Das Ziel des humanen Leber Tissue Engineerings besteht darin, mittels induzierbarer, pluripotenter Stammzellen (iPS) transplantierbares, funktionales Lebergewebe in-vitro zu generieren. Neben der klinischen Anwendung, z. B. im Rahmen der endgradigen Leberzirrhose, sind zudem für die pharmakologische Forschung möglichst stabile und physiologische Kulturmodelle wichtig. Die hierfür notwendige genaue Kenntnis der extrazellulären Matrix (EZM) der Leber, einer komplexen Komposition verschiedener Proteinkomponenten, gilt jedoch als eine der Voraussetzungen für die Weiterentwicklung des Tissue Engineerings. Der bisherige Goldstandard ist die Verwendung von entweder purem Rattenschwanz-Kollagen (RTC), hauptsächlich bestehend aus fibrillärem Typ I Kollagen, oder Matrigel® (MG), einer kommerziell erhältlichen Matrixkombination verschiedener Basalmembrankomponenten, die jedoch beide in der jeweiligen Reinform keine adäquate EZM darstellen. Zudem liegen bis heute keine validen Daten über die exakt notwendigen Konzentrationsverhältnisse der einzelnen EZM-Komponenten für die Zellkultur vor. Die Aufgabenstellung dieser Arbeit war daher erstens die systematische Analyse des Einflusses verschiedener Kombinationen von RTC und MG auf Morphologie, Stabilität, Differenzierungsstatus und Funktionalität von primären, humanen Hepatozyten (PHH) und zweitens die Beantwortung der Frage nach einem bestimmten Mischverhältnis der beiden, welches die physiologische EZM-Zusammensetzung der Leber in-vitro am ehesten repräsentiert. Hierfür wurden insgesamt sechs verschiedene Matrices, zwei davon bestehend aus jeweils RTC und MG in Reinform sowie vier verschiedene Mischverhältnisse aus RTC mit ansteigendem MG-Anteil, zusammengestellt. Anschließend wurden frisch isolierte PHH auf diesen sechs Matrices in 2D-Technik kultiviert und an Tag 0, 2, 4 und 6 anhand der genannten Kriterien systematisch analysiert. Die Ergebnisse der untersuchten Metabolismusparameter sowie der analysierten Genexpressionen zeigten in Hinblick auf die Funktionalität und den Differenzierungsstatus der kultivierten PHH einen klaren Vorteil der kombinierten EZM gegenüber den jeweiligen puren Varianten. Die vielfach beschriebene Dedifferenzierung war in PHH, welche auf kombinierten Matrices kultiviert wurden, deutlich geringer ausgeprägt bzw. stabilisierten sich in diesen Zellen einzelne Parameter, wie z. B. die mitochondrialen Aktivitäten oder die Expressionen der Gene CDH1, ALB und CYP2C9 sogar vollständig. Dies war bei den Kulturen auf purem RTC oder MG nicht der Fall. Im Bereich der Morphologie stellten sich die Unterschiede anhand des Expressionsprofils von CK-18 sowohl auf Transkriptions- als auch auf Proteinebene weniger klar dar. Dennoch ließ sich der erste Punkt der Aufgabenstellung dieser Arbeit in der Gesamtbetrachtung der Resultate sehr eindeutig klären. Schwieriger gestaltete sich die Beantwortung der zweiten Fragestellung. Einzelne Daten, beispielsweise der mitochondrialen Aktivitäten sowie der verschiedenen Genexpressionen, zeigten bereits bei sehr geringer MG-Supplementation von lediglich 5% Vorteile, während eine Überlegenheit z. B. bei den Zellintegritätsparametern oder der Harnstoffsynthese erst ab einem MG-Anteil von 20% evident wurde. Die vorliegenden Daten sollten daher in künftigen Studien mittels 3D-Kulturen, auf welche hier zugunsten einer breiteren Analyse verzichtet wurde, validiert werden. Hierbei könnte das Optimierungspotential weiterer EZM-Komponenten und deren Einfluss auf Proteinebene evaluiert werden. Dies ließe sich z. B. in Metabolismusanalysen von Pharmaka umsetzen. Auch eine größere Donoranzahl wäre zur Verbesserung der statistischen Aussagekraft hilfreich. