Granulocytes represent the first line of defense against bacteria and fungi. Daily production of granulocytes is sustained by steady state granulopoiesis but under stress (e.g., bacterial infection) this program switches to emergency granulopoiesis (EG) which ensures the production of granulocytes at enhanced and accelerated rates. Very little is known about the regulation of EG. In this thesis, we showed that disruption of the β-catenin-TCF/LEF mediated transcription impairs EG in vivo. Further, we demonstrated that lipopolysaccharide (LPS) administration in mice induces accumulation of active β-catenin in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) as early as 4 hours (H) after stimulation, with highest increase at 24H. This effect was at least partially mediated in a niche independent manner, since LPS stimulation in vitro induced β-catenin accumulation in c-Kit+ cells after 2H, with a peak activation at 4H. Using single cell RNA sequencing, we determined the cell cluster dynamics of HSPCs following 4H LPS stimulation. Interestingly, we identified a possible upstream activator of β- catenin in one of the clusters - Wnt10b. Indeed, Wnt10b showed a similar expression pattern as EG master regulator Cebpb and β-catenin activation, following in vitro treatment with LPS. Altogether, our data point...

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

<p>Megakaryocyte cultures are a strong tool for the in vitro investigation of platelet production in platelet disorders. Peripheral blood derived hematopoietic progenitor cells (PB-HPCs) are the most accessible source of HPCs with high potential to produce mature megakaryocytes in vitro; however, they are present in low numbers making peripheral blood an inefficient source. Additionally, a megakaryocyte culture with an optimized thrombopoietin (TPO) concentration is required which can reliably allow the investigation of suppressive effects of antibodies/plasma from immune thrombocytopenia (ITP) patients. In this study, we developed a megakaryocyte culture with the utilization of human PB-HPCs in an efficient fashion resulting in the production of high purity megakaryocytes in a TPO-dependent manner.</p> <p>The mononuclear fraction was collected from 180 mL of peripheral whole blood and CD34+ cells were isolated by a positive selection yielding the average of 5.5 x 105 ± 2.5 x 105 CD34+ cells (n = 18). Using 96-well tissue-culture plates and seeding 10,000 CD34+ cells/well, the average of 13 experiments in triplicate can be set up utilizing isolated CD34+ in an efficient manner. Capitalizing on a TPO dose-dependent megakaryocyte production experiment, 20 ng/mL was established as the TPO concentration which resulted in the production of mature megakaryocytes without reaching the plateau in megakaryopoiesis response. On day 11 of culture, the expression of megakaryocytic lineage (CD41/61+) and maturation (CD41/61+CD42+) markers peaked at 90.65% and 76.10%. In conclusion, this culture system has broad application for investigation of platelet disorders and drug discovery which can be accessible to all researchers.</p> / Master of Science (MSc)

Allogeneic Hematopoietic stem cell transplants (HSCT) are used for the treatment of bone marrow aplasias. Allogeneic HSCT is performed by treating the patient with chemotherapy drugs and irradiation and then transplanting hematopoietic stem cells from a healthy donor to restore the immune system and hematopoietic cells. Allogeneic HSCTs has the added benefit of the graft vs leukemia effect (GvL), whereby donor allogeneic T cells are able to mount immune responses against any residual cancer cells. However, alloreactivity towards the mismatched minor and major histocompatibility antigens the patient's healthy tissues leads to graft vs host disease (GvHD). This process is also mediated by Macrophages, Dendritic cells, B cells. Furthermore, a decrease in the number of NK, B, and T regulatory cells exacerbates GvHD. This leads to a state of systemic inflammation, tissue damage and multiorgan fibrosis. Current therapies designed