Chez les humains, un large pourcentage de leucémies myéloïdes et lymphoïdes exprime des gènes Homéobox (Hox) de façon aberrante, principalement ceux du groupe des gènes Hoxa. Cette dérégulation de l’expression des gènes Hox peut provenir directement des translocations impliquant des gènes Hox ou indirectement par d’autres protéines ayant un potentiel oncogénique. De plus, plusieurs études indiquent que les gènes Hox jouent un rôle essentiel dans l'initiation de diverses leucémies. Comprendre le fonctionnement des gènes Hox dans l'hématopoïèse normale est donc une condition préalable pour élucider leurs fonctions dans les leucémies, ce qui pourrait éventuellement conduire à l’élaboration de nouveaux traitements contre cette maladie. Plusieurs études ont tenté d’élucider les rôles exacts des gènes Hox dans l'hématopoïèse via l’utilisation de souris mutantes pour un seul gène Hox. Or, en raison du phénomène de redondance fonctionnelle chez cette famille de gènes, ces études ont été peu concluantes. Il a été précédemment démontré que dans une population de cellules enrichies en cellules souches hématopoïétiques (CSH), les gènes du cluster Hoxa sont plus exprimés que les gènes Hox des autres clusters. Aussi, il a été établi que les gènes du cluster Hoxb sont non essentiels à l’hématopoïèse définitive puisque les CSH mutantes pour les gènes Hoxb1-9 conservent leur potentiel de reconstitution à long terme. En nous basant sur ces données, nous avons émis l'hypothèse suivante : les gènes Hoxa sont essentiels pour l'hématopoïèse normale adulte. Pour tester notre hypothèse, nous avons choisi d’utiliser un modèle de souris comportant une délétion pour l’ensemble des gènes Hoxa. Dans le cadre de cette recherche, nous avons démontré que les CSH, les progéniteurs primitifs et les progéniteurs des cellules B sont particulièrement sensibles au niveau d'expression des gènes Hoxa. Plus particulièrement, une baisse de la survie et une différenciation prématurée semblent être à l’origine de la perte des CSH Hoxa-/- dans la moelle osseuse. L’analyse du profil transcriptionnel des CSH par séquençage de l'ARN a révélé que les gènes Hoxa sont capables de réguler un vaste réseau de gènes impliqués dans divers processus biologiques. En effet, les gènes Hoxa régulent l’expression de plusieurs gènes codant pour des récepteurs de cytokine. De plus, les gènes Hoxa influencent l’expression de gènes jouant une fonction dans l’architecture de la niche hématopoïétique. L’expression de plusieurs molécules d’adhésion est aussi modulée par les gènes Hoxa, ce qui peut affecter la relation des CSH avec la niche hématopoïétique. L’ensemble de ces résultats démontre que les gènes Hoxa sont d'importants régulateurs de l'hématopoïèse adulte puisqu’ils sont nécessaires au maintien des CSH et des progéniteurs grâce à leurs effets sur plusieurs processus biologiques comme l'apoptose, le cycle cellulaire et les interactions avec la niche. / In humans, a large percentage of myeloid and lymphoid leukemias exhibit aberrant Homeobox (Hox) genes expression, predominantly Hoxa genes. This aberrant expression is known to be caused by either translocations involving Hox genes or indirect activation of Hox genes. In addition, evidence now indicates a critical role for Hox genes in the initiation of leukemias. Clearly, understanding how Hox genes function in normal hematopoiesis is prerequisite to elucidate their involvement in leukemogenesis and this may eventually lead to new treatments for this disease. Attempts to determine the precise role(s) of Hox genes in normal hematopoiesis using single gene loss of function mutants have shown little success due to functional complementation by the remaining Hox genes. We previously showed that the Hoxa genes are much higher expressed in enriched hematopoietic stem cell (HSC) populations than the other members of the Hox gene family. Moreover, Hoxb cluster genes were found to be dispensable for HSCs long-term repopulation of irradiated mice. Thus, we hypothesize that Hoxa genes are critical for normal adult hematopoiesis. We have used a multi-gene knockout (KO for the entire Hoxa cluster) approach to thoroughly evaluate this issue. In this thesis, we showed that HSC, primitive progenitors and B cell progenitors are particularly sensitive to the levels of Hoxa gene expression. Furthermore, a lower survival and a premature differentiation account for the loss HSC Hoxa-/- in bone marrow. Differential expression profiling by RNASeq revealed that Hoxa genes are capable of regulating a broad array of genes involved in various biological processes. Indeed, Hoxa genes regulate the expression of several genes coding for cytokine receptors. Furthermore, Hoxa genes modulate the expression of genes implicated in the regulation and formation of the niche architecture. The expression of several adhesion molecules is also modulated by the Hoxa genes, which can affect the relationship of HSC with the hematopoietic niche. Through their action on several biological processes such as apoptosis, cell cycle and niche interactions, Hoxa genes are necessary for maintenance of HSC and progenitors. Taken together, these results demonstrate that Hoxa genes are important regulators of adult hematopoiesis.