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit das deutliche Potential einer nachhaltigen Optimierung des bisherigen Goldstandards, nämlich der Verwendung von entweder RTC oder MG in der 2D-Kultur. Deshalb sollten die Daten der vorliegenden Experimente in künftigen Arbeiten um die genannten Punkte systematisch erweitert werden, um insbesondere die zweite Fragestellung und das Einflusspotential weiterer EZM-Proteine besser beantworten zu können.:I. INHALTSVERZEICHNIS II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III. EINFÜHRUNG 3.1 AUFBAU UND STRUKTUR DER LEBER 3.2 SINUSOIDALE EXTRAZELLULÄRE MATRIX 3.3 STABILITÄTS- UND DIFFERENZIERUNGSMARKER 3.3.1 Adhärenz- und Zellaktivitätsparameter 3.3.2 Enzymaktivitäten und weitere Metabolismusparameter 3.3.3 Cytochrom P450-Isoenzyme 3.3.4 Proteinbiosynthese 3.3.5 Differenzierungsfaktoren 3.3.6 Adhäsionsproteine und Intermediärfilamente 3.4 TISSUE ENGINEERING UND KLINISCHER BEZUG IV. AUFGABENSTELLUNG V. MATERIAL UND METHODEN 5.1 MATERIAL 5.1.1 Geräte 5.1.2 Verbrauchsmaterialien 5.1.3 Bestandsmaterialien 5.1.4 Chemikalien 5.1.5 Kits und gebrauchsfertige Sets 5.1.6 Puffer und Medien 5.1.6.1 Kulturmedien 5.1.6.2 Perfusionslösungen 5.1.6.3 Lysepuffer 5.1.7 Datenbanken und Software 5.2 METHODEN 5.2.1 Isolation primärer Leberzellen 5.2.2 Plattenbeschichtung und Kultivierung primärer Leberzellen 5.2.3 Zelladhärenz- und Aktivitätsbestimmung 5.2.4 Proteinquantifizierung 5.2.5 Photometrische Bestimmung weiterer Metabolismusparameter 5.2.6 Immunfluoreszenzfärbung 5.2.7 Ribonukleinsäure-Isolation 5.2.8 RNA-Quantifikation, Qualitätskontrolle und cDNA-Synthese 5.2.9 Quantitative Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion 5.2.10 Auswertung und Statistik VI. ERGEBNISSE 6.1 ERGEBNISSE DER ZELLISOLATION 6.2 METABOLISCHE AKTIVITÄT DER PHH 6.3 DIFFERENZIERUNGSSTATUS DER PHH AUF TRANSKRIPTIONSEBENE 6.3.1 mRNA-Expression von Genen hepatischer Differenzierungsmarker 6.3.2 mRNA-Expression von HNF4α und ausgewählter Cytochrom P450-Isoenzyme 6.4 MORPHOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER PHH VII. DISKUSSION 7.1 KOMBINIERTE MATRICES – EIN NEUER GOLDSTANDARD? 7.1.1 Einfluss der EZM auf den Metabolismus von PHH 7.1.2 Einfluss der EZM auf den hepatischen Differenzierungsstatus von PHH 7.2 HETEROGENITÄT DER LEBERPROBEN 7.3 RELEVANZ VON WACHSTUMSFAKTOREN IM MATRIGEL® 7.4 AUSBLICK VIII. ZUSAMMENFASSUNG IX. LITERATUR-, ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 9.1 LITERATURVERZEICHNIS 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9.3 TABELLENVERZEICHNIS X. ANLAGEN 10.1 ERGÄNZENDE ABBILDUNGEN UND TABELLEN 10.2 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 10.3 DANKSAGUNG

