Les mécanismes de la fibrogenèse hépatique liée à l'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC) sont encore mal connus. L'activation de la fibrogenèse semble fortement associée à la réaction inflammatoire locale. Néanmoins le rôle direct du VHC dans le processus fibrogène n'a pas été étudié. Notre hypothèse est que la fibrose peut être au moins en partie directement induite par le VHC, indépendamment de la réponse immune de l'hôte.L'un des aspects inhérents à ce postulat est qu'une relation directe pourrait exister entre les particules du VHC et l'activation des principaux acteurs cellulaires de la fibrogenèse hépatique, les cellules étoilées du foie (CEFs). Ainsi, les objectifs de ce projet ont été d'étudier in vitro, la capacité du VHC à activer les CEFs humaines mais d'abord d'explorer la relation existant entre cette activation et une éventuelle infection de ces cellules par le VHC. Afin d'analyser la permissivité des CEFs à l'infection par le VHC, nous avons combiné plusieurs modèles originaux du VHC, tels que le clone infectieux JFH1, des rétrovirus pseudotypés avec les protéines d'enveloppe du VHC et le réplicon sous-génomique, avec deux modèles cellulaires de CEFs relevant (des cultures primaires humaines et la lignée immortalisée LX2). En conclusion, nous avons démontré que les CEFs humaines sont réfractaires à la fois à l'entrée et à la réplication du VHC. Ces résultats n'écartent cependant pas l'hypothèse d'une interaction directe entre les particules du VHC et la surface des CEFs dans l'activation fibrogénique de ces cellules. Le rôle des protéines d'enveloppe virales sous leur conformation native dans l'activation des CEFs fût étudié en incubant des ppVHC avec les CEFs. Malgré des résultats préliminaires encourageants, la question d'une activation éventuelle des CEFs en culture après contact avec des particules virales du VHC, et ce indépendamment d'une entrée et/ou d'une réplication virale, n'a pu être confirmé et reste encore sans réponse.Un second aspect est que l'expression in vivo de l'ensemble des protéines du VHC dans les hépatocytes pourrait jouer un rôle dans le déclenchement et la progression de la fibrose portale. Nous avons démontré pour la première fois que l'expression hépatocytaire in vivo des protéines du VHC chez des souris transgéniques, les FL-N/35, soumises à un traitement fibrogénique (injection chronique de CCl4) était associée à une fibrose augmentée, et ce de manière indépendante de l'inflammation locale. Cette fibrose augmentée chez les FL-N/35 s'accompagnait d'une production augmentée de d'espèces réactives de l'oxygène intrahépatocytaires, d'une réaction ductulaire caractérisée notamment par une expansion de cellules progénitrices hépatiques (CPHs), et d'une l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. On notera également que cette fibrose portale corrélait avec l'expansion des CPHs portales, corollaire implicite de l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. Ces observations, également observé chez les patients infectés par le VHC, suggèrent que la RD associée à une altération de la prolifération hépatocytaire jouerait un rôle dans la fibrose portale. Le modèle de souris utilisé présentant une expression intrahépatocytaire des protéines du VHC, nos résultats suggèrent implicitement une perturbation de l'homéostasie hépatocytaire comme point de départ des altérations observées dans cette étude. Afin de caractériser in vivo les altérations de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire et d'identifier le mécanisme sous-jacent chez ces souris, un modèle de régénération hépatique, induit par l'injection d'une forte dose de l'hépatotoxique CCl4 a été utilisé. Nos résultats ont mis en évidence une inhibition de la transition G1/S associée à une activation de la voie ATM de réponse aux dommages à l'ADN causés par un stress oxydant exacerbé dans les hépatocytes de souris exprimant les protéines du VHC. / Les mécanismes de la fibrogenèse hépatique liée à l'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC) sont encore mal connus. L'activation de la fibrogenèse semble fortement associée à la réaction inflammatoire locale. Néanmoins le rôle direct du VHC dans le processus fibrogène n'a pas été étudié. Notre hypothèse est que la fibrose peut être au moins en partie directement induite par le VHC, indépendamment de la réponse immune de l'hôte.L'un des aspects inhérents à ce postulat est qu'une relation directe pourrait exister entre les particules du VHC et l'activation des principaux acteurs cellulaires de la fibrogenèse