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique. / Ex vivo hematopoietic stem cell expansion represents a most appealing option to improve bone marrow transplantation. Utilization of the unique hematopoietic stem cell (HSC) expansion abilities of the transcription factor HOXB4 for clinical applications is hampered by its short intracellular half-life. To overcome this difficulty, 3 different single amino-acid substitution mutants of HOXB4 with 3-4 fold increased half-life were generated and their biologic activity compared to that of wild type (wt) HOXB4 using in vitro and in vivo assays. We have shown that overexpression of mutated HOXB4 in HSC using an infection strategy did not impair their long term hematopoietic reconstitution potential in transplanted mice. We have found that cells overexpressing mutant HOXB4 had greater expansion in vitro in competitive and non-competitive designs than wt HOXB4. Moreover, in vivo peripheral blood and spleen repopulation had lymphoid and myeloid contributions closer to untransplanted animals with mutant than wt HOXB4. In addition, cells overexpressing mutant HOXB4 protein were detected much more rapidly and in greater proportion in peripheral blood than cells overexpressing the wt form. One of the mutated HOXB4 proteins (1426) did not promote the expansion of common myeloid progenitors in comparison to wt HOXB4. Finally, using intracellular protein modulation studies, we have shown that the effects of mutated and wt HOXB4 proteins in hematopoietic stem and progenitor cells were not completely due to a HOXB4 concentration effect.

Il est documenté que les enfants poursuivant une greffe de cellules souches hématopoïétiques présentent une altération du zinc plasmatique potentiellement défavorable à leur état clinique puisque ce minéral est impliqué dans l’hématopoïèse, la défense immunitaire, l’intégrité de la muqueuse digestive et la croissance. Ainsi, une carence en zinc pourrait affecter la reprise de l’hématopoïèse, la vulnérabilité aux infections, les diarrhées, les complications inflammatoires et la croissance de ces enfants. Actuellement, le zinc n’est pratiquement jamais dosé chez la clientèle pédiatrique du CHU Ste-Justine. Cette étude a documenté prospectivement le statut nutritionnel en zinc chez 21 sujets admis pour une GCSH dans ce centre. Sept différents moments ont été déterminés afin de suivre la tendance évolutive des taux plasmatiques de zinc et des paramètres d’intérêt (anthropométrie, biochimie et complications de la greffe) en fonction de la récupération fonctionnelle de la moelle osseuse. Au total, 43% des enfants ont présenté des taux de zinc plasmatique cliniquement associés à une carence (<9,9 μmol/L) à un moment ou l’autre de la période d’observation. Cependant, aucun moment n’a été identifié comme plus propice à cet avènement. L’altération du taux de zinc survient peu importe l’âge, le sexe, le type de greffe, le diagnostic ou la présence d’un soutien nutritionnel. Les apports habituels en zinc n’expliquent pas le statut déficient observé et l’usage d’une alimentation parentérale ne prévient pas l’occurrence de ce problème. Le statut nutritionnel précaire à l’admission pourrait servir à identifier les patients à risque d’une altération du statut en zinc car ceux-ci ont montré un plus faible poids pour l’âge (<25e percentile). De plus, des corrélations positives entre la préalbumine et les taux plasmatiques de zinc ont été identifiées. Cliniquement, un statut altéré en ce minéral a occasionné de plus longs et importants épisodes de diarrhées, une mucosite et une neutropénie prolongée, mais ces données ne diffèrent pas significativement de celles recueillies auprès de patients ayant présenté un statut normal en zinc. Cette étude permettra d’accorder une importance particulière à la surveillance du statut en zinc lors de la GCSH étant donné l’altération transitoire observée chez plusieurs individus et l’apparente augmentation des complications post-greffe associées à un tel état. Puisque l’influence des apports habituels en zinc ne suffit pas pour expliquer ce phénomène, davantage d’études sont nécessaires. / It has been previously documented that plasma zinc levels are lower in children who underwent a hematopoietic stem cell transplant (HSCT). Given