In dieser Studie wurden nicht-integrative Vektorkonstrukte zur Reprogrammierung von zwei menschlichen Zelllinien (HFF1, HUVEC) verwendet, um integrations-freie, episomal generierte iPSC Zelllinien (E-iPSCs) zu generieren. Darüber hinaus wurden diese iPSCs zu sogenannten Leberzell-ähnlichen Zellen (HLCs) differenziert. Hierzu konnten die verschiedenen Stufen der Hepatogenese und die potentielle Reifung zu Leberzellen untersucht sowie mit fötalen und ausgereiften menschlichen Leberzellen verglichen werden. Diese Studie konnte Gen-regulierende Netzwerke aufdecken, welche eine pi-potentiale Vorläuferpopulation in den HLCs präsentieren. Zusätzlich deckte das Transkriptions-Profil auf, dass die iPSC-generierten HLCs unreif und ähnlicher den fötalen Leberzellen sind. Dennoch weisen die HLCs typische funktionelle Charakteristika von Leberzellen auf, z.B. Glykogen-Einlagerung, Aufnahme und Abgabe von Substanzen wie ICG und CDFDA, Sekretierung von Gallensäure und Harnstoff. Zusätzlich konnten typische Leber-Strukturen wie Gallenkanälchen mit Mikrovilli, Fettspeicherung und sogenannte tight junctions, Verbindungsgänge zwischen den Zellen nachgewiesen werden. Um die potentielle Reifung dieser HLCs voranzutreiben, wurde eine Langzeit-Kultivierung von HUVEC-iPSC-generierten HLCs durchgeführt. Dies sollte zugleich zeigen, ob die HLCs länger kultiviert und gleichzeitig reifen können. Ein zweiter Teil dieser Studie befasst sich mit der Generierung von endodermalen Vorläuferzellen (EPs). Es wurden HFF1-iPSCs zu EPs differenziert um die endodermale Entwicklung vor der Entstehung der Gallenwege und des Hepatoblasten zu untersuchen. Die EPs zeigen Merkmale dafür, dass sie sowohl in Hepatozyten, Cholangozyten und auch Pankreaszellen differenziert werden können. Mit Hilfe dieser multipotenten EPs könnte es möglich sein die endodermale Entwicklung des Darmes, der Lunge, Leber, Gallengänge und Gallenblase sowie der Bauchspeicheldrüse näher zu untersuchen. / This project generated and characterized integration-free, episomal-derived induced pluripotent stem cell lines (E-iPSCs) from human somatic cell lines of different origins. Two different somatic cell lines were used, the human fetal fibroblast cell line HFF1 and human umbilical vein endothelial cell line HUVEC. Both were reprogrammed into integration-free iPSCs and were comparable amongst themselves and to human embryonic stem cells, the gold standard of pluripotent stem cells. Furthermore, the iPSCs with different genetic background were differentiated to hepatocyte-like cells (HLCs). With the use of iPSC-derived hepatocytes different stages during hepatogenesis and the potential of maturation could be analyzed as well as compared to fetal liver and primary human hepatocytes (PHH). This study could uncover gene regulatory networks which presence bipotential progenitor populations in HLCs. Additionally, comparable transcriptome profile analyses revealed that the iPSC-derived HLCs are immature and more similar to fetal liver. However, the HLCs hold typical functionality characteristics of hepatocyte, e.g. glycogen storage, uptake and release of ICG and CDFDA, bile acid and urea secretion. Furthermore, typical structures of hepatocytes such as bile canaliculi with microvilli, lipid storage and tight junctions are visible. In order to analyze the maturation potential of HLCs a long-term culture experiment was performed using HUVEC-iPSC-derived HLCs which implies the possibility for long-term culture of HLCs while increasing maturation. Additionally, HFF1-derived iPSCs were differentiated to endodermal progenitors (EPs) to analyze the endodermal development before biliary tree and hepatoblast which can give rise to hepatocytes, cholangiocytes and pancreatic cells. The multipotent EPs hold a great potential to analyze the endodermal development of intestine, lung, liver, bile duct and gallbladder, as well as pancreas.