hépatique, les cellules étoilées du foie (CEFs). Ainsi, les objectifs de ce projet ont été d'étudier in vitro, la capacité du VHC à activer les CEFs humaines mais d'abord d'explorer la relation existant entre cette activation et une éventuelle infection de ces cellules par le VHC. Afin d'analyser la permissivité des CEFs à l'infection par le VHC, nous avons combiné plusieurs modèles originaux du VHC, tels que le clone infectieux JFH1, des rétrovirus pseudotypés avec les protéines d'enveloppe du VHC et le réplicon sous-génomique, avec deux modèles cellulaires de CEFs relevant (des cultures primaires humaines et la lignée immortalisée LX2). En conclusion, nous avons démontré que les CEFs humaines sont réfractaires à la fois à l'entrée et à la réplication du VHC. Ces résultats n'écartent cependant pas l'hypothèse d'une interaction directe entre les particules du VHC et la surface des CEFs dans l'activation fibrogénique de ces cellules. Le rôle des protéines d'enveloppe virales sous leur conformation native dans l'activation des CEFs fût étudié en incubant des ppVHC avec les CEFs. Malgré des résultats préliminaires encourageants, la question d'une activation éventuelle des CEFs en culture après contact avec des particules virales du VHC, et ce indépendamment d'une entrée et/ou d'une réplication virale, n'a pu être confirmé et reste encore sans réponse.Un second aspect est que l'expression in vivo de l'ensemble des protéines du VHC dans les hépatocytes pourrait jouer un rôle dans le déclenchement et la progression de la fibrose portale. Nous avons démontré pour la première fois que l'expression hépatocytaire in vivo des protéines du VHC chez des souris transgéniques, les FL-N/35, soumises à un traitement fibrogénique (injection chronique de CCl4) était associée à une fibrose augmentée, et ce de manière indépendante de l'inflammation locale. Cette fibrose augmentée chez les FL-N/35 s'accompagnait d'une production augmentée de d'espèces réactives de l'oxygène intrahépatocytaires, d'une réaction ductulaire caractérisée notamment par une expansion de cellules progénitrices hépatiques (CPHs), et d'une l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. On notera également que cette fibrose portale corrélait avec l'expansion des CPHs portales, corollaire implicite de l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. Ces observations, également observé chez les patients infectés par le VHC, suggèrent que la RD associée à une altération de la prolifération hépatocytaire jouerait un rôle dans la fibrose portale. Le modèle de souris utilisé présentant une expression intrahépatocytaire des protéines du VHC, nos résultats suggèrent implicitement une perturbation de l'homéostasie hépatocytaire comme point de départ des altérations observées dans cette étude. Afin de caractériser in vivo les altérations de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire et d'identifier le mécanisme sous-jacent chez ces souris, un modèle de régénération hépatique, induit par l'injection d'une forte dose de l'hépatotoxique CCl4 a été utilisé. Nos résultats ont mis en évidence une inhibition de la transition G1/S associée à une activation de la voie ATM de réponse aux dommages à l'ADN causés par un stress oxydant exacerbé dans les hépatocytes de souris exprimant les protéines du VHC.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fibrose hepática é o resultado de uma lesão crônica, com a ativação de células inflamatórias e fibrogênicas no fígado, as quais levam a um acúmulo excessivo de proteínas de matriz extracelular (MEC). Essas alterações resultam na morte de células do fígado, com desorganização e perda da função do parênquima hepático. A cirrose é o estágio avançado da fibrose, e culmina na falência hepática, uma condição potencialmente fatal cujo único tratamento efetivo é o transplante de fígado, o qual é limitado pela disponibilidade de órgãos. Na busca por terapias alternativas visando a regeneração hepática, o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) mostrou resultados benéficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clínicos. Entre essas células, estão as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatória. Este estudo pretendeu avançar na compreensão dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regeneração hepática. Ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parâmetros hepáticos como componentes da MEC (colágeno total, colágenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (células fibrogênicas, células de Kupffer e colangiócitos) e enzimas hepáticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regeneração hepática de maneira global, (a) diminuindo o acúmulo de colágeno e laminina; (b) aumentando a produção de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por células de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangiócitos e diminuindo a quantidade de células fibrogênicas; e (d) normalizando os níveis sanguíneos das enzimas hepáticas. Portanto, nós sugerimos que as CMMO podem ajudar na regeneração hepática através de mecanismos parácrinos e se diferenciando em células de Kupffer, contribuindo para a secreção de fatores antiinflamatórios e anti-fibrogênicos no fígado com fibrose. / Liver fibrosis results from a chronic injury, with the activation of hepatic inflammatory and fibrogenic cells, which lead to an excessive extracellular matrix (MEC) protein accumulation. These alterations result in the death of liver cells, along with disorganization and loss of function of the hepatic parenchyma. Cirrhosis is the advanced stage of fibrosis, and culminates in hepatic failure, a potentially fatal condition whose only effective treatment is liver transplantation, which is limited by organ shortage. Amid the search for alternative therapies aiming hepatic regeneration, bone marrow mononuclear cell (CMMO) transplantation has shown promising and benefic results in animal models and some clinical protocols. Amongst these cells are hematopoietic and mesenchymal stem cells, which present regenerative potential and modulate inflammatory response. This study aimed to add knowledge on the mechanisms by which CMMO may prompt hepatic regeneration. Rats with liver fibrosis induced by bile duct ligation (LDB) were transplanted with CMMO and compared to fibrotic and normal rats without transplantation. Hepatic parameters such as MEC components (total collagen, collagens types I and IV, laminin and matrix metalloproteinases MMPs), cellular components (fibrogenic and Kupffer cells, cholangiocytes) and liver enzymes were analyzed through confocal, fluorescence and light microscopy, western blotting and spectrophotometry. Results showed that CMMO contribute to liver regeneration globally, (a) reducing collagen and laminin accumulation; (b) increasing MMP production, specially by Kupffer cells, that favor MEC remodeling; (c) normalizing cholangiocyte numbers and reducing fibrogenic cells; and (d) normalizing plasma levels of hepatic enzymes. Therefore, we suggest that CMMO may help hepatic regeneration through paracrine mechanisms and by differentiating in Kupffer cells, contributing to the secretion of anti-inflammatory and anti-fibrotic factors within the fibrotic liver.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fibrose hepática é o resultado de uma lesão crônica, com a ativação de células inflamatórias e fibrogênicas no fígado, as quais levam a um acúmulo excessivo de proteínas de matriz extracelular (MEC). Essas alterações resultam na morte de células do fígado, com desorganização e perda da função do parênquima hepático. A cirrose é o estágio avançado da fibrose, e culmina na falência hepática, uma condição potencialmente fatal cujo único tratamento efetivo é o transplante de fígado, o qual é limitado pela disponibilidade de órgãos. Na busca por terapias alternativas visando a regeneração hepática, o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) mostrou resultados benéficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clínicos. Entre essas células, estão as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatória. Este estudo pretendeu avançar na compreensão dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regeneração hepática. Ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parâmetros hepáticos como componentes da MEC (colágeno total, colágenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (células fibrogênicas, células de Kupffer e colangiócitos) e enzimas hepáticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regeneração hepática de maneira global, (a) diminuindo o acúmulo de colágeno e laminina; (b) aumentando a produção de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por células de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangiócitos e diminuindo a quantidade de células fibrogênicas; e (d) normalizando os níveis sanguíneos das enzimas hepáticas. Portanto, nós sugerimos que as CMMO podem ajudar na regeneração hepática através de mecanismos parácrinos e se diferenciando em células de Kupffer, contribuindo para a secreção de fatores antiinflamatórios e anti-fibrogênicos no fígado com