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Whey-hydrolyzed peptide-enriched immunomodulating diet prevents progression of liver cirrhosis in rats / 加水分解ホエイペプチド高含有免疫調整栄養食による、ラット肝硬変進展の抑制効果Jobara, Kanta 23 July 2014 (has links)
京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18508号 / 医博第3928号 / 新制||医||1005(附属図書館) / 31394 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川口 義弥, 教授 稲垣 暢也, 教授 千葉 勉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM
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Partial hepatectomy and liver regeneration in PCSK9 knockout miceRoubtsova, Anna. January 2008 (has links)
No description available.
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The interaction of morphogenic pathways in hepatic metabolism under consideration of liver dimorphismHochmuth, Luise 06 December 2022 (has links)
The liver is a multifunctional organ that regulates important processes such as lipid, glucose and xenobiotic metabolism. Most of the hepatic functions are implemented in the hepatocytes, which make up the largest cellular proportion of the liver. Various signaling pathways are required for the liver to perform its diverse metabolic tasks, two of them are the Hedgehog (HH) and mechanistic target of rapamycin (mTOR) signaling pathways. Dysregulation of these signaling pathways leads to various liver diseases, such as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and hepatocellular carcinoma (HCC). In order to develop appropriate treatments for these disorders, it is important to understand the molecular interactions of the various signaling pathways involved in their development and progression. However, another aspect is particularly important in the treatment of hepatic diseases - the sexual dimorphism of the liver.
A great variety of genes are differentially expressed in the liver of males and females. Signaling pathways affected by hepatic sexual dimorphism include lipid and drug metabolism. Although the influence of sex-specific dimorphism in the liver on diseases and drug doses is well known, there are currently only a few sex-specific treatment concepts. In order to incorporate this aspect in the development of new and more effective treatments, it is important to understand the molecular mechanism and characteristics of sexual dimorphism in model systems. Primary hepatocytes are often used for in vitro analysis of pharmaceutical studies. However, little is known about the development of sexual dimorphism during the culture of primary cells.
To facilitate the development of novel sex-specific treatment approaches, the present thesis investigated the interaction of the HH and mTOR signaling pathways in hepatocytes, as well as the development of sexual dimorphism during the culture of primary hepatocytes for up to 96 h. Male and female mice with a hepatocyte-specific knock-out (KO) of the HH signaling were used to examine a possible interaction of HH and mTOR signaling. The repression of the HH signaling cascade leads to reduced mRNA expression of molecules involved in mTOR Signaling as well as decreased mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) production in hepatocytes from female KO mice. In contrast, hepatocytes from male KO mice showed reduced phosphorylation of mTOR molecules. Furthermore, an impaired autophagy was detected in primary hepatocytes from both sexes. Consequently, the hepatocyte-specific HH-KO leads to decreased mTOR activity in males and females. However, the KO shows different points of action depending on the sex of the mice. To investigate the crosstalk of the two pathways in more detail, primary hepatocytes from male and female C57BL/6N mice were incubated with the HH inhibitor cyclopamine and the mTOR inhibitors rapamycin and Torin. Thereby, a synergistic effect of cyclopamine and rapamycin could be demonstrated on the repression of the mTOR signaling cascade and mitochondrial ATP production.
Although primary hepatocytes have been isolated from male and female mice for all experiments, the further development of the sexual dimorphism of the hepatocytes in monolayer-cultivation is unclear. Therefore, cells from male and female C57BL/6N mice were isolated to conduct transcriptome, proteome and metabolome studies directly after isolation and after 24, 48, 72 and 96 h of cultivation. It was striking that the expression pattern of sexually differentiated genes developed differently during cell culture compared to the translation pattern of sexually differentiated proteins. While mRNA expression showed a large shift after 24 h, there was a feminization of the translation pattern at the protein level throughout the cultivation period. Furthermore, the study revealed a change in the sex-specific gene expression of xenobiotic metabolism with a significant decrease of female-specific expression of Cytochrome P450 (Cyp) 2b13 and Cyp2b9. Since no sex hormones or growth factors were added to the cell culture, a reduction in sex differences during the time of cell culture was to be expected. Instead, we found an increase in sex-specific gene expression for some signaling pathways, such as serotonin and melatonin degradation. For the expression of genes related to androgen signaling, beta-oxidation, hepatic steatosis and amino acid degradation, even a reversal of the sex-specific gene expression could be shown.
