontré avec les thérapies oncologiques actuelles est la possibilité de résistance au traitement. De récents travaux démontrent que le PVH-1 peut être efficace contre des tumeurs résistantes à certains traitements classiques, notamment dans le cas de gliomes et de certains cancers du pancréas. Nous nous sommes intéressés à des cellules humaines de cancer du sein présentant un haut risque de formation de métastases, les cellules de la lignée SK-BR-7. Ces cellules montrent une résistance à l'apoptose, par l'intermédiaire d'un système autocrine inhibant l'induction de celle-ci. Nos travaux montrent que ces cellules sont sensibles à l'infection par le PVH-1, qui induit leur lyse. L'infection par le parvovirus H-1 n'induit pas l'expression de la caspase 3 comme le modèle autocrine initial aurait pu le laisser penser. En revanche, il ne nous a pas été possible de déterminer la nature exacte des voies de mort mises en oeuvre par le PVH-1. En effet, après avoir examiné les effets d'un composé non commercial, critique pour l'utilisation du modèle étudié, et dont l'activité inhibitrice du système s'est révélée défaillante, des délais prolongés dans la production de nouvelles doses de ce composé par nos collaborateurs nous ont empêché de formuler des conclusions certaines quant aux résultats obtenus pour ce projet.

Le premier chapitre de mon HDR concerne la propagation des vibrations dans un système hôte-parasitoïde. Mais avant de pouvoir analyser les vibrations émises par les deux insectes, il a fallu étudier la propagation des vibrations dans les végétaux. En effet la feuille est un système complexe composé de différents matériaux : la nervure centrale, les nervures secondaires et le limbe, ayant chacun des propriétés physiques différentes. Afin de mieux connaître les propriétés physiques de la feuille nous avons utilisé deux approches. Dans une première approche, nous avons fait une analyse temps-fréquence de la propagation des signaux sur une feuille de pommier. Puis, dans un deuxième temps, nous avons analysé, à l'aide d'une méthode d'éléments finis, la déformation d'une feuille soumise à une force. Nous avons ensuite analysé les signaux vibratoires émis par le parasitoïde et ceux émis par la mineuse. Puis, nous avons étudié le comportement de la mineuse quand elle est soumise aux vibrations simulant l'attaque d'un parasitoïde et réciproquement le comportement d'un parasitoïde quand il est soumis aux vibrations simulant la présence d'une mineuse dans une mine.<br /><br />Le deuxième chapitre fait partie d'un projet européen, CICADA, dans lequel j'étudie un modèle physique de mouvement des soies du grillon, soies étant utilisées comme mécanorécepteurs pour échapper à la prédation. Le modèle physique que nous avons élaboré permet de calculer la réponse de la canopée de poils. Or, la distribution de poils peut varier suivant les espèces de grillons mais aussi en fonction du stade des grillons. Le grillon comprend 9 stades qui auront une sensibilité différente face à l'attaque des prédateurs.<br /><br />J'ai ensuite travaillé sur un projet d'invasion biologique répondant à un appel d'offre du Ministère de l'Aménagement du Territoire et de l'Environnement dans lequel j'étudie la propagation d'un insecte invasif et de ses parasitoïdes, c'est l'objet du troisième chapitre de mon HDR. Notre problème d'invasion est causé par la mineuse du marronnier qui s'attaque aux feuilles de l'arbre. Cette mineuse est elle-même attaquée par des parasitoïdes. Notre but était de comprendre les mécanismes de l'invasion de cette mineuse et de trouver des moyens de lutte pour la stopper. Le système biologique que nous avons donc étudié est un système tritrophique composé d'un végétal, le marronnier d'Inde (Aesculus hippocastaneum), d'un insecte phytophage, la mineuse (Cameraria ohridella) et de ses parasitoïdes polyphages. Pour modéliser l'avancée spatio-temporelle de la mineuse et de ses parasitoïdes, deux approches ont été utilisées, d'une part un modèle discret contenant toutes les données biologiques du terrain. D'autre part un modèle continu, plus simple, mais donnant des dynamiques assez complexes d'un point de vue mathématique. Ces deux modèles ont ensuite été comparés dans le cadre de l'effet de la dispersion des mineuses sur l'avancée de celles-ci.