to suppress the immune system have been shown to be efficacious in preventing GvHD but patients become susceptible to infection or experience cancer relapse through the elimination of the GvL response as well. In this thesis, we explore two strategies for targeting T cell activation in two mouse models of GvHD. In the first model, we examined the contribution of donor-derived complement C5 on the induction GvHD. We observed that recipient mice were only protected from GvHD when donor cells were deficient for complement protein C5. Our second strategy involves selective targeting of alloreactive T cells using peptide immunotherapy. For this approach, we first developed a humanized mouse model of GvHD whereby cells from donor mice expressing human class II HLA were reconstituted into recipient mice expressing human class I HLA. We then tested peptide immunotherapy using peptides derived from the human class I HLA. Our initial results were inconclusive and require further optimization. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / Graft vs Host Disease is an unwanted side effect of mismatched bone marrow transplant. Donor T cells recognize and attack mismatched tissues of the recipient and this leads to systemic inflammation and tissue scarring. Current treatments primarily target T-cell activation by suppressing the immune system, however, this leaves the patients susceptible to recurrent infections. In this thesis we describe the creation of two mouse models of Graft vs Host Disease and then examine two ways of specifically targeting donor T cell activation that is designed not to affect normal immune responses.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells that continuously regenerate the entire hematopoietic system by producing billions of blood cells. Dormant HSCs (dHSCs) represent a distinct subpopulation of HSCs characterized by deep quiescence and very low overall biosynthetic activity. Despite this, dHSCs have the highest reconstitution and self-renewal potential and reside at the apex of the hematopoietic hierarchy. While dHSCs do not significantly contribute to daily blood cell production under steady-state conditions, they can be reversibly activated in response to inflammatory signals or blood loss. Thus, dHSCs serve as a reserve pool of HSCs during the entire life. Insufficient dormancy can subject dHSCs to replication stress and promote the accumulation of somatic mutations, increasing the risk of their exhaustion or malignant transformation. Conversely, excessive dormancy can limit normal blood cell production, potentially resulting in bone marrow failure. Therefore, further investigations exploring the mechanisms controlling HSC dormancy are required, as this knowledge is essential for developing novel therapeutic interventions for supporting blood production following chemotherapy or HSC transplantation. Progress in dHSC research has been impeded by technical difficulties associated with isolating these cells. Current methods include either label retention assay, which is very time-consuming, or the use specialized reporter mouse strains that are not readily available. Herein, we utilized single-cell RNA sequencing of HSCs to identify potential surface markers which would facilitate the direct isolation of dHSCs using fluorescence-activated cell sorting (FACS). We selected CD38 as a candidate gene and confirmed that its high expression levels in LT-HSCs, the most functional HSCs identified by the latest surface phenotype, correspond to the dormant subpopulation. Namely, we employed four techniques (staining for cell cycle, label incorporation assay, label retention assay, and single-cell division tracking assay) and demonstrated that CD38+ HSCs are the most quiescent among LT-HSCs. Additionally, through serial competitive transplantation into lethally irradiated mice, we compared CD38+ and CD38- LT-HSCs and discovered that CD38+ LT-HSCs have superior repopulation and self-renewal capacities compared to CD38- LT-HSCs. Thus, we concluded that CD38 is a marker for dHSCs in mice. Besides, we