In conclusion, this investigation reveals a connection between HH and mTOR signaling in hepatocytes. The repression of the HH pathway modulates mTOR signaling and results in impaired oxidative phosphorylation and autophagy. It is conceivable that the synergistic effect of HH and mTOR inhibition could be applied in targeted therapies. Furthermore, the culture of male and female primary hepatocytes demonstrate that sex differences change significantly over time. This should be considered when using primary hepatocytes for initial preclinical studies to analyze potential new drugs. Especially, the alterations in xenobiotic metabolism can have serious effects on pharmacodynamic processes. In addition, the enhancement or reversal of sex-specific expression of some genes in vitro suggests that there must be previously unknown mechanisms that modulate sexual dimorphism independently of the steroids and growth hormones known to date.:Table of Contents
1. Introduction
1.1 Characteristics of the liver
1.2 The hepatic sexual dimorphism
1.3 Interaction of signaling pathways in the liver
1.3.1 The Hedgehog pathway
1.3.2 The mTOR pathway
1.3.3 The role of HH and mTOR in diseases
1.4 Aim of the study
2. Publications
2.1 Cyclopamine and rapamycin synergistically inhibit mTOR signaling in mouse hepatocytes, revealing an interaction of hedgehog and mtor signaling in the liver
2.2 Sex-dependent dynamics of metabolism in primary mouse hepatocytes 33
3. Summary of the thesis
4. References
5. Attachments
5.1 List of abbreviations
5.2 Supplemental Material
5.2.1 Cyclopamine and rapamycin synergistically inhibit mTOR signaling in mouse hepatocytes, revealing an interaction of hedgehog and mtor signaling in the liver
5.2.2 Sex‑dependent dynamics of metabolism in primary mouse hepatocytes
5.3 Description of the author's own contribution
5.3.1 Cyclopamine and rapamycin synergistically inhibit mTOR signaling in mouse hepatocytes, revealing an interaction of hedgehog and mtor signaling in the liver
5.3.2 Sex‑dependent dynamics of metabolism in primary mouse hepatocytes
5.4 Statement of Authorship
5.5 Curriculum vitae
5.6 Publications
5.7 Acknowledgement
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Impaired Hepatic Fatty Acid Synthesis: A Potential Mechanism of the Reduced Growth Phenotype of Cystic Fibrosis Knockout MiceBragg, Sarah A. 14 June 2010 (has links)
No description available.
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β - Carotene 15,15-Oxygense 1 (BCO1) Distribution In Parenchymal And Non-Parenchymal Cells In Rat LiverRaghuvanshi, Shiva January 2010 (has links)
No description available.
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Evaluating the use of Cryopreserved Hepatocytes for the Prediction of In Vivo Hepatic ClearanceEng, Heather S. 25 August 2004 (has links)
No description available.
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Applications of a humanized Serum-Free cell culture medium in drug ADMET: A Primary Human Hepatocyte and Caco-2 Model StudyPrimpas, Lazaros Ilias January 2024 (has links)
This study investigates the efficacy of a newly developed humanized serum-free media (SFM) that replaces Fetal Bovine Serum (FBS), in culturing of common in vitro models (Caco-2 and 3D Primary Human Hepatocytes (PHH)). The research’s focus aligns with the 3R principles (replacement, reduction, refinement) and may potentially lead to enhancing the human relevance of the in vitro models and ultimately contribute to more accurate and successful drug development in the future. This study is divided into two subprojects, Caco-2 and 3D PHH, respectively. For Caco-2, we evaluated cell morphology, proliferation and monolayer formation by assessing the permeability of marker compounds. For PHH, we investigated spheroid formation and viability using an ATP measurement assay, lipid concentration using an Adipored Assay and CYP activity of the 3D PHH. Finally, global proteomics analysis was performed for both Caco-2 cells and 3D PHH grown in SFM and in conventional medium (CM). Our findings show that Caco-2 cells could proliferate well enough in the SFMCaco-2 without any change in their cell morphology, whereas their monolayer tightness was found to be similar in SFMCaco-2 as compared to CMCaco-2. Furthermore, from the proteomics analysis there was no major difference detected between cells in SFMCaco-2 and in CMCaco-2, however several of the relevant drug transporters of this model were found in higher levels in Caco-2 cultured in SFMCaco-2. For 3D PHH, our findings indicate that spheroids could be perfectly formed in both SFM3D PHH and in CM3D PHH, having relatable viability and lipid concentration, especially after two week of culturing period. Finally, the proteomics analysis revealed no significant difference between the proteome of the spheroids when cultured in SFM3D PHH or in CM3D PHH. In conclusion, these results suggest that the SFM provides a viable and sometimes superior alternative to CM for both Caco-2 and 3D PHH, promoting the 3R principles and potentially offering a more human-relevant model for in vitro studies.