Die Bedeutung geeigneter in vitro Modelle gewinnt im Hinblick auf die Reduktion von Tierversuchen getreu des 3R-Prinzips immer mehr an Bedeutung. Für viele Fragestellungen in Bezug auf den Lebermetabolismus bei Nutztieren bieten primäre bovine und porcine Hepatozyten ein vielversprechendes in vitro Modell. Die Verfügbarkeit von primären Hepatozyten ist aber, aufgrund ihrer besonderen Sensibilität, äußerst begrenzt. Die Kryokonservierung von primären Hepatozyten stellt eine Strategie dar die Verfügbarkeit dieser Zellen maßgeblich zu verbessern. Eine weitere Möglichkeit Hepatozyten haltbar zu machen, ist die Proliferationsinduktion und somit die Immortalisierung der Leberzellen. Ziel dieser Arbeit war es, erstmals ein Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten zu etablieren. Darüber hinaus sollte überprüft werden ob die Proliferationsaktivität von primären bovinen und porcinen Hepatozyten durch eine Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder die Integration von humaner Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) mittels Lipofectamine®-Transfektion induziert werden kann. Primäre Hepatozyten vom Rind und vom Schwein wurden von lebergesunden Spendertieren vergleichend mit einer zweischrittigen Kollagenaseperfusion gewonnen. Für die Etablierung des Kryokonservierungsprotokolls wurde zunächst die geeignete DMSO-Endkonzentration von 10 % ermittelt (n=3). Anschließend erfolgte die Kryokonservierung der Hepatozyten mit einer DMSO-Endkonzentration von 10 % und einer Konzentration von 20 % Fetalem Bovinem Serum vergleichend in William’s E Medium (WE) bzw. University of Wisconsin Medium (UW) mit und ohne Zusatz von 0,2 M Trehalose (T). Gleichzeitig wurde der Effekt einer computergesteuerten Einfriertechnik in einem Controlled-Rate-Freezer gegenüber einer manuellen Einfriertechnik mit Hilfe eines Gefrierbehälters evaluiert (n=6). Nach dem Auftauen wurde die Recovery (R, Zellzahl lebend aufgetauter Zellen im Vergleich zur Zahl der lebend eingefrorenen Zellen) und die Viabilität (V) der Hepatozyten mittels Trypanblaufärbung bestimmt, sowie die Kultivierbarkeit der Hepatozyten nach der Kryokonservierung untersucht. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, wurde im ersten Schritt ein geeignetes Transfektionsreagenz ermittelt, welches keine oder nur geringe zytotoxische Auswirkungen auf die Hepatozyten hat. Hierfür wurden die Hepatozyten in einer Monolayerkultur kultiviert und vergleichend mit Lipofectamine® 3000 und Lipofectamine® 2000 Reagenz behandelt (n=3). Anschließend erfolgte, mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz, eine Ko-Transfektion des eukaryotischen Plasmidvektors pCL-neo-hEST2 (hERT) sowie des fluoreszierenden eukaryotischen Plasmidvektors pmaxGFP™ in primäre bovine und porcine Hepatozyten. Die Überprüfung von Transfektionserfolg und -effizienz erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie an Tag 2 nach Ko-Transfektion (n=6). Darüber hinaus wurde überprüft, ob eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren „bovine hepatocyte growth factor“ (bHGF) und „bovine epithelial growth factor“ (bEGF) bei kultivierten primären bovinen Hepatozyten zu einer effektiven Stimulation ihrer Proliferationsaktivität führt. Die Bestimmung der Signifikanzniveaus (P-Wert) erfolgte mittels One-way ANOVA Analyse mit Turkey-Test als Post-Hoc-Test, sowie der Two-Way ANOVA Analyse mit Šidák-Test als Post-Hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Als statistisch signifikant wurde ein Signifikanzniveau von P ≤ 0,05 gewertet. Es konnte gezeigt werden, dass die computergesteuerte Einfriertechnik für die Kryokonservierung von primären bovinen und porcinen Hepatozyten einer manuellen Einfriertechnik deutlich überlegen ist (P < 0.0001). Im Hinblick auf die Wahl des Einfriermediums konnten für bovine Hepatozyten mit WE + T (V: 65,1 ± 8,3 %; R: 36,5 ± 6,0 %) und UW (V: 66,0 ± 11,2 %; R: 34,0 ± 8,9 %) und für porcine Hepatozyten mit UW (V: 76,8 ± 2,7 %; R: 69,7 ± 26,2 %) und UW + T (V: 64,4 ± 7,3 %; R: 67,6 ± 26,1 %) die besten Ergebnisse erzielt werden. Im Gegensatz zu kryokonservierten porcinen Hepatozyten, konnten bovine Hepatozyten ihre Kultivierbarkeit nach der Kryokonservierung nicht beibehalten. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, konnte gezeigt werden, dass das Transfektionsreagenz Lipofectamine® 3000 für die Transfektion primärer boviner und porciner Hepatozyten aufgrund zytotoxischer Eigenschaften nicht geeignet ist. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz ein erfolgreiches Transfektionsprotokoll für primäre bovine und porcine Hepatozyten etabliert werden. Eine Induktion der Proliferationsaktivität durch die Integration von hTERT konnte allerdings nicht beobachtet werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren bHGF und bEGF allenfalls zu einer geringgradigen Steigerung der Proliferationsaktivität primärer boviner Hepatozyten in einer Kollagen-Monolayer-Kultur führt. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass das Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten weiter angepasst werden muss, um diese nach dem Tiefgefrieren brauchbar zu machen. Darüber hinaus sollte im Prozess der Etablierung einer Hepatozyten-Zelllinie aus primären bovinen bzw. porcinen Hepatozyten die Transfektion viraler Onkogene durchgeführt werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129 / The importance of suitable in vitro models is gaining more and more importance with regard to the reduction of animal experiments true to the 3Rs principle. Primary bovine and porcine hepatocytes offer a promising in vitro model to study liver metabolism in farm animals. However, the availability of primary hepatocytes is extremely limited due to their particular sensitivity. Cryopreservation of primary hepatocytes illustrates one strategy to increase their availability. Another approach to preserve hepatocytes in vitro is to induce cell-proliferation resulting in an immortalized hepatocyte cell line. This study aimed to establish for the first time a cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes. Furthermore, it should be verified whether proliferation activity can be induced by treatment with growth factors or integration of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) via Lipofectamine® transfection. Primary bovine and porcine hepatocytes of liver healthy animals were obtained comparatively using a two-step collagenase-perfusion technique. For the establishment of the cryopreservation protocol, the appropriate final DMSO concentration of 10 % was first determined (n=3). Subsequently, cryopreservation of hepatocytes was performed comparatively in William's E medium (WE) and University of Wisconsin medium (UW) respectively, with and without the addition of 0.2 M trehalose (T) with a final DMSO concentration of 10% and a concentration of 20% fetal bovine serum. At the same time, the effect of a computer-controlled freezing technique in a controlled-rate freezer versus a manual freezing technique using a freezing container was evaluated (n=6). Cell-recovery (R, cell number of live thawed cells compared to the number of live frozen cells), as well as cell-viability (V) of cryopreserved hepatocytes was determined by trypan blue staining, after thawing. In addition, it was examined if cryopreserved hepatocytes maintain plateable after thawing. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, the first step was to determine a suitable transfection reagent that has no or only minor cytotoxic effects on the hepatocytes. For this purpose, hepatocytes were cultured in a monolayer culture and comparatively treated with Lipofectamine® 3000 and Lipofectamine® 2000 reagent (n=3). Subsequently, the eukaryotic plasmid vector pCL-neo-hEST2 (hTERT) plus fluorescent eukaryotic plasmid vector pmaxGFP™ were transfected into primary bovine and porcine hepatocytes using Lipofectamine® 2000 reagent. Transfection success and efficiency was verified by fluorescence microscopy 2 days after co-transfection (n=6). Futhermore, it was examined whether treatment with bovine hepatocyte growth factor' (bHGF) and bovine epithelial growth factor (bEGF) leads to an effective stimulation of proliferation activity in cultured primary bovine hepatocytes Significance levels (P value) were determined by one-way ANOVA analysis with Turkey test as post hoc test, and two-way ANOVA analysis with Šidák-test