fibrose. / Liver fibrosis results from a chronic injury, with the activation of hepatic inflammatory and fibrogenic cells, which lead to an excessive extracellular matrix (MEC) protein accumulation. These alterations result in the death of liver cells, along with disorganization and loss of function of the hepatic parenchyma. Cirrhosis is the advanced stage of fibrosis, and culminates in hepatic failure, a potentially fatal condition whose only effective treatment is liver transplantation, which is limited by organ shortage. Amid the search for alternative therapies aiming hepatic regeneration, bone marrow mononuclear cell (CMMO) transplantation has shown promising and benefic results in animal models and some clinical protocols. Amongst these cells are hematopoietic and mesenchymal stem cells, which present regenerative potential and modulate inflammatory response. This study aimed to add knowledge on the mechanisms by which CMMO may prompt hepatic regeneration. Rats with liver fibrosis induced by bile duct ligation (LDB) were transplanted with CMMO and compared to fibrotic and normal rats without transplantation. Hepatic parameters such as MEC components (total collagen, collagens types I and IV, laminin and matrix metalloproteinases MMPs), cellular components (fibrogenic and Kupffer cells, cholangiocytes) and liver enzymes were analyzed through confocal, fluorescence and light microscopy, western blotting and spectrophotometry. Results showed that CMMO contribute to liver regeneration globally, (a) reducing collagen and laminin accumulation; (b) increasing MMP production, specially by Kupffer cells, that favor MEC remodeling; (c) normalizing cholangiocyte numbers and reducing fibrogenic cells; and (d) normalizing plasma levels of hepatic enzymes. Therefore, we suggest that CMMO may help hepatic regeneration through paracrine mechanisms and by differentiating in Kupffer cells, contributing to the secretion of anti-inflammatory and anti-fibrotic factors within the fibrotic liver.

[ES] La resistencia a la insulina se define como un aumento en la cantidad de insulina necesaria para conseguir la homeostasis de glucosa. Una de las complicaciones más comunes de la resistencia a la insulina es el defecto en la reparación de herida. El sustrato 2 del receptor de la insulina (IRS2) es un mediador clave para la señalización de insulina en hígado que actúa de puente entre los receptores de la insulina y del factor de crecimiento insulínico (IGF-1) y sus cascadas de señalización. Tanto la resistencia a la insulina como cambios en los niveles de expresión de IRS2 han sido asociados con el desarrollo y la progresión de enfermedades hepáticas graves. El daño hepático crónico generado por algunos factores derivados de la resistencia a la insulina ha sido establecido como determinante en la patofisiología de las enfermedades hepáticas. Sin embargo, sigue siendo una incógnita cómo el daño hepático generado por la resistencia a la insulina escapa de la extraordinaria capacidad de regeneración del hígado. Durante el daño hepático crónico, la reparación epitelial está mediada por las células progenitoras hepáticas (CPH) que se expanden y diferencian hasta hepatocitos o células biliares rodeadas de un nicho estromal formado por un conjunto de células estrelladas hepáticas (CEH), células inflamatorias, componentes de la matriz extracelular (ECM) y factores de crecimiento. El factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF7), expresado por las CEH, resulta crítico para la respuesta de las CPH y para la regeneración hepática. Durante el daño hepático crónico las CEH se activan transdiferenciandose desde células quiescentes a células fibrogénicas (CEHa) denominadas miofibroblastos que depositan ECM para reemplazar el tejido dañado. Para alcanzar una correcta regeneración hepática se requiere la resolución de la activación ("reversión fibrogénica") de las CEH. Empleando el modelo de ratón Irs2-/- durante el daño hepático crónico con la dieta DDC 0.1% y los modelos in vitro humanos de CPH (HepaRG) y de CEH (CEH primarias y la línea celular LX-2), los resultados de este trabajo demuestran que la señalización de insulina-IRS2 es necesaria para la epitelización dirigida por la comunicación paracrina a través de FGF7 en el nicho de CPH. Por un lado, IRS2 es necesario en la población de CEH para permitir su supervivencia durante la reversión fibrogénica, un proceso que según nuestros resultados induce un aumento en la expresión de FGF7. Nuestros datos descubren un potencial mecanismo de regulación mediante el que IRS2 induce