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In vitro and in silico Predictions of Hepatic Transporter-Mediated Drug Clearance and Drug-Drug Interactions in vivoVildhede, Anna January 2015 (has links)
The liver is the major detoxifying organ, clearing the blood from drugs and other xenobiotics. The extent of hepatic clearance (CL) determines drug exposure and hence, the efficacy and toxicity associated with exposure. Drug-drug interactions (DDIs) that alter the hepatic CL may cause more or less severe outcomes, such as adverse drug reactions. Accurate predictions of drug CL and DDI risk from in vitro data are therefore crucial in drug development. Liver CL depends on several factors including the activities of transporters involved in the hepatic uptake and efflux. The work in this thesis aimed at developing new in vitro and in silico methods to predict hepatic transporter-mediated CL and DDIs in vivo. Particular emphasis was placed on interactions involving the hepatic uptake transporters OATP1B1, OATP1B3, and OATP2B1. These transporters regulate the plasma concentration-time profiles of many drugs including statins. Inhibition of OATP-mediated transport by 225 structurally diverse drugs was investigated in vitro. Several novel inhibitors were identified. The data was used to develop in silico models that could predict OATP inhibitors from molecular structure. Models were developed for static and dynamic predictions of in vivo transporter-mediated drug CL and DDIs. These models rely on a combination of in vitro studies of transport function and mass spectrometry-based quantification of protein expression in the in vitro models and liver tissue. By providing estimations of transporter contributions to the overall hepatic uptake/efflux, the method is expected to improve predictions of transporter-mediated DDIs. Furthermore, proteins of importance for hepatic CL were quantified in liver tissue and isolated hepatocytes. The isolation of hepatocytes from liver tissue was found to be associated with oxidative stress and degradation of transporters and other proteins expressed in the plasma membrane. This has implications for the use of primary hepatocytes as an in vitro model of the liver. Nevertheless, by taking the altered transporter abundance into account using the method developed herein, transport function in hepatocyte experiments can be scaled to the in vivo situation. The concept of protein expression-dependent in vitro-in vivo extrapolations was illustrated using atorvastatin and pitavastatin as model drugs.
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Kryokonservierung und Immortalisierung von primären bovinen und porzinen HepatozytenAndres, Sandra 15 June 2022 (has links)
Die Bedeutung geeigneter in vitro Modelle gewinnt im Hinblick auf die Reduktion von Tierversuchen getreu des 3R-Prinzips immer mehr an Bedeutung. Für viele Fragestellungen in Bezug auf den Lebermetabolismus bei Nutztieren bieten primäre bovine und porcine Hepatozyten ein vielversprechendes in vitro Modell. Die Verfügbarkeit von primären Hepatozyten ist aber, aufgrund ihrer besonderen Sensibilität, äußerst begrenzt. Die Kryokonservierung von primären Hepatozyten stellt eine Strategie dar die Verfügbarkeit dieser Zellen maßgeblich zu verbessern. Eine weitere Möglichkeit Hepatozyten haltbar zu machen, ist die Proliferationsinduktion und somit die Immortalisierung der Leberzellen.
Ziel dieser Arbeit war es, erstmals ein Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten zu etablieren. Darüber hinaus sollte überprüft werden ob die Proliferationsaktivität von primären bovinen und porcinen Hepatozyten durch eine Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder die Integration von humaner Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) mittels Lipofectamine®-Transfektion induziert werden kann.