applied the models of hematopoietic stress – acute thrombocytopenia, injection of viral mimetic polyinosinic:polycytidylic acid, and the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil, and showed that high expression levels of CD38 on LT-HSCs define dHSCs both in homeostasis and under stress conditions. Notably, we showed that CD38 is not only a marker but also has a functional role in mediating HSC dormancy. Using CD38 knock-out mice, small molecule inhibitor for CD38 enzymatic activity, in vitro assays, bulk RNA sequencing, and confocal microscopy, we discovered a previously unknown signaling axis that promotes HSC dormancy via CD38 enzymatic activity. We demonstrated that second messenger cADPR, synthesized by CD38 through the conversion of nicotinamide adenine dinucleotide - NAD+, elevates free cytoplasmic Ca2+ in dHSCs. This elevation induces the expression of the transcription factor c-Fos. Subsequently, c-Fos forms complexes with the Smad2/3, ultimately promoting dHSC quiescence in p57Kip2-dependent manner. Thus, we revealed that CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos-Smad2/3/p57kip2 axis supports dHSCs. Human HSCs (hHSC) are defined as CD38lo/- ; however, CD38 is expressed by various immune cell types present in human bone marrow, such as B-lymphocytes, T-lymphocytes, NK-cells, neutrophils and monocytes. Our co-culture experiments of hHSCs with CD38+ cells and human bone marrow imaging suggest that CD38 promotes hHSC quiescence, however indirectly, in a paracrine manner. Besides, several hematological malignancies (e.g. multiple myeloma, chronic lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia) express CD38 at a high level. We hypothesize that tumor microenvironment enriched in the products of CD38 ecto-enzymatic activity may suppress the cell cycle of healthy hHSCs leading to cancer-related pancytopenia. Therefore, inhibiting CD38-mediated cADPR production might support healthy hematopoiesis in patients with hematologic malignancies. In summary, while CD38/Ca2+ and c-Fos have individually been implicated in proliferation in other cell types, our study for the first time reveals their role in promoting HSC dormancy in collaboration with well-known mediators of HSC quiescence Smad2/3 and p57Kip2. Therefore, we gathered the pieces of the puzzle together and discovered the novel CD38 enzymatic activity-driven signaling pathway controlling HSC dormancy. Manipulation of this axis can potentially stimulate an efficient dHSC response to hematopoietic stress. / Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind seltene Zellen, die das gesamte blutbildende System kontinuierlich regenerieren, indem sie Milliarden von Blutzellen produzieren. Ruhende HSZ (rHSZ) stellen eine besondere Subpopulation von HSZ dar, die sich durch tiefe Ruhephasen und eine sehr geringe Biosyntheseaktivität auszeichnet. Trotzdem haben rHSZ das höchste Rekonstitutions- und Selbsterneuerungspotenzial und stehen an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie. Während rHSZs unter Normalbedingungen nicht wesentlich zur täglichen Blutzellproduktion beitragen, können sie als Reaktion auf Entzündungssignale oder Blutverlust reversibel aktiviert werden. Somit dienen rHSZ während des gesamten Lebens als HSZ-Reservoir. Eine gestörte Ruhe der rHSZs kann die Zellen einem Replikationsstress aussetzen und die Anhäufung somatischer Mutationen fördern, was das Risiko für Zellerschöpfung oder maligne Transformation erhöht. Umgekehrt kann eine übermäßige Ruhephase die normale Blutzellproduktion einschränken und möglicherweise zu Knochenmarksversagen führen. Daher ist eine weitere Erforschung der Mechanismen erforderlich, die die HSZ-Ruhephase steuern, da dieses Wissen für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Maßnahmen zur Unterstützung der Blutproduktion nach einer Chemotherapie oder HSZ-Transplantation unerlässlich ist. Der Fortschritt in der rHSZ-Forschung wurde durch technische Schwierigkeiten bei der Isolierung dieser Zellen behindert. Zu den derzeitigen Methoden gehören entweder der sehr