O nicho endosteal da medula óssea abriga as células-tronco hemopoéticas (CTH) em quiescência/autorrenovação. As CTH podem ser classificadas em dois grupos: células que reconstituem a hemopoese em longo prazo (LT-CTH) e curto prazo (CT-CTH). Investigamos, neste trabalho, os efeitos da desnutrição proteica (DP) no tecido ósseo e a participação do nicho endosteal na sinalização osteoblasto-CTH. Para tanto, utilizamos camundongos submetidos à DP induzida pelo consumo de ração hipoproteica. Os animais desnutridos apresentaram pancitopenia e diminuição nas concentrações de proteínas séricas e albumina. Quantificamos as CTH por citometria de fluxo e verificamos que os desnutridos apresentaram menor porcentagem de LT-CTH, CT-CTH e de progenitores multipotentes (PMP). Avaliamos a expressão das proteínas CD44, CXCR4, Tie-2 e Notch-1 nas LT-CTH. Observamos diminuição da expressão da proteína CD44 nos desnutridos. Isolamos as células LT-CTH por cell sorting e avaliamos a expressão gênica de CD44, CXCR4 e NOTCH-1. Verificamos que os desnutridos apresentaram menor expressão de CD44. Em relação ao ciclo celular, verificamos maior quantidade de LT-CTH nas fases G0/G1. Caracterizamos as alterações do tecido ósseo femoral, in vivo. Observamos diminuição da densidade mineral óssea e da densidade medular nos desnutridos. A desnutrição acarretou diminuição da área média das seções transversais, do perímetro do periósteo e do endósteo na cortical do fêmur dos animais. E na região trabecular, verificou-se diminuição da razão entre volume ósseo e volume da amostra e do número de trabéculas, aumento da distância entre as trabéculas e prevalência de trabéculas ósseas em formato cilíndrico. Avaliamos a expressão de colágeno, osteonectina (ON) e osteocalcina (OC) por imuno-histoquímica, e de osteopontina (OPN) por imunofluorescência no fêmur e verificamos diminuição da marcação para OPN, colágeno tipo I, OC e ON nos desnutridos. Evidenciamos, pela técnica do Picrosírius, desorganização na distribuição das fibras colágenas e presença de fibras tipo III nos fêmures dos desnutridos, além de maior número de osteoclastos evidenciados pela reação da fosfatase ácida tartarato resistente. Os osteoblastos da região femoral foram isolados por depleção imunomagnética, imunofenotipados por citometria de fluxo e cultivados em meio de indução osteogênica. Observamos menor positividade para fosfatase alcalina e vermelho de alizarina nas culturas dos osteoblastos dos desnutridos. Avaliamos, por Western Blotting, a expressão de colágeno tipo I, OPN, osterix, Runx2, RANKL e osteoprotegerina (OPG), e, por PCR em tempo real, a expressão de COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 e CDH2 nos osteoblastos isolados. Verificamos que a desnutrição acarretou diminuição da expressão proteica de osterix e OPG e menor expressão gênica de ANGPT1. Avaliamos a proliferação das células LSK (Lin-Sca1+c-Kit+) utilizando ensaio de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester). Foi realizada cocultura de células LSK e osteoblastos (MC3T3-E1) na presença e ausência de anti-CD44. Após uma semana, verificamos menor proliferação das LSK dos desnutridos. O bloqueio de CD44 das LSK do grupo controle diminuiu a proliferação destas em três gerações. Entretanto, nos desnutridos, esse bloqueio não afetou a proliferação. Concluímos que a DP promoveu alterações no tecido ósseo e nas CTH. Entretanto, não podemos afirmar que as alterações observadas no sistema hemopoético foram decorrentes de alterações exclusivas do nicho endosteal. / The bone marrow endosteal niche hosts hematopoietic stem cells (HSC) in quiescence/self-renewal. HSC can be classified into two groups: cells capable of renewing indefinitely (LT-HSC) or repopulating in the short term (ST-HSC). In this work, we investigated the effects of protein malnutrition (PM) on bone tissue and the involvement of the endosteal niche in osteoblast-CTH signaling. Therefore, we used mice subjected to PM induced by the consumption of hypoproteic feed. Malnourished animals presented pancytopenia and decreased concentration of serum protein and albumin. We quantified the HSC by flow cytometry and found that the malnourished ones had lower percentage of LT-HSC, ST-HSC and multipotent progenitors (MPP). We assessed the expression of the CD44, CXCR4, Tie-2 and Notch-1 proteins in LT-HSC. We observed decreased expression of CD44 protein with the malnourished ones. We isolated the LT-HSC cells by means of cell sorting and assessed the gene expression of CD44, CXCR4 and NOTCH-1. We found that malnutrition had lower expression of CD44. Regarding the cell cycle, we see greater amount of LT-HSC in the G0 and G1 phases. We characterized the