the role of zinc in hematopoiesis, immune defense, intestinal integrity and growth, it is likely that zinc deficiency may negatively affect patient outcomes by influencing hematopoiesis recovery, vulnerability to infections, occurrence of diarrhea, inflammatory complications and growth. To date, monitoring of this trace element is not routinely done in children undergoing HSCT at Ste-Justine Hospital. In this prospective study, we assessed plasma zinc levels and zinc intakes in 21 children at seven different time points before and after HSCT. In addition, anthropometric and biochemistry parameters as well as complications were collected at the same time points. Our results showed a prevalence of zinc deficiency (<9.9 μmol/L) of 43%, however no specific time was associated with the occurrence of this deficiency. Gender, age, graft type, primary diagnosis and the use of a nutritional support did not significantly affect the prevalence of this deficiency state. Usual zinc intakes could not explain this impairment while the use of parenteral nutrition did not prevent its occurrence. A poor nutritional status at admission, defined by a low weight-for-age (<25th percentile), could help identifying high-risk patients. This association is strengthened by the positive correlation found between prealbumin and plasma zinc levels. Although an altered zinc status resulted in a longer duration of diarrhea and more stools per day as well as an extended period of mucositis and neutropenia, no significant difference was seen between patients with a normal and an impaired zinc status with regard to these outcomes. This study suggests the relevance of monitoring zinc nutritional status during HCST given the significant proportion of patients with impaired zinc status and the apparent increase in post-HCST complications seen in those patients. Since usual zinc intakes do not explain the alteration of zinc status of our study population, further studies are needed.

Les cellules sanguines proviennent d’une cellule souche hématopoïétique (CSE), présente dans la moelle osseuse chez l’homme adulte, qui nécessite d’être en contact étroit avec une zone particulière du microenvironnement médullaire (appelée niche hématopoïétique) pour sa différenciation et son autorenouvellement. La nature exacte des cellules qui composent cette niche (appelée cellules stromales) n’est pas encore bien connue, en particulier concernant sa relation avec les cellules souches mésenchymateuses (CSM). Le but de cette thèse a été d’étudier le rôle des CSM dans la régulation de l’hématopoïèse en fonction de leur type et leur stade de différenciation mésenchymateuse et d’évaluer leur rôle dans la migration des progéniteurs hématopoïétique (PH). Nous montrons que les CSM non différenciées possèdent la capacité de soutien de l’hématopoïèse primitive la plus importante (par culture à long terme pendant 5 semaines) et que cette capacité est rapidement perdue dès 3 jours de différenciation adipogénique, otéogénique et vasculaire musculaire lisse. Par ailleurs, nous montrons que le G-CSP agit directement sur les CSM pour augmenter la migration des CSH/PH hors de la niche (par un test de migration trans-stromale) via un mécanisme MMP-2 dépendant. / Blood cells arise from a hematopoietic stem cell (HSC), present into bone marrow (3M) in adult humans, which needs close contacts with a special zone of 3M micro environment (named hematopoietic niche) for its differentiation and self’-renewal. The precise nature of the niche-forming cells (named stromale cells) are not yet well known, particularly in their relationship with mesenchymal stem cells (MSCs). The aim of the study was to investigate further the role of the MSCs in the hematopoiesis control according to their differentiation pathway and state and to evaluate their role in the migration process of hematopoietic progenitor cells (HPÇ,[ We show that non-differentiated MSCs display the best hematopoietic supporting activity (using 5-week long term cultures) that is completely lost after in vitro differentiation into adipocytes, osteoblasts and vascular smooth muscle cells. In addition, we show that G-CSP stimulation of 3M MSCs promotes HSC/HPC migration (using trans-stromal migration assay) via a MMP-2-dependent mechanism.