zeitaufwändige Label-Retentionstest oder die Verwendung spezieller Reportermausstämme, die nicht ohne Weiteres verfügbar sind. In dieser Arbeit haben wir die Einzelzell-RNA-Sequenzierung von HSZs genutzt, um potenzielle Oberflächenmarker zu identifizieren, die die direkte Isolierung von rHSZs mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) erleichtern würden. Wir wählten CD38 als Kandidatengen aus und überprüften, dass dessen hohe Expression auf den funktionellsten HSZ (LT-HSZ), welche mit dem neuesten Oberflächenphänotyp isoliert wurden, die ruhenden Subpopulation identifizieren kann. Wir haben vier Techniken angewandt (Färbung für den Zellzyklus, Label-Inkorporationstest, Label-Retentionstest und Einzelzellteilungstest) und gezeigt, dass CD38+ HSZ die am tiefsten ruhenden LT-HSZs sind. Darüber hinaus haben wir durch serielle konkurrierende Transplantation in letal bestrahlte Mäuse CD38+ und CD38- LT-HSZs verglichen und festgestellt, dass CD38+ LT-HSZs im Vergleich zu CD38- LT-HSZs eine höhere Wiederbesiedlungs- und Selbsterneuerungskapazität haben. Daraus schlossen wir, dass CD38 ein Marker für rHSZs in Mäusen ist. Außerdem wendeten wir Modelle für hämatopoetischen Stress an - akute Thrombozytopenie, Injektion des viralen Mimetikums Polyinosin:Polycytidylsäure und des Chemotherapeutikums 5-Fluorouracil - und zeigten, dass eine hohe Expressionsrate von CD38 auf LT-HSZs rHSZs sowohl in Homöostase als auch unter Stressbedingungen definiert. Besonders bemerkenswert ist, dass wir zeigen konnten, dass CD38 nicht nur ein Marker ist, sondern auch eine funktionelle Rolle bei der Vermittlung der HSZ-Ruhe spielt. Mithilfe von CD38-Knock-out-Mäusen, kleinen Molekül-Inhibitoren für die CD38-Enzymaktivität, In-vitro-Tests, Massen-RNA-Sequenzierung und konfokaler Mikroskopie entdeckten wir eine bisher unbekannte Signalachse, die die HSZ-Ruhe über die enzymatische Aktivität von CD38 fördert. Wir konnten nachweisen, dass der sekundäre Botenstoff cADPR, der von CD38 durch die Umwandlung von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) synthetisiert wird, das freie zytoplasmatische Ca2+ in rHSZs erhöht. Diese Erhöhung induziert die Expression des Transkriptionsfaktors c-Fos. Anschließend bildet c-Fos Komplexe mit Smad2/3 und fördert schließlich die Ruhe der rHSZ in Abhängigkeit von p57Kip2. Wir konnten also zeigen, dass die CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos-Smad2/3/p57kip2-Achse rHSZs unterstützt. Humane HSZ (hHSZ) werden als CD38lo/- definiert; CD38 wird jedoch von verschiedenen Immunzellarten im menschlichen Knochenmark exprimiert, z. B. von B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, NK-Zellen, Neutrophilen und Monozyten. Unsere Co-Kulturexperimente von hHSZs mit CD38+-Zellen und die Bildgebung des menschlichen Knochenmarks deuten darauf hin, dass CD38 die Ruhe von hHSZs fördert, wenn auch indirekt auf parakrine Weise. Außerdem exprimieren mehrere hämatologische Malignome (z. B. multiples Myelom, chronische lymphatische Leukämie, akute myeloische Leukämie) CD38 in hohem Maße. Wir stellen die Hypothese auf, dass die Mikroumgebung des Tumors, die mit den Produkten der ektoenzymatischen Aktivität von CD38 angereichert ist, den Zellzyklus gesunder hHSZs unterdrücken kann, was zu krebsbedingter Panzytopenie führt. Daher könnte die Hemmung der CD38-vermittelten cADPR-Produktion die gesunde Hämatopoese bei Patienten mit hämatologischen Malignomen unterstützen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CD38/Ca2+ und c-Fos zwar bereits einzeln für die Proliferation in anderen Zelltypen verantwortlich gemacht wurden, unsere Studie jedoch zum ersten Mal ihre Rolle bei der Förderung der HSZ-Ruhe in Zusammenarbeit mit den bekannten Mediatoren der HSZ-Ruhe Smad2/3 und p57Kip2 aufzeigt. Wir haben also die Teile des Puzzles zusammengefügt und den neuartigen, von der enzymatischen Aktivität von CD38 gesteuerten Signalweg entdeckt, der die HSZ-Ruhephase kontrolliert. Die Manipulation dieser Achse kann möglicherweise eine effiziente rHSZ-Reaktion auf hämatopoetischen Stress stimulieren.