Ce travail décrit une étude quantitative de plusieurs systèmes de reconnaissance biomoléculaire impliquant des interactions multivalentes.<br />Deux chapitres sont axés sur l'utilisation de plateformes supramoléculaires cyclodécapeptidiques appelées RAFT (Regioselectively Adressable Functionnalized Template) permettant la présentation multiple de ligand saccharidique ou cyclopeptidique. Une étude cinétique et thermodynamique des interactions entre les ligands RAFT-saccharide et une lectine modèle, la concanavaline A, a permis de démontrer que deux mécanismes moléculaires sont à l'origine de la meilleure affinité des RAFT multivalents par rapport à leurs homologues monovalents : d'une part un effet de « proximité-statistique » dû à la concentration locale élevée en motif sucre et d'autre part la capacité des RAFT multivalents à se lier à plusieurs lectines selon un effet « cluster ». Des études préliminaires ont également concerné l'analyse de l'interaction entre RAFT-RGD et des récepteurs cellulaires.<br />Dans un dernier chapitre, nous avons démontré, pour la première fois, la formation de films multicouches grâce à des interactions de type hôte-invité entre deux biopolymères de chitosane, l'un fonctionnalisés par des cavités Β-cyclodextrine et l'autre par des entités adamantane. Bien que la stabilité de l'assemblage soit assurée par des interactions de complexation multivalentes, la croissance de l'assemblage, quant à elle, dépend de la disponibilité des sites de complexation offerts par chacune des couches. De plus, les deux polymères chargés positivement confèrent à l'assemblage des propriétés de gonflement-dégonflement en réponse à des variations de force ionique et pH.

La monogamie est un système d'appariement qui lie une seule femelle à un seul mâle. Cette monogamie peut être définie comme sociale et génétique (au-delà de l'observation du couple, la descendance est seulement issue de ce couple, aucun changement de partenaire n'apparaît), ou comme sociale et non génétique (dans ce cas, des infidélités ou des divorces peuvent être observés). Ce système d'appariement est très rare dans le monde animal. Il concerne moins de 1% des animaux et la majeure partie des études sur le monogamie a été réalisée sur des vertébrés (notamment sur les oiseaux dont 90% des espèces présentent ce système monogame). Plus rares sont les études réalisées sur les invertébrés (quelques cas de monogamie étudiée chez des crustacés, des insectes ...). Pourtant l'étude de la monogamie à un niveau taxonomique inférieur permet de comprendre ses caractéristiques en éliminant la complexité sociale (apprentissage, imitation ...) présente chez les vertébrés. Schistosoma mansoni est un parasite (responsable de la bilharziose) qui présente plusieurs aspects intéressants du point de vue système d'appariement : (1) la femelle vit dans le canal gynéchophore de son mâle, nous observons bien un couple formé d'une seule femelle et d'un seul mâle, il s'agit donc d'une monogamie sociale ; (2) S. mansoni est l'espèce monogame de rang taxonomique le plus bas à notre connaissance, ce qui permet d'éliminer au maximum les biais de complexité sociale cités précédemment ; (3) enfin, cette espèce parasite présente des avantages d'un point de vue expérimental : les sexes et génotypes des individus utilisés peuvent et sont contrôlés en laboratoire et des populations "naturellement" clonales sont à notre disposition. C'est pourquoi, nous nous sommes intéressés à la monogamie chez cet invertébré parasite monogame. Plusieurs questions sont développées durant cette thèse : qui est monogame parmi les Schistosomatidae et pourquoi ? Est-ce que une monogamie sociale et génétique ou sociale et non génétique (i.e. des changements de partenaires sont-ils observés) ? Quels sont les facteurs impliqués dans ces changements de partenaire (dissimilarité entre les partenaires du couple, biais de sex ratio en faveur des males, différences neutres, fonctionnelles et phénotypiques entre les mâles, effet du système immunitaire de l'hôte vertébré) ? C'est par l'association de réflexions et d'expérimentations que nous tentons de répondre à ces questions.