la expresión de FGF7 en CEH a través de la remodelación en la ECM mediada por NRF2 y el integrante de la ECM SERPINE1 durante las etapas tempranas de la reversión fibrogénica. El eje NRF2-SERPINE1 ha sido descrito anteriormente en fibroblastos de piel como esencial para la reepitelización de herida. NRF2 es el principal factor de transcripción de respuesta frente al estrés oxidativo (ruta canónica). En hepatocitos, la activación de NRF2 también puede inducirse a través de una ruta no canónica mediada por la proteína cargo de la autofagia P62. A pesar de que nuestros datos descubren a P62 como capaz de inducir la actividad de NRF2 en CPH, también demuestran que IRS2 activa a NRF2 en CPH y en CEH de manera independiente a la ruta no canónica mediada por P62. Por otro lado, demostramos que la señalización de insulina-IRS2, por promover la producción de FGF7, permite un novedoso bucle de inducción positiva mediante el que la respuesta a FGF7 en CPH promueve la expresión de su receptor, FGFR2b, favoreciendo su propia sensibilidad y sosteniendo la reparación epitelial. Futuras estrategias para potenciar en hígado la actividad de NRF2 y la señalización de FGF7 podrían servir para mejorar el pronóstico de los pacientes con resistencia a la insulina, diabetes o enfermedad metabólica por promover la reparación epitelial en hígado y reducir su riesgo de desarrollar patologías hepáticas graves con elevada tasa de mortalidad. / [CAT] La resistència a la insulina es defineix com un augment en la quantitat d'insulina necessària per a aconseguir l'homeòstasi de glucosa. Una de les complicacions més freqüents de la resistència a la insulina és el defecte en la reparació de ferida. El substrat 2 del receptor de la insulina (IRS2) és un mediador clau per a la senyalització d'insulina en fetge que actua de pont entre els receptors de la insulina i del factor de creixement insulínic (IGF-1) i les seues cascades de senyalització. Tant la resistència a la insulina com els canvis en els nivells d'expressió d'IRS2 han sigut associats amb el desenvolupament i la progressió de malalties hepàtiques greus. El mal hepàtic crònic generat per alguns factors derivats de la resistència a la insulina s'ha establert com a determinant en la patofisiologia de les malalties hepàtiques. No obstant això, els motius pels quals el mal hepàtic generat per la resistència a la insulina escapa a l'extraordinària capacitat de regeneració del fetge són encara una incògnita. Durant el mal crònic, la reparació epitelial està mediada per les cèl·lules progenitores hepàtiques (CPH) que s'expandeixen i diferencien fins a hepatòcits o cèl·lules biliars envoltades d'un nínxol estromal format per un conjunt de cèl·lules estavellades hepàtiques (CEH), cèl·lules inflamatòries, components de la matriu extracelul·lar (ECM) i factors de creixement. El factor de creixement de fibroblasts 7 (FGF7), expressat en fetge per les CEH, resulta crític per a la resposta de les CPH i per a la regeneració hepàtica. Durant el mal hepàtic crònic les CEH s'activen transdiferenciant-se des de cèl·lules quiescents a cèl·lules fibrogèniques denominades miofibroblasts (CEH activades) que depositen ECM per a reemplaçar el teixit danyat. Per a aconseguir una correcta regeneració hepàtica es requereix la resolució de l'activació ("reversió fibrogènica") de les CEH. A partir de l'ús del model de ratolí Irs2-/- durant el mal hepàtic crònic amb la dieta DDC 0.1% i dels models in vitro humans de CPH (HepaRG) i de CEH (CEH primàries i la línia cel·lular LX-2), els resultats d'aquest treball demostren que la senyalització d'insulina-IRS2 és necessària per a l'epitelització dirigida per la comunicació paracrina mitjançant FGF7 en el nínxol de CPH. D'una banda, IRS2 és necessari en la població de CEH per a permetre la seua supervivència durant la reversió fibrogènica, que comporta un augment en l'expressió de FGF7. Les nostres dades descobreixen un potencial mecanisme de regulació mitjançant el qual IRS2 indueix l'expressió de FGF7 en CEH a través de la remodelació en la ECM mediada per NRF2 i per l'integrant de la ECM SERPINE1, que ocorre en les etapes primerenques de la reversió fibrogènica. L'eix NRF2-SERPINE1 ha sigut identificat anteriorment en fibroblasts de pell com a essencial per a la reparació de ferida. NRF2 és el principal factor de transcripció de resposta davant de l'estrés oxidatiu (ruta canònica). En hepatòcits, l'activació de NRF2 també pot induir-se a través d'una ruta no canònica mediada per la proteïna de càrrega de l'autofàgia P62. A pesar que les nostres dades indiquen