Η ακτινοθεραπεία αποτελεί μέρος της θεραπείας πολλών αιματολογικών κακοηθών νοσημάτων επηρεάζοντας τον αριθμό και την λειτουργικότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων CD34+ Το DNA των κυττάρων αποτελεί το βασικότερο και ίσως καλύτερα μελετημένο μόριο-στόχο της ακτινοβολίας. Ο μηχανισμός που προκαλεί βλάβη στο DNA είναι άμεσος αλλά και έμμεσος. Η άμεση επίδραση και βλάβη της ακτινοβολίας στο DNA αφορά στην απευθείας δράση της στο μόριο του DNA που είναι δυνατόν να οδηγήσει σε αντικατάσταση ή απώλειας μιας βάσης, αλλαγές στην τεταρτοταγή δομή του DNA και κατά συνέπεια στις αλληλεπιδράσεις του με άλλα μόρια του κυττάρου (cross links), σπασίματα της διπλής έλικας DSB (Double Strand Breaks) ή της μίας μόνο εκ των δύο αλυσίδων SSB (Single Strand Breaks), σημειακές μεταλλάξεις ή απώλεια τμήματος των χρωμοσωμάτων. Ο έμμεσος μηχανισμός δράσης της ακτινοβολίας στο DNA αφορά την δημιουργία ελευθέρων ριζών από την αλληλεπίδραση της ακτινοβολίας με τα μόρια του νερού, ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια από τη μία αλλά και από την απευθείας βλάβη του μιτοχονδρίου που αποτελεί κύρια ενδοκυττάρια πηγή ελευθέρων ριζών. Οι παραγόμενες ελεύθερες ρίζες με τη σειρά τους προκαλούν απευθείας βλάβη στο μόριο του DNA, με αποτέλεσμα την πυροδότηση ενός φαυλού κύκλου ενδοκυττάριας παραγωγής ελευθέρων ριζών και πρόκλησης βλαβών στο μόριο του DNA. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της δράσης χαμηλών και υψηλότερων δόσεων ακτινοβολίας (1, 2 και 5Gy) σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ προερχόμενα από αίμα ομφαλίου λώρου φυσιολογικών νεογνών, και ο πιθανός προστατευτικός μηχανισμός που ενεργοποιείται από την παρουσία του ινσουλινικού αυξητικού παράγοντα IGF-1. Η προκαλούμενη από την ακτινοβολία ενδοκυττάρια παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου μελετήθηκε παρουσία ή απουσία του IGF-1, 30 λεπτά και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με χρήση κυτταρομετρίας ροής. Η έκφραση του αντιοξειδωτικού ενζύμου MnSOD εκτιμήθηκε ποσοτικά με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης και ποιοτικά μέσω ανοσοφθορισμού. Η προκαλούμενη από την ακτινοβολία απόπτωση και η δράση του υπό μελέτη αυξητικού παράγοντα εκτιμήθηκε με τις ακόλουθες τεχνικές: • Διπλή χρώση των κυττάρων με Αννεξίνη και Ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής • Ανάλυση DNA σε γέλη αγαρόζης • Εκτίμηση σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης του λόγου των μορίων BCL-2 και BAX • Εκτίμηση της έκφρασης του μορίου κασπάση -9, με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού Εκτιμήθηκε επίσης ο πολλαπλασιασμός και η κλωνογόνος ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η ενδοκυττάρια παραγωγή της ρίζας του υπεροξειδίου παρουσίασε αύξηση 30 λεπτά και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση, και η παρουσία του IGF-1 ανέτρεψε το φαινόμενο αυτό, μειώνοντας και επιστρέφοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδα του ανιόντος του υπεροξειδίου στα επίπεδα του δείγματος ελέγχου. Αμέσως μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων τα ενδοκυττάρια επίπεδα του υπεροξειδίου του υδρογόνου ανευρέθηκαν υψηλά σε σύγκριση με τα αυθόρμητα ενδογενή επίπεδα μη ακτινοβολημένων κυττάρων για όλες τις δόσεις ακτινοβολίας, όμως στον όψιμο χρόνο μελέτης, των 24 ωρών, παρέμειναν σχεδόν σταθερά, παρουσιάζοντας τάση μείωσης, χωρίς όμως να σημειώνονται στατιστικά σημαντικές διαφορές. Είκοσι τέσσερεις ώρες μετά την ακτινοβόληση τα επίπεδα του αντιοξειδωτικού