Immune cell niches are microenvironments that support the survival of specific hematopoietic cells. The size of a given niche is dependent on survival and proliferation signals provided. Modulation of niche size can be a useful therapeutic tool, and a better understanding of the factors that control the size of immune cell niches can lead to more targeted therapies. Here bone marrow and thymic niches were modulated with tyrosine kinase inhibition to achieve increased engraftment following stem cell transplantation (SCT). SCT resulting in mixed chimerism is curative for several benign blood diseases, but toxicities associated with myeloablative and cytotoxic conditioning regimens limit the application of SCT. Sunitinib inhibits multiple tyrosine kinases including KIT, an essential survival signal within the hematopoietic stem cell and thymic progenitor niches. Sunitinib therapy diminishes hematopoietic and thymic progenitor cells in mice and enhances accessibility of marrow and thymic niches to transplanted bone marrow. This provides a novel, non-cytotoxic approach to accomplish mixed hematopoietic chimerism. The observation that T cells undergo increased proliferation and accumulate in IL-7R deficient mice compared to other lymphopenic hosts raised questions about the factors that control the size of the T cell niche. Understanding these factors is useful in designing therapeutics to increase T cell responses for treatment of many diseases including cancer. Dendritic cells (DCs) are well known for their ability to modulate T cell responses; however, very little is known about the role of IL-7R signaling on DCs. The data presented here show that bone marrow derived DCs treated with IL-7 were less able to induce T cell proliferation in coculture. In vivo systems using CD11cDTR mice showed a role for IL-7 signaling on CD11c+ cells in T cell homeostasis. Together these data suggest that IL-7R signaling on DCs is important for regulating the size of the T cell niche.

L’infection primaire au VZV et la réactivation du VZV latent sont fréquemment observées à la suite d’une GMO ou d’une GSCO, ce qui cause de sérieuses complications chez le patient. Pour prévenir ces infections, une prophylaxie antivirale est administrée systématiquement chez tous les greffés de MO ou de SCO, alors qu’il n’existe aucun consensus sur la durée optimale d’une telle prophylaxie. Pour résoudre ce problème, notre objectif est de développer et valider une méthode ELISpot-VZV-IFN- qui permettra de suivre la reconstitution de l’immunité à médiation cellulaire anti-VZV chez les receveurs de GMO ou de GSCO et ainsi déterminer le moment opportun pour réduire ou interrompe la prophylaxie chez les receveurs de greffes de CSH. Dans un premier temps, des valeurs-seuil de la réponse à médiation cellulaire anti-VZV chez la population pédiatrique saine ont dû être générées. À la lumière de nos résultats, un enfant avec un résultat ELISpot-VZV-IFN- > 190.0 SFU/106 PBMC devrait être protégé contre une possible infection à VZV. Pour valider cette étude, une étude prospective de la reconstitution immunitaire anti-VZV a été effectuée chez 9 enfants greffés de MO ou de SCO. Nos résultats préliminaires ont montré qu’il n’y avait eu aucune reconstitution significative de l’immunité à médiation cellulaire anti-VZV dans les 18 premiers mois post-transplantation chez 8 de ces 9 enfants. Les résultats de ces expériences vont fournir d’importantes informations quant à la reconstitution de l’immunité anti-VZV à la suite d’une GMO ou d’une GSCO et pourraient permettre l’amélioration des soins apportés aux receveurs de GMO ou de GSCO. / Primary infection with VZV and reactivation of latent VZV are commonly observed following BMT and UCBT, leading to serious complications in patients. As a result, antiviral prophylaxis is systematically administered to BMT and UCBT recipients, yet there is no consensus that defines its optimal duration. To resolve this problem, our objective was to develop and validate a VZV-IFN--ELISpot with which reconstitution of VZV immunity can be followed in BMT and UCBT recipients, providing clinicians a practical tool to gauge the need for and adjust antiviral prophylaxis in individual HSCT recipients. First of all, threshold values for anti-VZV immunity in healthy pediatric subjects were generated. Based on our results, a child exhibiting > 190.0 VZV-specific SFU /106 PBMC should be protected against a possible VZV infection. To validate these results, a prospective study on the recovery of VZV-specific T cell immunity was performed on 9 children following BMT or UCBT. Preliminary results demonstrated that there was no significant recovery of VZV-specific T cell immunity in the first 18 months post-transplantation in 8 of 9 cases. Results of these experiments will yield important new information regarding reconstitution of anti-VZV immunity following BMT and UCBT and could lead to improvements in clinical management of BMT and UCBT recipients.