changes of the femoral bone tissue in vivo. We observed a decrease in the bone mineral density and medullar density in malnourished animals. As for malnourished animals, the femoral cortical region showed a significant decrease in tissue area, periosteal and endosteal perimeter. The femoral trabecular region of malnourished animals showed decreased bone volume/tissue volume ratio, decreased trabecular number, increased trabecular separation and prevalence of rod-like trabeculae. We investigated the expression of collagen, osteonectin (ON) and osteocalcin (OC) by means of immunohistochemistry and the expression of osteopontin (OPN) by immunofluorescence and we found that malnourished animals showed decreased labeling for OPN, type I collagen, OC and ON in the cortical region of the femur. Picrosirius staining was used to analyze disorganization of collagen fibers and presence of type III fibers in the femurs of the malnourished. Cortical and trabecular regions of malnourished animals presented a higher number of osteoclasts as shown by tartrate-resistant acid phosphatase reaction. Moreover, osteoblasts were isolated from the femoral region by immunomagnetic depletion and immunophenotyped by flow cytometry and cultured in osteogenic induction medium. Results proved less positive for alkaline phosphatase and alizarin red in the cultures of osteoblasts of malnourished animals. We assessed, by means of Western blotting, type I collagen expression, OPN, osterix, Runx2, RANKL and osteoprotegerin (OPG) and, by real time PCR, the expression of COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 and CDH2 with the isolated osteoblasts. We found that malnutrition led to osterix and OPG decreased protein expression and lower ANGPT1 gene expression. We evaluated LSK cell (Lin-Sca1+c-Kit+) proliferation by CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester). LSK cells and osteoblasts (MC3T3-E1) cocultures were performed in the presence and absence of anti-CD44. After a week, we found lower proliferation of LSK in the malnourished. The LSK CD44 blocking in the control group decreased the proliferation of these three generations. However, as for the malnourished, such blockage did not affect proliferation. We concluded that the PM has promoted changes in bone tissue and the CTH. However, we can\'t claim that the alterations observed in hematopoietic system were due to endosteal niche-only changes.

A desnutrição pode induzir lesão celular, comprometendo os mecanismos envolvidos de proliferação, diferenciação e morte celular. Estudos de nosso laboratório tem demonstrado, em modelo murino de desnutrição protéica e protéico-energética, hipoplasia medular com evidências histológicas de alteração da matriz extra celular. Nosso objetivo foi avaliar a eventual participação dos processos de apoptose, necrose e autofagia no desenvolvimento da hipoplasia medular observada nesse modelo. Para isso foram utilizados dois grupos de camundongos C57BL/6J machos, adultos, mantidos em gaioleiros metabólicos. O grupo controle (C) recebeu ração normoproteíca contendo 12% de proteína e o grupo desnutrido (D), alimentado com ração hipoprotéica contendo 2% de proteína. A fonte protéica utilizada foi a caseína. O período de indução da desnutrição foi cerca de cinco semanas, definido pela perda de 20 a 25 % de peso corpóreo por parte dos animais do grupo desnutrido. Após esse período, os animais de ambos os grupos foram anestesiados e realizada a coleta das amostras biológicas para avaliação nutricional e hematológica e coletadas células da medula óssea para avaliação da apoptose, necrose e autofagia. Para avaliação da apoptose e necrose as células foram duplamente marcadas com Annexina V, PI e caspase 3 que foram analisadas por citometria de fluxo . A expressão da protéina BCL-2 foi quantificada pela técnica de Western Blotting. A análise não demonstrou diferença estatística entre os grupos para esses parâmetros. Para avaliação da autofagia extraiu-se proteínas das células da medula óssea e avaliou-se a expressão das proteínas Akt e mTOR total e fosforilado , os complexos de mTor (Raptor, Rictor e Gβl) , Beclin-1 e LC3II. Os resultados demonstraram aumento significativo de mTOR total ,Raptor , Beclin-1 e LC3II e diminuição na fosforilação de mTOR nas células oriundas de animais desnutridos em relação ao grupo controle. A desnutrição não modificou a expressão de Akt total, porém houve diminuição da fosforilação de Akt e diminuição na expressão das proteínas Rictor e Gβl nas células analisadas. Como os processos apoptóticos e autofágicos podem ser de difícil detecção in vivo, também refizemos os experimentos in vitro, estimulando as células com compostos