Primäre Hepatozyten vom Rind und vom Schwein wurden von lebergesunden Spendertieren vergleichend mit einer zweischrittigen Kollagenaseperfusion gewonnen. Für die Etablierung des Kryokonservierungsprotokolls wurde zunächst die geeignete DMSO-Endkonzentration von 10 % ermittelt (n=3). Anschließend erfolgte die Kryokonservierung der Hepatozyten mit einer DMSO-Endkonzentration von 10 % und einer Konzentration von 20 % Fetalem Bovinem Serum vergleichend in William’s E Medium (WE) bzw. University of Wisconsin Medium (UW) mit und ohne Zusatz von 0,2 M Trehalose (T). Gleichzeitig wurde der Effekt einer computergesteuerten Einfriertechnik in einem Controlled-Rate-Freezer gegenüber einer manuellen Einfriertechnik mit Hilfe eines Gefrierbehälters evaluiert (n=6). Nach dem Auftauen wurde die Recovery (R, Zellzahl lebend aufgetauter Zellen im Vergleich zur Zahl der lebend eingefrorenen Zellen) und die Viabilität (V) der Hepatozyten mittels Trypanblaufärbung bestimmt, sowie die Kultivierbarkeit der Hepatozyten nach der Kryokonservierung untersucht.
Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, wurde im ersten Schritt ein geeignetes Transfektionsreagenz ermittelt, welches keine oder nur geringe zytotoxische Auswirkungen auf die Hepatozyten hat. Hierfür wurden die Hepatozyten in einer Monolayerkultur kultiviert und vergleichend mit Lipofectamine® 3000 und Lipofectamine® 2000 Reagenz behandelt (n=3). Anschließend erfolgte, mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz, eine Ko-Transfektion des eukaryotischen Plasmidvektors pCL-neo-hEST2 (hERT) sowie des fluoreszierenden eukaryotischen Plasmidvektors pmaxGFP™ in primäre bovine und porcine Hepatozyten. Die Überprüfung von Transfektionserfolg und -effizienz erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie an Tag 2 nach Ko-Transfektion (n=6). Darüber hinaus wurde überprüft, ob eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren „bovine hepatocyte growth factor“ (bHGF) und „bovine epithelial growth factor“ (bEGF) bei kultivierten primären bovinen Hepatozyten zu einer effektiven Stimulation ihrer Proliferationsaktivität führt.
Die Bestimmung der Signifikanzniveaus (P-Wert) erfolgte mittels One-way ANOVA Analyse mit Turkey-Test als Post-Hoc-Test, sowie der Two-Way ANOVA Analyse mit Šidák-Test als Post-Hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Als statistisch signifikant wurde ein Signifikanzniveau von P ≤ 0,05 gewertet.
Es konnte gezeigt werden, dass die computergesteuerte Einfriertechnik für die Kryokonservierung von primären bovinen und porcinen Hepatozyten einer manuellen Einfriertechnik deutlich überlegen ist (P < 0.0001). Im Hinblick auf die Wahl des Einfriermediums konnten für bovine Hepatozyten mit WE + T (V: 65,1 ± 8,3 %; R: 36,5 ± 6,0 %) und UW (V: 66,0 ± 11,2 %; R: 34,0 ± 8,9 %) und für porcine Hepatozyten mit UW (V: 76,8 ± 2,7 %; R: 69,7 ± 26,2 %) und UW + T (V: 64,4 ± 7,3 %;
R: 67,6 ± 26,1 %) die besten Ergebnisse erzielt werden. Im Gegensatz zu kryokonservierten porcinen Hepatozyten, konnten bovine Hepatozyten ihre Kultivierbarkeit nach der Kryokonservierung nicht beibehalten.
Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, konnte gezeigt werden, dass das Transfektionsreagenz Lipofectamine® 3000 für die Transfektion primärer boviner und porciner Hepatozyten aufgrund zytotoxischer Eigenschaften nicht geeignet ist. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz ein erfolgreiches Transfektionsprotokoll für primäre bovine und porcine Hepatozyten etabliert werden. Eine Induktion der Proliferationsaktivität durch die Integration von hTERT konnte allerdings nicht beobachtet werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren bHGF und bEGF allenfalls zu einer geringgradigen Steigerung der Proliferationsaktivität primärer boviner Hepatozyten in einer Kollagen-Monolayer-Kultur führt.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass das Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten weiter angepasst werden muss, um diese nach dem Tiefgefrieren brauchbar zu machen. Darüber hinaus sollte im Prozess der Etablierung einer Hepatozyten-Zelllinie aus primären bovinen bzw. porcinen Hepatozyten die Transfektion viraler Onkogene durchgeführt werden.:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3
2.2 Kryokonservierung 4
2.2.1 Geschichte 4
2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5
2.2.3 Kryoprotektiva 8
2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8
2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11
2.2.4 Einfriermedium 13
2.2.5 Kühlungsrate 14
2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15
2.2.7 Auftauen 15
2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17
2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19
2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19
2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20
2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23
2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24
2.3.3 Gentransfer 26
3 Tiere, Material und Methoden 28
3.1 Material 28
3.2 Spendertiere 28
3.3 Methoden 30
3.3.1 Leberentnahme Rind 30
3.3.2 Leberentnahme Schwein 30
3.3.3 Leberzellisolation 31
3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35
3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36
3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37
3.3.7 Kryokonservierung 38
3.3.7.1 Vorversuch 38
3.3.7.2 Hauptversuch 40
3.3.8 Transfektion 44
3.3.8.1 Vorversuch 44
3.3.8.2 Hauptversuch 47
3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50
3.4 Auswertung 51
3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51
3.4.2 Statistik 52
4 Ergebnisse 53
4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53
4.2 Kryokonservierung 55
4.2.1 Vorversuch 55
4.2.2 Hauptversuch 57
4.3 Transfektion 63
4.3.1 Vorversuch 63
4.3.2 Hauptversuch 67
4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73
5 Diskussion 77
5.1 Ausgangsmaterial 77
5.2 Kryokonservierung 79
5.2.1 DMSO-Konzentration 79
5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81
5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82
5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83
5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84
5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88
5.3 Transfektion 90
5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90
5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91
5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93
6 Ausblick 94
7 Zusammenfassung 96
8 Summary 98
9 Literaturverzeichnis 100
10 Anhang 119
10.1 Geräte 119
10.2 Chemikalien 120
10.3 Plasmide 123
10.4 Gas 123
10.5 Verbrauchsmaterialien 123
10.6 Original Temperatur-Kurven 126
11 Danksagung 129 / The importance of suitable in vitro models is gaining more and more importance with regard to the reduction of animal experiments true to the 3Rs principle. Primary bovine and porcine hepatocytes offer a promising in vitro model to study liver metabolism in farm animals. However, the availability of primary hepatocytes is extremely limited due to their particular sensitivity. Cryopreservation of primary hepatocytes illustrates one strategy to increase their availability. Another approach to preserve hepatocytes in vitro is to induce cell-proliferation resulting in an immortalized hepatocyte cell line.
This study aimed to establish for the first time a cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes. Furthermore, it should be verified whether proliferation activity can be induced by treatment with growth factors or integration of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) via Lipofectamine® transfection.
Primary bovine and porcine hepatocytes of liver healthy animals were obtained comparatively using a two-step collagenase-perfusion technique. For the establishment of the cryopreservation protocol, the appropriate final DMSO concentration of 10 % was first determined (n=3). Subsequently, cryopreservation of hepatocytes was performed comparatively in William's E medium (WE) and University of Wisconsin medium (UW) respectively, with and without the addition of
0.2 M trehalose (T) with a final DMSO concentration of 10% and a concentration of 20% fetal bovine serum. At the same time, the effect of a computer-controlled freezing technique in a controlled-rate freezer versus a manual freezing technique using a freezing container was evaluated (n=6). Cell-recovery (R, cell number of live thawed cells compared to the number of live frozen cells), as well as cell-viability (V) of cryopreserved hepatocytes was determined by trypan blue staining, after thawing. In addition, it was examined if cryopreserved hepatocytes maintain plateable after thawing.