que P62 és capaç d'induir l'activitat de NRF2 en CPH, també demostren que IRS2 activa NRF2 en CPH i CEH de manera independent a la ruta no canònica mediada per P62. D'altra banda, demostrem que la senyalització d'insulina-IRS2, per promoure la producció de FGF7, permet un nou bucle d'inducció positiva mitjançant el qual la resposta a FGF7 en CPH promou l'expressió del seu receptor, FGFR2b, afavorint la seua pròpia sensibilitat i sostenint la reparació epitelial. Futures estratègies per a potenciar en fetge l'activitat de NRF2 i la senyalització de FGF7 podrien servir per a millorar el pronòstic dels pacients amb resistència a la insulina, diabetis o malaltia metabòlica, per promoure la reparació epitelial en fetge i reduir, per tant, el seu risc de desenvolupar patologies hepàtiques greus amb elevada taxa de mortalitat. / [EN] Insulin resistance is defined as an increase in the amount of insulin that is necessary to achieve glucose homeostasis. One of the most prevalent complications of insulin resistance is the wound healing defect. Insulin receptor factor 2 (IRS2) is a key mediator of the insulin signaling in liver, which acts as a bridge between insulin and insulin growth factor 1 (IGF-1) receptors and its downstream molecular pathways. Both, insulin resistance and changes in the expression levels of IRS2, have been associated with the development and progression of severe liver diseases. Chronic liver injury produced by insulin resistance has been stablished as crucial in the pathophysiology of liver disease. However, it remains unknown how the chronic liver injury produced by insulin resistance escapes from the extraordinary ability of the liver to regenerate. During chronic liver injury, epithelial repair is mediated by liver progenitor cells (LPC), that expand and differentiate into hepatocytes and cholangiocytes surrounded by a stromal niche that consist of hepatic stellate cells (HSC), inflammatory cells, extracellular matrix (ECM) components and growth factors. Fibroblast growth factor 7 (FGF7), expressed by HSC, is critic for LPC response and liver regeneration. During chronic liver injury, HSC transdifferentiate from quiescent to active fibrogenic HSC (aHSC) called myofibroblast. aHSC deposit ECM to replace damaged tissue. A successful regeneration requires the resolution of the HSC activation, i.e., the "fibrogenic reversion" of HSC. Using the Irs2-/- mice model during chronic liver damage induced by 0.1% DDC diet and the human in vitro models of LPC (HepaRG) and HSC (primary HSC and the cell line LX-2), our results reveal a new role of insulin-IRS2 in the modulation of the paracrine FGF7 crosstalk in the LPC niche that drives LPC epithelization. On the one hand, IRS2 is necessary in HSC to allow survival during fibrogenic reversion, a process that according to our data induces an increase in FGF7 expression. Our results reveal a potential mechanism by which IRS2 promotes FGF7 expression in HSC through an ECM remodeling process that is mediated by NRF2 and the ECM constituent SERPINE1 during the early stages of fibrogenic reversion. NRF2-SERPINE1-mediated ECM remodeling has been previously identified in skin fibroblast as essential to promote re-epithelialization of wounds. NRF2 is a transcription factor that is activated in response to oxidative stress (canonical pathway). NRF2 activation in hepatocytes can be also induced by a non-canonical pathway mediated by the autophagy cargo protein P62. Although our data discovers a new ability of P62 to induce NRF2 activity in LPC, we also demonstrate that IRS2 activates NRF2 in LPC and HSC in a P62-independent manner. On the other hand, we demonstrate that insulin-IRS2 signaling, by promoting FGF7 production, enables a novel positive induction loop whereby FGF7 response in LPC promotes the expression of its receptor, FGFR2b, favoring its own sensitivity and sustaining epithelial repair. Future strategies to enhance NRF2 activity or FGF7 signaling in liver might be useful to improve the prognosis of insulin resistance, diabetic, and metabolic disease patients because of its uncovered ability to promote epithelial repair, thus, preventing the development of severe liver pathologies with high mortality risk. / Arámbul Anthony, MJ. (2022). Papel de IRS2 en la regulación de la comunicación a través de FGFs en el nicho de células progenitoras hepáticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/188913