pró-apoptóticos (campotecina) e pró-autofágicos (tamoxifeno). Nesses experimentos observamos que, apenas quando estimulamos as células de animais desnutridos com camptotecina, as mesmas, no período de 12 horas apresentaram maior percentagem de apoptose inicial em relação a 0 horas , sugerindo que há um período em que as células desnutridas são sinalizadas para via apoptótica sendo mais susceptível ao estimulo. As células de animal desnutrido estimulado apresentaram após 12 horas aumento significativo da apoptose tardia em relação ao controle estimulado , indicando que nesse período há um aumento da apoptose tanto em processo inicial , tanto em processo tardio. Avaliamos a autofagia em uma cinética de 0, 2, 6, 18 e 24 horas in vitro e observamos aumento significativo da autofagia em células da medula óssea de animais desnutridos em 0 horas e após 18 horas de estímulo com tamoxifeno (20 µM) em relação ao respectivo controle, demonstrando que nesse período a autofagia começa a ser induzida através do estimulo mais facilmente do que o controle. Autofagia é um dos principais contribuintes para o metabolismo celular, fornecendo nutrientes quando os mesmos estão indisponíveis, e, portanto, no nosso modelo de desnutrição protéica a hipoplasia medular estaria em processo autofágico como mecanismo de reparo e sobrevivência. / Malnutrition can induce cell damage, compromising the mechanisms involved in proliferation, differentiation and cell death. Studies from our laboratory have demonstrated, in a murine model of protein malnutrition and protein-energy, marrow hypoplasia with histologic evidence of alteration of the extracellular matrix. Our objective was to evaluate the possible involvement of the processes of apoptosis, necrosis and autophagy in the development of bone marrow hypoplasia observed in this model. For this we used two groups of C57BL/6J adult male kept in metabolic gaioleiro. The control group (C) received normal protein diet containing 12% protein and undernourished group (D), fed low protein diet containing 2% protein. The protein source used was casein. The induction period of undernutrition was approximately five weeks, as defined by loss of 20 to 25% of body weight per part of group malnourished. After this period, the animals of both groups were anesthetized and held the collection of biological samples for nutritional assessment and hematology and bone marrow cells collected for evaluation of apoptosis, necrosis and autophagy. For assessment of apoptosis and necrosis of the cells were double labeled with Annexina V and PI caspase 3 were analyzed by flow cytometry. The expression of Bcl-2 was quantified by Western Blotting technique. The analysis revealed no statistical difference between the groups for these parameters. For evaluation of autophagy proteins extracted from bone marrow cells and evaluated the expression of proteins Akt and phosphorylated and total mTOR, complexes of mTOR (Raptor, and Rictor Gβl), Beclin-1 and LC3II. The results showed significant increase in overall mTOR, Raptor, and LC3II Beclin-1 and decreased phosphorylation of mTOR in cells derived from malnourished animals compared to the control group. Malnutrition did not modify the expression of Akt total, but decreased phosphorylation of Akt and decreased expression of the protein Rictor and Gβl cells analyzed. As apoptotic and autophagic processes can be difficult to detect in vivo, also redid the experiments in vitro, stimulating the cells with pro-apoptotic compounds (campotecina) and pro-autophagic (tamoxifen). In these experiments we observed that, when only stimulate cells with camptothecin malnourished, the same at 12 hours had a higher percentage of initial apoptosis compared to 0 hours, suggesting that there is a period in which cells are signaled to via malnourished being more susceptible to apoptotic stimuli. The animals starved cells stimulated after 12 h showed significant increase in apoptosis compared to control late stimulated, indicating that at that time there is an increase in apoptosis both in the initial process, both late process. Autophagy evaluated in kinetics of 0, 2, 6, 18 and 24 hours in vitro and observed a significant increase in autophagy in bone marrow cells of malnourished at 0 hours and after 18 hours stimulation with tamoxifen (20 microM) than the respective control, demonstrating that this period autophagy begins to be induced by stimulating more easily than the control. Autophagy is a major contributor to cellular metabolism, providing nutrients when they are unavailable, and therefore in our model of protein malnutrition in the marrow hypoplasia would autophagic process as a mechanism for survival and repair.