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération du tissu hématopoïétique. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent encore inconnus, ce qui limite le développement de nouvelles approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle murin de prise de greffe, nos résultats démontrent que l’endommagement du microenvironnement par l’irradiation a un impact limitant sur le nichage hématopoïétique. Parce que le microenvironnement est composé principalement de cellules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (CSM), nous avons évalué le potentiel des CSM à régénérer le tissu hématopoïétique par la reconstitution de la niche osseuse. Cette thérapie a mené à une augmentation remarquable du nichage hématopoïétique chez les souris irradiées. Les causes moléculaires impliquées dans le nichage hématopoïétiques sont encore inconnues, mais nous avons remarqué l’augmentation de la sécrétion de la cytokine « granulocyte-colony stimulating factor » (G-CSF) dans l’espace médullaire suite à l’irradiation. Le G-CSF est impliqué dans la mobilisation cellulaire et est fort possiblement nuisible à une prise de greffe. Nous avons évalué le potentiel d’une thérapie à base de CSM sécrétant le récepteur soluble du G-CSF afin de séquestrer le G-CSF transitoirement et les résultats obtenus démontrent que le blocage du G-CSF favorise le nichage hématopoïétique. Globalement, les données présentées dans ce mémoire démontrent que le microenvironnement osseux et le niveau de G-CSF dans la moelle sont importants dans le processus de nichage hématopoïétique et que la baisse du potentiel de régénération du tissu hématopoïétique suite à l’irradiation peut être renversée à l’aide d’une thérapie cellulaire de CSM génétiquement modifiées ou non. / Cancer treatment using ionizing radiation may lead to significant side effects, including delayed hematopoietic tissue repair and regeneration. The mechanisms mediating these defects remain unknown, thus limiting the development of new therapeutic approaches. Using a mouse engraftment model, our results show that microenvironment damage by irradiation limits hematopoietic homing. Since the microenvironment is mainly composed of mesenchymal stem cells (MSCs)-derived cells, we evaluated the potential of MSCs to improve hematopoietic tissue regeneration by bone marrow niche reconstitution. This therapy led to remarkable enhancement of hematopoietic homing in irradiated mice. The molecular causes involved in hematopoietic homing remain unknown, but we noticed an increased in “granulocyte-colony stimulating factor” (G-CSF) secretion within the medullary space after irradiation. G-CSF is involved in cellular mobilization and may possibly be harmful to engraftment. We evaluated the therapeutical potential of MSC genetically-engineered to secrete a soluble G-CSF decoy receptor that would transiently sequester G-CSF. Results obtained show that G-CSF blocking improved hematopoietic homing. Overall, the findings presented in this thesis indicate that bone marrow microenvironment and G-CSF levels are important in hematopoietic homing process, and that the decline in hematopoietic tissue regeneration potential following irradiation can be reversed by cellular therapy using MSC genetically modified or not.

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration. / Post-transcriptional modifications of pre-mRNA by alternative splicing are important for cellular function, development and immunity. New evidence reveals that alternative splicing is implicated in the regulation of maturation and activation of hematopoietic cells. HnRNP L has been identified as the main regulator of alternative splicing of CD45 in vitro. The receptor tyrosine phosphatase CD45, which is expressed on all hematopoietic cells, is known for its role in the development and activation of T cells. First, we have investigated the function of hnRNP L in T cell development and CD45 pre-mRNA splicing in vivo using T cell specific deletion of hnRNP L in mice. The hnRNP L deletion results in aberrant expression of CD45 isoforms, predominantly CD45RA, which is usually absent from the thymus. Ablation of hnRNP L results in a partial block in pre-T cell development at the DN4 stage. This reduction in thymic cellularity is not due to an increase in cell death. In fact, hnRNP L deficient thymocytes demonstrate accelerated proliferation compared to wild-type cells due principally to a hyper-activation of the kinases Lck, Erk1/2 and Akt. Moreover, hnRNP L deletion results in a loss of peripheral T cells. In vitro studies suggest that this loss of peripheral cells is caused by a defect in response to chemokine signals. Since CD45 pre-mRNA splicing cannot explain this phenotype, the identification of hnRNP L targets by RNA-Seq has shown that hnRNP L plays a role in the regulation of alternative splicing of factors involved in actin polymerization. Secondly, we studied the role of hnRNP L in hematopoiesis using knockout mice in which hnRNP L is conditionally deleted specifically in fetal liver and bone marrow hematopoietic cells. Ablation of hnRNP L reduces the number of cell lineage committed progenitors including the common lymphoid progenitors (CLPs), common myeloid and granulocyte progenitors (CMPs, GMPs) and the megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs) as well as the mature hematopoietic cells. In contrast to multipotent progenitors (MPPs) that are affected by the absence of hnRNP L, the hematopoietic stem cell (HSC) population is not reduced. In fact, HSCs from hnRNP L deleted mice demonstrate increased cell cycling. However, hnRNP L deficient HSCs express high levels of Annexin V and CD95, which suggests an increased cell death. As for the thymus, a RNA-Seq analysis of fetal livers revealed different targets of hnRNP L among gene categories related to cell death, DNA damage responses and cell adhesion that may explain the phenotype observed in the hnRNP L deficient HSCs. These results suggest that hnRNP L and alternative splicing are essential for the survival and maintenance of the differentiation potential of HSCs. HnRNP L is also crucial for the development of T cells by regulating both their migration and the splicing of CD45.