For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, the first step was to determine a suitable transfection reagent that has no or only minor cytotoxic effects on the hepatocytes. For this purpose, hepatocytes were cultured in a monolayer culture and comparatively treated with Lipofectamine® 3000 and Lipofectamine® 2000 reagent (n=3). Subsequently, the eukaryotic plasmid vector pCL-neo-hEST2 (hTERT) plus fluorescent eukaryotic plasmid vector pmaxGFP™ were transfected into primary bovine and porcine hepatocytes using
Lipofectamine® 2000 reagent. Transfection success and efficiency was verified by fluorescence microscopy 2 days after co-transfection (n=6). Futhermore, it was examined whether treatment with bovine hepatocyte growth factor' (bHGF) and bovine epithelial growth factor (bEGF) leads to an effective stimulation of proliferation activity in cultured primary bovine hepatocytes
Significance levels (P value) were determined by one-way ANOVA analysis with Turkey test as post hoc test, and two-way ANOVA analysis with Šidák-test as post hoc test for multiple comparisons. A significance level of P ≤ 0.05 was considered statistically significant.
It was shown that a computer-controlled freezing technique is clearly superior to a manual freezing technique for the cryopreservation of primary bovine and porcine hepatocytes (P < 0.0001). With regard to the choice of the freezing medium, the best results were obtained for bovine hepatocytes with WE + T (V: 65.1 ± 8.3 %; R: 36.5 ± 6.0 %) and UW (V: 66.0 ± 11.2 %; R: 34.0 ± 8.9%) and for porcine hepatocytes with UW (V: 76.8 ± 2.7%; R: 69.7 ± 26.2%) and UW + T (V: 64.4 ± 7.3%;
R: 67.6 ± 26.1%). In contrast to cryopreserved porcine hepatocytes, bovine hepatocytes could not maintain their cultivability after cryopreservation.
For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, it was shown that the transfection reagent Lipofectamine® 3000 is not suitable for transfection of primary bovine and porcine hepatocytes due to cytotoxic properties. In contrast, a successful transfection protocol for primary bovine and porcine hepatocytes could be established using Lipofectamine® 2000 reagent. However, induction of proliferation activity by integration of hTERT could not be observed. Similarly, treatment with the growth factors bHGF and bEGF was shown to result in at most a modest increase in the proliferation activity of primary bovine hepatocytes in a collagen monolayer culture.
In conclusion, the cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes needs to be further adapted to make hepatocytes useful after deep freezing. Furthermore, transfection of viral oncogenes should be considered in the further process of establishing a hepatocyte cell line of primary bovine or porcine hepatocytes.:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3
2.2 Kryokonservierung 4
2.2.1 Geschichte 4
2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5
2.2.3 Kryoprotektiva 8
2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8
2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11
2.2.4 Einfriermedium 13
2.2.5 Kühlungsrate 14
2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15
2.2.7 Auftauen 15
2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17
2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19
2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19
2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20
2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23
2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24
2.3.3 Gentransfer 26
3 Tiere, Material und Methoden 28
3.1 Material 28
3.2 Spendertiere 28
3.3 Methoden 30
3.3.1 Leberentnahme Rind 30
3.3.2 Leberentnahme Schwein 30
3.3.3 Leberzellisolation 31
3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35
3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36
3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37
3.3.7 Kryokonservierung 38
3.3.7.1 Vorversuch 38
3.3.7.2 Hauptversuch 40
3.3.8 Transfektion 44
3.3.8.1 Vorversuch 44
3.3.8.2 Hauptversuch 47
3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50
3.4 Auswertung 51
3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51
3.4.2 Statistik 52
4 Ergebnisse 53
4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53
4.2 Kryokonservierung 55
4.2.1 Vorversuch 55
4.2.2 Hauptversuch 57
4.3 Transfektion 63
4.3.1 Vorversuch 63
4.3.2 Hauptversuch 67
4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73
5 Diskussion 77
5.1 Ausgangsmaterial 77
5.2 Kryokonservierung 79
5.2.1 DMSO-Konzentration 79
5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81
5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82
5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83
5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84
5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88
5.3 Transfektion 90
5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90
5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91
5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93
6 Ausblick 94
7 Zusammenfassung 96
8 Summary 98
9 Literaturverzeichnis 100
10 Anhang 119
10.1 Geräte 119
10.2 Chemikalien 120
10.3 Plasmide 123
10.4 Gas 123
10.5 Verbrauchsmaterialien 123
10.6 Original Temperatur-Kurven 126
11 Danksagung 129
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A novel pathway for VLDL assembly in the mouse liver / Ein neuer Stoffwechselweg zur Synthese von VLDL in der MausleberMleczko, Anna 02 November 2006 (has links)
No description available.
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