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea. / The adult bone marrow retains two populations of stem cells with emerging importance for the treatment of diverse liver diseases: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells. Liver regeneration after partial hepatectomy is a complex process that requires the proliferation of all hepatic cells. Growth factors, cytokines and extracellular matrix molecules are key elements in this process. Laminins are a family of heterotrimeric extracellular matrix proteins with adhesive and chemotactic functions, through recruitment of integrins and other cell surface receptors. In the normal liver, laminin is expressed in portal and centrolobular veins. The aim of this study was to investigate laminin expression during liver regeneration induced by partial hepatectomy and after bone marrow mononuclear cells transplantation. Rat bone marrow mononuclear cells were obtained from tibias and femurs, isolated, stained with DAPI and injected in immediately hepatectomyzed rats via portal vein. Livers were collected 15 minutes, 1 day and 3 days after hepatectomy and bone marrow cells transplantation and frozen. Liver sections were immunolabeled with mouse anti-rat CD34 and rabbit anti-rat laminin primary antibodies and observed under a Laser Scanning Confocal Microscope. Results showed that 15 minutes after partial hepatectomy, transplanted CD34+ HSCs were found in contact with laminin, which was localized principally in portal and centrolobular veins of rat livers, indicating that laminin could participate in stem cell initial attachment to these vessels soon after their transplantation. Furthermore, 1 and 3 days after hepatectomy, transplanted bone marrow mononuclear cells were found in the hepatic sinusoids expressing laminin. These results suggest that laminin could be an important extracellular matrix component for bone marrow cell adhesion and grafting in the injured liver. We also analyzed osteopontin (OPN) expression in bone marrow mononuclear cells and HSCs. Results by confocal microscopy showed that the most freshly isolated bone marrow mononuclear cells express variable amounts of OPN. Furthermore, some CD34+ HSCs also expressed OPN. After 1 and 4 days in culture, we observed a decrease in CD34+ cells, and an increase in OPN expression in bone marrow mononuclear cells.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea. / The adult bone marrow retains two populations of stem cells with emerging importance for the treatment of diverse liver diseases: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells. Liver regeneration after partial hepatectomy is a complex process that requires the proliferation of all hepatic cells. Growth factors, cytokines and extracellular matrix molecules are key elements in this process. Laminins are a family of heterotrimeric extracellular matrix proteins with adhesive and chemotactic functions, through recruitment of integrins and other cell surface receptors. In the normal liver, laminin is expressed in portal and centrolobular veins. The aim of this study was to investigate laminin expression during liver regeneration induced by partial hepatectomy and after bone marrow mononuclear cells transplantation. Rat bone marrow mononuclear cells were obtained from tibias and femurs, isolated, stained with DAPI and injected in immediately hepatectomyzed rats via portal vein. Livers were collected 15 minutes, 1 day and 3 days after hepatectomy and bone marrow cells transplantation and frozen. Liver sections were immunolabeled with mouse anti-rat CD34 and rabbit anti-rat laminin primary antibodies and observed under a Laser Scanning Confocal Microscope. Results showed that 15 minutes after partial hepatectomy, transplanted CD34+ HSCs were found in contact with laminin, which was localized principally in portal and centrolobular veins of rat livers, indicating that laminin could participate in stem cell initial attachment to these vessels soon after their transplantation. Furthermore, 1 and 3 days after hepatectomy, transplanted bone marrow mononuclear cells were found in the hepatic sinusoids expressing laminin. These results suggest that laminin could be an important extracellular matrix component for bone marrow cell adhesion and grafting in the injured liver. We also analyzed osteopontin (OPN) expression in bone marrow mononuclear cells and HSCs. Results by confocal microscopy showed that the most freshly isolated bone marrow mononuclear cells express variable amounts of OPN. Furthermore, some CD34+ HSCs also expressed OPN. After 1 and 4 days in culture, we observed a decrease in CD34+ cells, and an increase in OPN expression in bone marrow mononuclear cells.