Les cellules T mémoires (Tm) protègent l’organisme contre les réinfections de pathogènes qu’il a déjà combattu. Les Tm possèdent plusieurs propriétés en commun avec les cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment la capacité de se différencier, de s’auto-renouveler et de maintenir une population relativement constante au sein de l’organisme via des mécanismes homéostatiques. Il a été démontré que Hoxb4, un membre de la famille des facteurs de transcription Hox, était capable d’induire l’expansion des CSH in vivo et in vitro de façon rapide. Au vu de ces parallèles, nous avons posé l’hypothèse que la surexpression de Hoxb4 pourrait induire l’expansion de populations de Tm. Nous avons analysé les populations de Tm et lymphocytes T naïfs (Tn) dans les organes lymphoïdes de souris transgéniques surexprimant Hoxb4 et les avons comparées à des souris de type sauvage (wt). Alors que la fréquence des cellules T matures Hoxb4 diminuait avec l’âge, leur phénotype ainsi que leur viabilité demeuraient inchangés. Ensuite, nous avons procédé à des transplantations en compétition de Tm (CD4+CD44hi) Hoxb4 et wt chez des hôtes dépourvus de lymphocytes T (CD3-/-) dans le but d’évaluer leur contribution à la reconstitution du compartiment T après 2 mois. Au final, les Tm wt avait contribué un peu plus que les Tm Hoxb4 à la reconstitution (~60%). Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont montré que les Tm Hoxb4 possédaient une fonctionnalité normale, mais se distinguaient des Tm wt par la présence d’une faible population qui présentait un phénotype « mémoire central » (Tcm), conférant habituellement une longévité accrue. Les cellules des ganglions lymphatiques totaux des hôtes furent transplantées de façon sérielle chez trois générations de nouveaux hôtes. Le phénotype Tcm observés chez les Tm Hoxb4 était récapitulé chez les hôtes secondaires uniquement. Les ratios sont demeurés en faveur des Tm wt lors des deux transplantations suivantes, mais les Tm Hoxb4 ont commencé à montrer un avantage compétitif chez certains hôtes quaternaires. Une transplantation en compétition à court terme de Tm Hoxb4 et wt marqués avec un marqueur cytoplasmique ont démontré la présence chez les Tm Hoxb4 seulement d’une faible population CD62Lhi proliférant lentement. Ainsi, l’expansion préférentielle de Tcm CD4 par le biais d’une sélection ou d’une différenciation induite par la surexpression de Hoxb4 pourrait potentiellement leur permettre de maintenir un état de quiescence leur permettant de persister plus longtemps suite à des transplantations sérielles. / Memory T cells (Tm) protect the organism against reinfection from pathogens they’ve already encountered. Tm share characteristics with hematopoietic stem cells (HSC), such as the capacity to differentiate, self-renew and maintain a relatively constant population via homeostatic mechanisms. Hoxb4, a member of the Hox genes family of transcription factors, has been shown to expand HSCs rapidly in vivo and in vitro. Thus, drawing from these parallels we hypothesise that Hoxb4 overexpression could lead to expansion of Tm populations. Tm and naïve T cell (Tn) populations were analysed in the lymphoid organs of young and aged transgenic mice overexpressing Hoxb4 in comparison with wild type (wt) mice. While the frequencies of mature Hoxb4 T cells in lymphoid organs seemed to decline with age, the phenotype or the cell viability remained unaffected. Next, CD4+CD44hi Hoxb4 Tm were transferred into T cell deficient (CD3-/-) hosts in competition with wt CD4+CD44hi Tm and evaluated for their contribution to T cell reconstitution after 2 months. Engraftment of wt Tm in secondary lymphoid organs was slightly higher than Hoxb4 Tm (~60%). Functional assays and phenotypic analysis showed that Hoxb4 Tm exhibited normal functionality, but in contrast to wt Tm, a fraction of Hoxb4 Tm exhibited a more central memory (Tcm) phenotype, indicative of a longer lifespan. Total lymph nodes from hosts were serially re-transplanted for three generations. The Tcm phenotype of the Hoxb4 Tm present in the primary hosts was recapitulated in the secondary but not in the tertiary hosts. The ratios remained in favor of the wt Tm after two subsequent expansion rounds, but Hoxb4 Tm showed a competitive advantage over wt Tm in some quaternary hosts. Cell tracking of a short term transplantation of Hoxb4 and wt Tm in competition exposed a small population of CD62Lhi cells displaying slow proliferation in the Hoxb4 Tm only. Thus preferential CD4+ Tcm expansion by selection or differentiation could potentially allow Hoxb4 Tm to persist longer following serial transplantations due to a more quiescent state.