Cette thèse a été réalisée dans le contexte de la réémergence de la schistosomose à Schistosoma mansoni (plathelminthe trématode) dans le Dhofar en Oman. Le travail est centré sur les interactions hôte-parasite et sur leurs conséquences sur la transmission du schistosome. Une première partie est consacrée à l'étude spatio-temporelle de la structure génétique des populations de Biomphalaria pfeifferi (mollusque gastéropode d'eau douce). Elle a été réalisée à l'aide de neuf marqueurs microsatellites sur 18 populations de mollusques. Les populations de B. pfeifferi étudiées sont caractérisées par une très faible variabilité génétique intra populationnelle. Par contre, elles sont fortement différenciées génétiquement. Une différenciation temporelle a également été enregistrée dans certaines populations. Une seconde partie est consacrée à l'étude des traits d'histoire de vie et des relations hôte-parasite. Elle a été réalisée à l'aide de huit combinaisons hôte-parasites qui diffèrent soit par la population de parasite (origine humaine ou origine murine), soit par la catégorie du site (naturel ou aménagé), soit par le morphe du mollusque (pigmenté ou albinos). Les traits d'histoire de vie suivants ont été analysés : croissance, fécondité et survie de B. pfeifferi et taux d'infestation, période prépatente et production cercarienne de S. mansoni. Les résultats montrent que la population de S. mansoni et le morphe de B. pfeifferi jouent un rôle majeur dans la transmission de la schistosomose dans le Dhofar. Les résultats sont discutés en termes de compatibilité hôte-parasite.

L'étude des interactions hôtes/parasites est actuellement un thème de recherche incontournable des sciences de l'évolution. Une des questions majeures soulevée par ces études est de comprendre pourquoi certains parasites provoquent des maladies mortelles, alors que d'autres restent relativement bénins pour leurs hôtes. Dans ce défi que tentent de relever les biologistes de l'évolution mais également les sciences médicales, nous avons choisi de nous intéresser à la malaria aviaire, et plus précisément à son représentant le plus commun dans les populations naturelles d'oiseaux : Plasmodium relictum. En procédant à des infections expérimentales de canaris domestiques (Serinus canaria), nous avons voulu comprendre quels facteurs liés aux caractéristiques du parasite et de l'oiseau (au niveau de l'individu ou de la population) pouvaient influencer la virulence de Plasmodium relictum. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que des facteurs, tels que le passé infectieux de l'hôte, la dose de parasites reçue, la prévalence de ces derniers dans la population d'oiseaux ou bien encore les interactions sociales entre individus, pouvaient moduler les coûts d'une telle infection. La virulence est un trait composite qui dépend, certes, de l'exploitation de l'hôte par les parasites mais également de la réponse immunitaire de ce dernier contre l'infection. Nous avons pu le vérifier dans notre système expérimental en utilisant une approche immuno-écologique. Nous nous sommes enfin intéressée aux conditions favorisant l'évolution de la virulence : ce qui est essentiel pour comprendre l'émergence ou la réémergence de maladies infectieuses et pour développer des stratégies de contrôle de ces maladies.