A desnutrição proteica (DP) pode ocasionar alterações na matriz extracelular (MEC) de diferentes órgãos e tecidos, inclusive o hematopoético, com comprometimento funcional. Estudos do nosso laboratório demonstraram, em modelo murino de DP, aumento da expressão proteica de fibronectina (FN) no estroma medular ósseo in vivo, principalmente na região subendosteal (local de fixação da célula tronco progenitora hemopoética). Já in vitro, no estroma medular ósseo, observou-se tanto o aumento quanto a diminuição de FN e a presença de suas isoformas. Essas alterações de FN parecem estar envolvidas com a hipoplasia da medula óssea (MO) em camundongos desnutridos. As modificações quantitativas de FN podem ser devidas: (i) à ação das metaloproteinases de matriz (MMP) responsáveis pela degradação das proteínas da MEC; (ii) aos inibidores de metaloproteinases (TIMP) que regulam a degradação da MEC; (iii) às alterações transcricionais, reguladas pela via de AKT/mTOR, que controla os splicing alternativos na FN, resultando em isoformas dessa proteína; (iv) a processos pós-transcricionais modulados por LC3, que aumenta a tradução do RNAm de FN. Assim, o objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos que alteram o turnover de FN no estroma medular ósseo em modelo murino de DP. Utilizamos camundongos, C57BL/6J machos, adultos, separados em dois grupos: controle e desnutrido, alimentados, ad libitum, com ração contendo 12% e 2% de proteína, respectivamente. Após cinco semanas de indução à desnutrição os camundongos foram eutanasiados, e coletado o material biológico. Avaliamos: o estado nutricional, o hematológico, a histologia da MO femoral bem como a determinação imunohistoquímica da FN, MMP-2 e MMP-9, determinação da expressão de FN e suas isoformas em células totais da MO, o estabelecimento do estroma medular ósseo in vitro, por 28 e 35 dias de cultivo. A partir das culturas foram avaliadas a expressão de RNAm de FN e suas isoformas, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR e LC3α e β, quantificação de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ e IL-1β e determinação de LC3β e proteínas da via de AKT/mTOR. Não observamos alterações na expressão do RNAm de FN e suas isoformas ex vivo e in vitro, mas um aumento da deposição de FN na MO.Também não observamos modificações na imunolocalização de MMP-2 e MMP-9 na MO e na atividade dessas proteínas no sobrenadante de culturas de células estromais in vitro, mas houve aumento da expressão do RNAm de MMP-9 em 28 dias de cultivo. Não detectamos alterações na expressão de RNAm e na concentração de TIMP-1 e TIMP-2 no sobrenadante das culturas. Houve redução significativa de TNFα e TGFβ no sobrenadante das culturas de 28 dias. Observamos aumento da expressão do RNAm de mTOR em culturas de 28 dias e LC3α e LC3β em 35 dias de células estromais. Encontramos menor fosforilação de PI3K, AKT, PTEN, mTOR e mTOR total e aumento de LC3β em culturas de 28 dias, mas redução de LC3β em 35 dias. Em função dos dados inferimos que a DP conduz a alterações da FN que não estão relacionadas à ação de MMPs e TIMPs e sim a modificações de LC3β e da via de AKT/mTOR. / Protein malnutrition (PM) can lead changes in extracellular matrix (ECM) from several organs and tissues, including hematopoietic, with functional impairments. Research from our laboratory demonstrated, in a murine model of protein malnutrition, increase in proteic expression of fibronectin (FN) in vivo bone marrow stroma, principally in subendosteal region (attachment site of hematopoietic stem/progenitor cell - HSPC). It was observed as both an increase and a decrease in the presence of FN and its isoforms in vitro bone marrow stroma. These FN changes seem to be related to bone marrow (BM) hypoplasia in malnourished mice. Quantitative FN changes may be due to: (i) action of matrix metalloproteinases (MMP) responsible for ECM proteins degradation; (ii) tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) that regulate ECM degradation; (iii) transicional changes regulated by AKT/mTOR pathway, which controls alternative splicing in FN, resulting in isoforms from this protein; (iv) post-transcriptional processes modulated by LC3 that increases FN mRNA translation. Therefore, the aim of this study was to elucidade the mechanisms that changes the FN turnover in bone marrow stroma in a murine model of PM. C57BL/6J, adult and male mice were used and divided into two groups: control and malnourished, fed ad libitum with ration containing 12% and 2% of protein, respectively. After five weeks of induction malnutrition, mice were euthanized and the biological material was collected. We evaluated: nutritional and hematologic status, the femoral BM histology, immunohistochemistry determination of FN, MMP-2 and MMP-9, the FN and its isoforms expression determination in total BM cells, establishment of in vitro bone marrow stroma for 28 and 35 days of culture. From the cultures were evaluated FN mRNA expressions and its isoforms, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR, LC3α and β, quantification of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ and IL-1β and determination of LC3β and AKT/mTOR proteins. No changes were observed, ex vivo and in vitro, in the expression of FN mRNA and its isoforms, but there was a FN deposition increase in BM. We did not observe modifications in MMP-2 e MMP-9 immunolocalization in BM and in these proteins activity in the supernatant of in vitro stromal cell culture, but there was an increase in MMP-9 mRNA expression after 28 days of culture. We did not detect changes in mRNA and in TIMP-1 and TIMP-2 expressions in the supernatant of cultures. There was significant reduction of TNFα and TGFβ in the cultures supernatant of 28 days. We observed an increase of mTOR RNAm in 28 days cultures and also LC3α and LC3β in stromal cells with 35 days. We found lower phosphorylation of PI3K, AKT, PTEN, mTOR e total mTOR and an LC3β increase in 28 days cultures, yet an LC3β reduction in 35 days. According to the data we conclude that PM leads to FN changes that are not related to MMPs and TIMPs actions, but the LC3β and AKT/mTOR pathway modifications.