Le busulfan (Bu) est un composé clé de la phase de conditionnement chez les enfants subissant une transplantation des cellules souches hématopoïétiques (TCSH). Les différences inter-individuelles de la pharmacocinétique (PK) du Bu pourraient affecter son efficacité et sa toxicité. Le Bu est principalement métabolisé par la glutathion-S-transférase (GST). Nous avons étudié la relation des génotypes GSTA1, GSTM1 et GSTP1 avec la PK de la première dose de Bu et la relation avec les résultats de la TCSH chez 69 enfants recevant un régime de conditionnement myéloablatif. Le génotype GSTM1 nul a corrélé avec une exposition élevée du Bu et une faible clairance (CL) chez les patients âgés de 4 ans (p ≤ 0,04). Dans le respect du rôle fonctionnel suggéré d’haplotype GSTA1 *A2, il a été associé à des niveaux plus faibles de médicaments et des niveaux élevés de CL (p ≤ 0,03). L’effet Gène-dose a également été observé (p = ≤ 0,007). L’haplotype de GSTA1 était associé avec les résultats de la TCSH. Les porteurs de deux copies d’haplotype *A2 avaient une meilleure survie sans événement (p = 0,03). En revanche, les individus homozygotes pour haplotypes * B et *B1 ont un risque plus élevé d’atteindre la maladie veino-occlusive (MVO) (p = 0,009). Les individus porteurs de GSTM1 nul âgés de 4 ans possèdent un risque plus fréquent d’avoir la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (p = 0,03). En conclusion, nous avons montré que les variantes génétiques de GST influencent la PK du BU et les résultats de la TCSH chez les enfants. Pour l'ajustement de la posologie, un modèle avec l'inclusion des facteurs génétiques et non génétiques devrait être évalué et validé dans une étude prospective. / Busulfan (Bu) is a key compound of conditioning regimen in children undergoing hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Inter-individual differences in Bu pharmacokinetics might affect Bu efficacy and toxicity. Since Bu is mainly metabolized by glutathione S-transferase (GST), we investigated the relationship between GSTA1, GSTM1 and GSTP1 genotypes with first-dose Bu pharmacokinetics (PK), and relationship with HSCT outcomes in 69 children receiving myeloablative conditioning regimen. GSTM1 null genotype correlated with higher Bu exposure and lower clearance in patients older than 4 years (p≤0.04). In accordance with the suggested functional role GSTA1*A2 haplotype was associated with lower drug levels and higher drug clearance (p≤0.03). Gene-dosage effect was also observed (p=≤0.007). GSTA1 haplotypes were associated with HSCT outcomes Patients with two copies of haplotype *A2 had better event free survival (p=0.03). In contrast, homozygous individuals for haplotypes *B and *B1 had higher occurrence of veno-occlusive disease (p=0.009). GSTM1 null individuals older than 4 years had more frequently graft versus host disease (p=0.03). In conclusion, we showed that GST gene variants influence Bu PK and outcomes of HSCT in children. A model for the dosage adjustment with the inclusion of genetic and non-genetic factors should be evaluated in a future prospective validation cohort.