P. aeruginosa est l'un des principaux pathogènes responsables d'infections nosocomiales. Les infections aiguës à cette bactérie sont associées à une morbidité et une mortalité élevées, notamment lorsque ces bactéries envahissent le système sanguin. Dans la majorité des cas, ces infections du sang sont la conséquence du franchissement par P. aeruginosa de deux barrières tissulaires: l'épithélium pour les muqueuses et l'endothélium pour les vaisseaux. Bien que ces évènements soient des étapes cruciales de la dissémination systémique des bactéries, les mécanismes permettant la pénétration du pathogène dans l'organisme sont à ce jour mal compris. Pour l'endothélium, nous démontrons que P. aeruginosa induit le clivage de la VE-cadhérine, une protéine des jonctions intercellulaires, par l'action de la protéase LasB sécrétée par les bactéries. Le clivage de la VE-cadhérine entraîne une perte d'intégrité de l'endothélium, permettant aux bactéries d'accéder au domaine basolatéral des cellules. Les toxines du Système de Sécrétion de Type 3 peuvent être alors injectées dans la cellule, provoquant une intoxication cellulaire majeure. Le franchissement de la barrière épithéliale s'opère par un mécanisme très différent. Par microscopie confocale en temps réel, nous montrons que P. aeruginosa transmigre par une voie paracellulaire, en exploitant des faiblesses jonctionnelles aux sites de divisions et de morts cellulaires. Ce processus de transmigration requiert l'action coordonnée des pili de Type IV, du flagelle et de toxines du Système de Sécrétion de Type 3. / P. aeruginosa is one of the main pathogens responsible for nosocomial infections. Acute infections by this bacterium are associated with high rates of morbidity and mortality, especially when bacteria disseminate in the bloodstream. In most situations, blood infection is the consequence of the crossing of two essential tissue barriers by P. aeruginosa: the epithelium for the mucosa and the endothelium for the blood vessel. Although these events are critical steps for systemic spread of bacteria, the mechanisms involved in the penetration of the pathogen in the organism are poorly understood. For the endothelium, we demonstrate that P. aeruginosa induces the cleavage of VE-cadherin, a protein of endothelial junctions, by the action of LasB, a protease secreted by the bacteria. VE-cadherin cleavage induces a loss of integrity of the endothelium, allowing bacterial access to the cellular basolateral domain. Once in this location, the Type 3 secretion system may inject toxins into the cell, triggering a major intoxication process. Crossing of the epithelial barrier involves a very different mechanism. Using real-time confocal microscopy, we show that P. aeruginosa uses a paracellular route to transmigrate, exploiting junctional weaknesses at sites of cell division and cell death. This transmigration process requires the coordinate actions of Type IV pili, the flagellum and toxins of the Type 3 secretion system.

Le virus Nipah (NiV) est un paramyxovirus zoonotique du genre Henipavirus, qui a émergé en 1998. NiV infecte l'homme et cause des troubles respiratoires et des encéphalites avec une forte létalité. A l’inverse, chez les hôtes naturels de NiV, les chauves-souris de la famille des Pteropodidae, l’infection est asymptomatique. Cependant, les mécanismes permettant aux Pteropodidae de contrôler l’infection sont inconnus à ce jour. NiV produit des protéines non structurales, V, W et C, qui sont des facteurs de virulence. V, W et C inhibent les voies de l’interféron de type 1. De plus, la protéine W inhibe la production de chimiokines in vitro et module la réponse inflammatoire in vivo, mais son mécanisme d’action reste inconnu. La voie NF-κB étant le principal régulateur de la réponse inflammatoire, nous avons émis l’hypothèse que W pourrait moduler la voie NF-κB. Nous avons démontré que la protéine W inhibe l'activation de la voie canonique de NF-κB induite par TNFα et IL-1β, effet pour lequel sa région C-terminale spécifique est nécessaire. Nous avons également identifié quels signaux d’import et d’export nucléaires de W sont nécessaires à son effet inhibiteur et ainsi mis en évidence l’importance du trafic nucléo-cytoplasmique de W pour l’inhibition de NF-κB. L’étude des interactions de W avec les protéines cellulaires nous a permis d’identifier un partenaire prometteur connu pour son rôle dans le rétrocontrôle négatif de NF-κB. Enfin, le rôle de W dans l'inhibition de la voie NF-κB a été démontré pendant l'infection par NiV. Les résultats obtenus ouvrent la voie à la compréhension du mécanisme par lequel W module la réponse inflammatoire. Finalement, afin de mieux comprendre le contrôle de l’infection de NiV par son hôte naturel, nous avons généré des lignées cellulaires primaires et immortalisées de chauve-souris Pteropus giganteus. Ces