Bebês precocemente desmamados apresentam maior incidência de infecções, o que sugere que a ausência de ingestão de alguns fatores presentes no leite materno possa modificar processos de defesa. A glutamina (GLN) está presente em concentração significativa no leite materno, sendo o aumento de sua concentração diretamente proporcional ao período de aleitamento. Esse aminoácido é essencial para a funcionalidade de macrófagos, que apresentam aumento da utilização de GLN durante processos inflamatórios e infecciosos. Bebês apresentam necessidade aumentada de GLN, que é suprida pela ingestão do leite materno, enquanto bebês precocemente desmamados dependem da síntese endógena e do fornecimento exógeno de GLN; todavia, a concentração de GLN em fórmulas infantis artificiais é significantemente baixa ou inexistente. Diante desses fatos, o presente projeto avaliou: (i) o efeito do desmame precoce associado à ingestão de ração isenta e suplementada de GLN sobre a funcionalidade de macrófagos peritoniais e o estado nutricional de camundongos; (ii) o efeito da suplementação com GLN in vitro sobre a funcionalidade de macrófagos peritoniais de camundongos desmamados precocemente e alimentados com ração isenta de GLN; e (iii) o efeito da suplementação crônica com GLN in vivo sobre a funcionalidade de macrófagos peritoniais e o estado nutricional de camundongos desmamados precocemente e inoculados com bacilo de Calmette-Guérin (BCG). O desmame precoce associado à ingestão de ração isenta de GLN reduz o crescimento de camundongos e a concentração de proteína presente no fígado, no músculo esquelético e na carcaça, ao mesmo tempo em que diminui as concentrações plasmática e muscular de GLN e prejudica a resposta hematopoiética (leucopenia e linfopenia associada à redução da celularidade na medula óssea) e a funcionalidade de macrófagos peritoniais (redução da capacidade de adesão, espraiamento, fagocítica e fungicida e da síntese de óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (H2O2), fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β e IL-6). A suplementação com GLN, por meio da ração, reverteu a diminuição da concentração muscular e hepática de proteína, enquanto essa intervenção nutricional reverteu apenas parcialmente as alterações observadas no tocante à funcionalidade de macrófagos (capacidade de espraiamento e síntese de H2O2, NO, TNF-α, IL-1 e IL-6). A suplementação com GLN in vitro, similarmente ao efeito da suplementação in vivo, reverteu apenas parcialmente o prejuízo da função de macrófagos peritoniais de camundongos desmamados precocemente (capacidade de adesão, espraiamento e fagocítica e síntese de H2O2, NO e IL-6). A suplementação crônica com GLN acarreta em aumento da função de macrófagos peritoniais de camundongos previamente inoculados com BCG (capacidade de adesão, espraiamento e fungicida e síntese de H2O2, NO e TNF-α). A partir dos resultados obtidos neste estudo, conclui-se que a GLN modula a função de macrófagos peritoniais de camundongos desmamados precocemente, contudo, a ausência desse aminoácido na dieta é responsável parcialmente pelo prejuízo induzido pelo desmame precoce. / Precociously weaned infants present a higher incidence of infections, which suggests that the absence of ingestion of certain factors present in maternal milk may modify the organism\'s processes of defence. Glutamine (GLN) is present in a significant concentration in maternal milk, this concentration increasing proportionally with the duration of lactation. This amino acid is essential for the correct functioning of macrophages, which increase their demand for GLN during inflammatory and infectious processes. Infants present a high demand for GLN, which is supplied by the ingestion of maternal milk. Precociously weaned infants, on the other hand, depend on the endogenous synthesis and on the exogenous supply of GLN, however, the concentration of GLN in artificial formulations for infants is significantly low or nonexistent. In view of these facts, this study sought to evaluate: (i) the effect in mice of precocious weaning coupled with an ingestion of either a GLN-free or rich diet on the functionality of their peritoneal