ενζύμου MnSOD αυξήθηκαν, και η παρουσία του IGF-1 οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση της έκφρασης του. Ο IGF-1 ανέστειλε την ενεργοποίηση του μιτοχονδριακού μηχανισμού απόπτωσης ρυθμίζοντας σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο την έκφραση των BCL-2, ΒΑΧ και του λόγου BCL-2/BAX, και μειώνοντας την έκφραση του προαποπτωτικού μορίου κασπάση-9. Θετική ήταν και η δράση του IGF-1 στον πολλαπλασιασμό και στην ικανότητα αποδοτικής αιμοποίησης των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, ενισχύοντας την ικανότητα πολλαπλασιασμού των ακτινοβολημένων κυττάρων αλλά και την κλωνογόνο ικανότητα τους ως προς τον σχηματισμό BFU-e και CFU-GM αποικιών. Συνοψίζοντας, μπορούμε να υποστηρίξουμε ότι ο IGF-1 συμμετέχει στη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης του ενδοκυττάριου περιβάλλοντος των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων μειώνοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδα των παραγόμενων ενεργών μορφών οξυγόνου. Μέσω θετικής ρύθμισης του αντιοξειδωτικού μηχανισμού MNSOD και συμμετέχοντας προστατευτικά στο μιτοχονδριακό καταρράκτη της απόπτωσης οδηγεί σε προστασία των ακτινοβολημένων αιμοποιητικών κυττάρων επιτρέποντας τους να διατηρήσουν την λειτουργικότητα τους και την ικανότητα αιμοποίησης. / Radiation exerts direct as well as indirect effects on DNA through the generation of reactive oxygen species (ROS). Irradiated hematopoietic progenitor cells (HPCs) experience DNA strand breaks, favoring genetic instability, due to ROS generation. Our aim was to study the effect of a range of radiation doses in HPCs and the possible protective mechanisms activated by insulin-like growth factor-1 (IGF-1). ROS generation was evaluated, in the presence or absence of IGF-1 in liquid cultures of human HPCs-CD34+ irradiated with 1-, 2- and 5-Gy X-rays, using a flow cytometry assay. Manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression was studied by western blot analysis and visualized by an immunofluorescence assay. Apoptosis was estimated using the following assays: Annexin-V assay, DNA degradation assay, BCL-2/BAX mRNA and protein levels and caspase-9 protein immunofluorescence visualization. Viability and clonogenic potential were studied in irradiated HPCs. The generation of superoxide anion radicals at an early and a late time point was increased. This linear increase was reversed by the IGF-1 presence, restoring O.- generation at the levels of the innate production as manifested in control non irradiated samples. The hydrogen peroxide generation was increased at early time point but at late time point was stable. IGF-1 presence further enhanced the radiation-induced increase of MnSOD at 24 h post irradiation. IGF 1 inhibited the mitochondria- mediated pathway of apoptosis by regulating the m-RNA and protein expression of BAX, BCL-2 and the BCL-2/BAX ratio and by decreasing caspase-9 protein expression. IGF-1 presence in culture media of irradiated cells restored the clonogenic capacity and the viability of HPCs as well. In conclusion, our data support that IGF-1 anticipates oxidative microenvironment of HPCs by reducing the oxidative stress in intracellular environment due to a range of doses of radiation. IGF-1 succeeds to eliminate free radicals by favoring scavenger’s mechanisms and by regulating elements responsible for the mitochondrial pathway of apoptosis, allowing the sustained clonogenic capacity of hematopoietic progenitor cells.

No description available.