cellules devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes par lesquels ces chauves-souris contrôlent l’infection virale. / Nipah virus (NiV), from Henipavirus genus, is a zoonotic paramyxovirus, which emerged in 1998. In humans, it causes acute respiratory distress and encephalitis with a high lethality. Conversely, the natural hosts of NiV, bats from the Pteropodidae family, are asymptomatic. The mechanisms by which the Pteropodidae control infection are unknown to date. NiV produces non-structural proteins, V, W and C, which are virulence factors. V, W and C inhibit the type 1 interferon pathways. Moreover, W inhibits the production of chemokines in vitro and modulates the inflammatory response in vivo, but its mechanism remains unknown. The NF-κB pathway being the main regulator of the inflammatory response, we hypothesized that W could modulate the NF-κB pathway. We demonstrated that protein W inhibits the activation of the NF-κB canonical pathway induced by TNFα and IL-1β. The specific C-terminal region of W is necessary for this effect. We have also identified which nuclear import and export signals of W are necessary for its inhibitory effect and thus highlight the importance of the nucleo-cytoplasmic trafficking of W for the inhibition of NF-κB. The study of the interactions of W with the cellular proteins allowed us to identify a promising partner known for its role in the negative feedback of NF-κB. Finally, the role of W in the inhibition of the NF-κB pathway was demonstrated during the infection with NiV. The results obtained open the way to understanding the mechanism by which W modulates the inflammatory response. Finally, to better understand the control of the infection of NiV by its natural host, we generated primary and immortalized cell lines of Pteropus giganteus bat. These cells should provide a better understanding of the mechanisms by which these bats control viral infection.

Darwin a révélé au monde que les espèces vivantes ne cessent jamais d’évoluer, mais les mécanismes moléculaires de cette évolution restent le sujet de recherches intenses. La biologie systémique propose que les relations entre génotype, environnement et phénotype soient sous-tendues par un ensemble de réseaux moléculaires dynamiques au sein de la cellule, mais l’organisation de ces réseaux demeure mystérieuse. En combinant des concepts établis en biologie évolutive et systémique avec la cartographie d’interactions protéiques et l’étude des méthodologies d’annotation de génomes, j’ai développé de nouvelles approches bioinformatiques qui ont en partie dévoilé la composition et l’organisation des systèmes cellulaires de trois organismes eucaryotes : la levure de boulanger, le nématode Caenorhabditis elegans et la plante Arabidopsis thaliana. L’analyse de ces systèmes m’a conduit à proposer des hypothèses sur les principes évolutifs des systèmes biologiques. En premier lieu, je propose une théorie selon laquelle la traduction fortuite de régions intergéniques produirait des peptides sur lesquels la sélection naturelle agirait pour aboutir occasionnellement à la création de protéines de novo. De plus, je montre que l’évolution de protéines apparues par duplication de gènes est corrélée avec celle de leurs profils d’interactions. Enfin, j’ai mis en évidence des signatures de la co-évolution ancestrale hôte-pathogène dans l’organisation topologique du réseau d‘interactions entre protéines de l’hôte. Mes travaux confortent l’hypothèse que les systèmes moléculaires évoluent, eux aussi, de manière darwinienne. / Darwin exposed to the world that living species continuously evolve. Yet the molecular mechanisms of evolution remain under intense research. Systems biology proposes that dynamic molecular networks underlie relationships between genotype, environment and phenotype, but the organization of these networks is mysterious. Combining established concepts from evolutionary and systems biology with protein interaction mapping and the study of genome annotation methodologies, I have developed new bioinformatics approaches that partially unveiled the composition and organization of cellular systems for three eukaryotic organisms: the baker’s yeast, the nematode Caenorhabditis elegans and the plant Arabidopsis thaliana. My analyses led to insights into the evolution of biological systems. First, I propose that the translation of peptides from intergenic regions could lead to de novo birth of new protein-coding genes. Second, I show that the evolution of proteins originating from gene duplications and of their physical interaction repertoires are tightly interrelated. Lastly, I uncover signatures of the ancestral host-pathogen co-evolution in the topology of a host protein interaction network. My PhD work supports the thesis that molecular systems also evolve in a Darwinian fashion.