macrophages and their nutritional state; (ii) the effect of an in vitro supplementation with GLN on the functionality of peritoneal macrophages obtained from precociously weaned mice that were fed a GLN-free diet; and (iii) the effect of a chronic supplementation with GLN in vivo on the functionality of peritoneal macrophages and on the nutritional state of precociouslyt weaned mice that were previously inoculated with BCG. Early weaning coupled with the ingestion of a GLN-free diet slows down growth in mice and decreases the concentration of protein in the liver, in the skeletal muscle and in the carcass, and at the same time decreases the concentration of GLN in the plasma and in the muscle, hindering the haematopoietic response (resulting in leucopoenia and lymphopoenia associated to the decrease in bone marrow cellularity) as well as the functionality of peritoneal macrophages (decrease in their capacity to adhere, spread, phagocyte, kill fungi and synthesise nitric oxide (NO), hydrogen peroxide (H2O2), tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β and IL-6). The supplementation with GLN through ingestion of ration was able to reverse the fall in muscle and liver concentrations of protein, whereas it only partly reversed the alterations observed as to the functionality of macrophages (adhesion, spreading, and synthesis of H2O2, NO, TNF-α, IL-1 and IL-6). The in vitro supplementation with GLN, like the effect of the supplementation in vivo, was able to only partly reverse the hindering of the functionality of peritoneal macrophage obtained from precociously weaned mice (as to adhesion, spreading, phagocytosis and synthesis of H2O2, NO and IL-6). The chronic supplementation with GLN leads to an increase in the functionality of peritoneal macrophages obtained from mice that were previously inoculated with BCG (as to adhesion, spreading, killing fungi and synthesis of H2O2, NO and TNF-α). We can therefore conclude, from the results obtained in this study that GLN modulates the functionality of peritoneal macrophages obtained from precociously weaned mice and that the absence of GLN in the diet is partly responsible for the damage induced by precocious weaning.

A desnutrição proteica (DP) pode ocasionar alterações na matriz extracelular (MEC) de diferentes órgãos e tecidos, inclusive o hematopoético, com comprometimento funcional. Estudos do nosso laboratório demonstraram, em modelo murino de DP, aumento da expressão proteica de fibronectina (FN) no estroma medular ósseo in vivo, principalmente na região subendosteal (local de fixação da célula tronco progenitora hemopoética). Já in vitro, no estroma medular ósseo, observou-se tanto o aumento quanto a diminuição de FN e a presença de suas isoformas. Essas alterações de FN parecem estar envolvidas com a hipoplasia da medula óssea (MO) em camundongos desnutridos. As modificações quantitativas de FN podem ser devidas: (i) à ação das metaloproteinases de matriz (MMP) responsáveis pela degradação das proteínas da MEC; (ii) aos inibidores de metaloproteinases (TIMP) que regulam a degradação da MEC; (iii) às alterações transcricionais, reguladas pela via de AKT/mTOR, que controla os splicing alternativos na FN, resultando em isoformas dessa proteína; (iv) a processos pós-transcricionais modulados por LC3, que aumenta a tradução do RNAm de FN. Assim, o objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos que alteram o turnover de FN no estroma medular ósseo em modelo murino de DP. Utilizamos camundongos, C57BL/6J machos, adultos, separados em dois grupos: controle e desnutrido, alimentados, ad libitum, com ração contendo 12% e 2% de proteína, respectivamente. Após cinco semanas de indução à desnutrição os camundongos foram eutanasiados, e coletado o material biológico. Avaliamos: o estado nutricional, o hematológico, a histologia da MO femoral bem como a determinação imunohistoquímica da FN, MMP-2 e MMP-9, determinação da expressão de FN e suas isoformas em células totais da MO, o estabelecimento do estroma medular ósseo in vitro, por 28 e 35 dias de cultivo. A partir das culturas foram avaliadas a expressão de RNAm de FN e suas isoformas, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR e LC3α e β, quantificação de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ e IL-1β e determinação de LC3β e proteínas da via de AKT/mTOR. Não observamos alterações na expressão do RNAm de FN e suas isoformas ex vivo e in vitro, mas um aumento da deposição de FN na MO.Também não observamos modificações na imunolocalização de MMP-2 e MMP-9 na MO e na atividade dessas proteínas no sobrenadante de culturas de células estromais in vitro, mas houve aumento da expressão do RNAm de MMP-9 em 28 dias de cultivo. Não detectamos alterações na expressão de RNAm e na concentração de TIMP-1 e TIMP-2 no sobrenadante das culturas. Houve redução significativa de TNFα e TGFβ no sobrenadante das culturas de 28 dias. Observamos aumento da expressão do RNAm de mTOR em culturas de 28 dias e LC3α e LC3β em 35 dias de células estromais. Encontramos menor fosforilação de PI3K, AKT, PTEN, mTOR e mTOR total e aumento de LC3β em culturas de 28 dias, mas redução de LC3β em 35 dias. Em função dos dados inferimos que a DP conduz a alterações da FN que não estão relacionadas à ação de MMPs e TIMPs e sim a modificações de LC3β e da via de AKT/mTOR. / Protein malnutrition (PM) can lead changes in extracellular matrix (ECM) from several organs and tissues, including hematopoietic, with functional impairments. Research from our laboratory demonstrated, in a murine model of protein malnutrition, increase in proteic expression of fibronectin (FN) in vivo bone marrow stroma, principally in subendosteal region (attachment site of hematopoietic stem/progenitor cell - HSPC). It was observed as both an increase and a decrease in the presence of FN and its isoforms in vitro bone marrow stroma. These FN changes seem to be related to bone marrow (BM) hypoplasia in malnourished mice. Quantitative FN changes may be due to: (i) action of matrix metalloproteinases (MMP) responsible for ECM proteins degradation; (ii) tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) that regulate ECM degradation; (iii) transicional changes regulated by AKT/mTOR pathway, which controls alternative splicing in FN, resulting in isoforms from this protein; (iv) post-transcriptional processes modulated by LC3 that increases FN mRNA translation. Therefore, the aim of this study was to elucidade the mechanisms that changes the FN turnover in bone marrow stroma in a murine model of PM. C57BL/6J, adult and male mice were used and divided into two groups: control and malnourished, fed ad libitum with ration containing 12% and 2% of protein, respectively. After five weeks of induction malnutrition, mice were euthanized and the biological material was collected. We evaluated: nutritional and hematologic status, the femoral BM histology, immunohistochemistry determination of FN, MMP-2 and MMP-9, the FN and its isoforms expression determination in total BM cells, establishment of in vitro bone marrow stroma for 28 and 35 days of culture. From the cultures were evaluated FN mRNA expressions and its isoforms, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR, LC3α and β, quantification of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ and IL-1β and determination of LC3β and AKT/mTOR proteins. No changes were observed, ex vivo and in vitro, in the expression of FN mRNA and its isoforms, but there was a FN deposition increase in BM. We did not observe modifications in MMP-2 e MMP-9 immunolocalization in BM and in these proteins activity in the supernatant of in vitro stromal cell culture, but there was an increase in MMP-9 mRNA expression after 28 days of culture. We did not detect changes in mRNA and in TIMP-1 and TIMP-2 expressions in the supernatant of cultures. There was significant reduction of TNFα and TGFβ in the cultures supernatant of 28 days. We observed an increase of mTOR RNAm in 28 days cultures and also LC3α and LC3β in stromal cells with 35 days. We found lower phosphorylation of PI3K, AKT, PTEN, mTOR e total mTOR and an LC3β increase in 28 days cultures, yet an LC3β reduction in 35 days. According to the data we conclude that PM leads to FN changes that are not related to MMPs and TIMPs actions, but the LC3β and AKT/mTOR pathway modifications.

Bebês precocemente desmamados apresentam maior incidência de infecções, o que sugere que a ausência de ingestão de alguns fatores presentes no leite materno possa modificar processos de defesa. A glutamina (GLN) está presente em concentração significativa no leite materno, sendo o aumento de sua concentração diretamente proporcional ao período de aleitamento. Esse aminoácido é essencial para a funcionalidade de macrófagos, que apresentam aumento da utilização de GLN durante processos inflamatórios e infecciosos. Bebês apresentam necessidade aumentada de GLN, que é suprida pela ingestão do leite materno, enquanto bebês precocemente desmamados dependem da síntese endógena e do fornecimento exógeno de GLN; todavia, a concentração de GLN em fórmulas infantis artificiais é significantemente baixa ou inexistente. Diante desses fatos, o presente projeto avaliou: (i) o efeito do desmame precoce associado à ingestão de ração isenta e suplementada de GLN sobre a funcionalidade de macrófagos peritoniais e o estado nutricional de camundongos; (ii) o efeito da suplementação com GLN in vitro sobre a funcionalidade de macrófagos peritoniais de camundongos desmamados precocemente e alimentados com ração isenta de GLN; e (iii) o efeito da suplementação crônica com GLN in vivo sobre a funcionalidade de macrófagos peritoniais e o estado nutricional de camundongos desmamados precocemente e inoculados com bacilo de Calmette-Guérin (BCG). O desmame precoce associado à ingestão de ração isenta de GLN reduz o crescimento de camundongos e a concentração de proteína presente no fígado, no músculo esquelético e na carcaça, ao mesmo tempo em que diminui as concentrações plasmática e muscular de GLN e prejudica a resposta hematopoiética (leucopenia e linfopenia associada à redução da celularidade na medula óssea) e a funcionalidade de macrófagos peritoniais (redução da capacidade de adesão, espraiamento, fagocítica e fungicida e da síntese de óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (H2O2), fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β e IL-6). A suplementação com GLN, por meio da ração, reverteu a diminuição da concentração muscular e hepática de proteína, enquanto essa intervenção nutricional reverteu apenas parcialmente as alterações observadas no tocante à funcionalidade de macrófagos (capacidade de espraiamento e síntese de H2O2, NO, TNF-α, IL-1 e IL-6). A suplementação com GLN in vitro, similarmente ao efeito da suplementação in vivo, reverteu apenas parcialmente o prejuízo da função de macrófagos peritoniais de camundongos desmamados precocemente (capacidade de adesão, espraiamento e fagocítica e síntese de H2O2, NO e IL-6). A suplementação crônica com GLN acarreta em aumento da função de macrófagos peritoniais de camundongos previamente inoculados com BCG (capacidade de adesão, espraiamento e fungicida e síntese de H2O2, NO e TNF-α). A partir dos resultados obtidos neste estudo, conclui-se que a GLN modula a função de macrófagos peritoniais de camundongos desmamados precocemente, contudo, a ausência desse aminoácido na dieta é responsável parcialmente pelo prejuízo induzido pelo desmame precoce. / Precociously weaned infants present a higher incidence of infections, which suggests that the absence of ingestion of certain factors present in maternal milk may modify the organism\'s processes of defence. Glutamine (GLN) is present in a significant concentration in maternal milk, this concentration increasing proportionally with the duration of lactation. This amino acid is essential for the correct functioning of macrophages, which increase their demand for GLN during inflammatory and infectious processes. Infants present a high demand for GLN, which is supplied by the ingestion of maternal milk. Precociously weaned infants, on the other hand, depend on the endogenous synthesis and on the exogenous supply of GLN, however, the concentration of GLN in artificial formulations for infants is significantly low or nonexistent. In view of these facts, this study sought to evaluate: (i) the effect in mice of precocious weaning coupled with an ingestion of either a GLN-free or rich diet on the functionality of their peritoneal macrophages and their nutritional state; (ii) the effect of an in vitro supplementation with GLN on the functionality of peritoneal macrophages obtained from precociously weaned mice that were fed a GLN-free diet; and (iii) the effect of a chronic supplementation with GLN in vivo on the functionality of peritoneal macrophages and on the nutritional state of precociouslyt weaned mice that were previously inoculated with BCG. Early weaning coupled with the ingestion of a GLN-free diet slows down growth in mice and decreases the concentration of protein in the liver, in the skeletal muscle and in the carcass, and at the same time decreases the concentration of GLN in the plasma and in the muscle, hindering the haematopoietic response (resulting in leucopoenia and lymphopoenia associated to the decrease in bone marrow cellularity) as well as the functionality of peritoneal macrophages (decrease in their capacity to adhere, spread, phagocyte, kill fungi and synthesise nitric oxide (NO), hydrogen peroxide (H2O2), tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β and IL-6). The supplementation with GLN through ingestion of ration was able to reverse the fall in muscle and liver concentrations of protein, whereas it only partly reversed the alterations observed as to the functionality of macrophages (adhesion, spreading, and synthesis of H2O2, NO, TNF-α, IL-1 and IL-6). The in vitro supplementation with GLN, like the effect of the supplementation in vivo, was able to only partly reverse the hindering of the functionality of peritoneal macrophage obtained from precociously weaned mice (as to adhesion, spreading, phagocytosis and synthesis of H2O2, NO and IL-6). The chronic supplementation with GLN leads to an increase in the functionality of peritoneal macrophages obtained from mice that were previously inoculated with BCG (as to adhesion, spreading, killing fungi and synthesis of H2O2, NO and TNF-α). We can therefore conclude, from the results obtained in this study that GLN modulates the functionality of peritoneal macrophages obtained from precociously weaned mice and that the absence of GLN in the diet is partly responsible for the damage induced by precocious weaning.