as post hoc test for multiple comparisons. A significance level of P ≤ 0.05 was considered statistically significant. It was shown that a computer-controlled freezing technique is clearly superior to a manual freezing technique for the cryopreservation of primary bovine and porcine hepatocytes (P < 0.0001). With regard to the choice of the freezing medium, the best results were obtained for bovine hepatocytes with WE + T (V: 65.1 ± 8.3 %; R: 36.5 ± 6.0 %) and UW (V: 66.0 ± 11.2 %; R: 34.0 ± 8.9%) and for porcine hepatocytes with UW (V: 76.8 ± 2.7%; R: 69.7 ± 26.2%) and UW + T (V: 64.4 ± 7.3%; R: 67.6 ± 26.1%). In contrast to cryopreserved porcine hepatocytes, bovine hepatocytes could not maintain their cultivability after cryopreservation. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, it was shown that the transfection reagent Lipofectamine® 3000 is not suitable for transfection of primary bovine and porcine hepatocytes due to cytotoxic properties. In contrast, a successful transfection protocol for primary bovine and porcine hepatocytes could be established using Lipofectamine® 2000 reagent. However, induction of proliferation activity by integration of hTERT could not be observed. Similarly, treatment with the growth factors bHGF and bEGF was shown to result in at most a modest increase in the proliferation activity of primary bovine hepatocytes in a collagen monolayer culture. In conclusion, the cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes needs to be further adapted to make hepatocytes useful after deep freezing. Furthermore, transfection of viral oncogenes should be considered in the further process of establishing a hepatocyte cell line of primary bovine or porcine hepatocytes.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129

Die Arbeit beschäftigt sich mit dem Problem der Fettlebererkrankung. In der Einleitung wird auf die aktuelle Relevanz der Gesundheitsstörung und Therapiemöglichkeiten eingegangen, insbesondere durch das, in der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 gebräuchliche Biguanid Metformin. Der Bezug zu molekularbiologischen Signalwegen wird hergestellt und verschiedene in vitro Modellsysteme werden vorgestellt. Anschließend wird auf die Herkunft und genetische Besonderheiten der verwendeten primären Maushepatozyten und Hepatomzellen eingegangen, bevor die angewandten Methoden vorgestellt werden. Zum Einsatz kam in dieser Arbeit vor allem die Lipidmessung mittels Fettrot, um das Ausmaß an Steatosis quantifizierbar zu machen. Im Ergebnisteil folgen zuerst Versuche zur Zytotoxizität der einzelnen Chemikalien und deren Einfluss auf intrazelluläre Energieniveaus, bevor der Einfluss auf die hepatozellulären Fetteinlagerungen im Detail untersucht wird. Unterstützt werden die Ergebnisse durch mikroskopische Bilder der Hepatozyten, welche die beschriebenen Effekte verdeutlichen. Insgesamt konnten folgende Thesen aufgestellt werden: • Zwischen primären Hepatozyten von Wildtyp- und Knockout-Mäusen, bestehen nach 24 stündiger Kultivierung Unterschiede bezüglich des intrazellulären Lipidgehaltes, welche sich nach 72 stündiger Kultivierungszeit nivellieren. • Metformin- und Fructoseinkubation senken den intrazellulären ATP-Gehalt, gleichzeitige Anwesenheit von Metformin und Glucose vermindern den Effekt. • Durch 72-stündige Inkubation der primären Hepatozyten und Behandlung mit Metformin konnte der intrazelluläre Lipidgehalt um circa 40% gesenkt werden. • Durch 72-stündige Inkubation der primären Hepatozyten mit Glucose konnte der intrazelluläre Lipidgehalt um circa 100% gesteigert werden. • Bei humanen Hepatomzellen (HuH7) konnte kein Metformin- und kein Glucoseeffekt beobachtet werden. • Der LXR-Agonist TO901317 wirkt auf den intrazellulären Lipidgehalt Metformin entgegen.

Der nach Leberoperation und -transplantation auftretende Ischämie-/ Reperfusionsschaden (I/R) und die konsekutive Inflammation des Lebergewebes stellen ein bedeutendes klinisches Problem dar. In der vorliegenden Arbeit wurden Einflüsse der warmen und kalten Ischämie (100% N2 bei 37°C bzw. 4°C) sowie der Exposition inflammatorischer Zytokine und Endotoxin (IL-1beta, 10 U/ml; IFN-gamma, 100 U/ml; TNF-alpha, 500 U/ml; LPS, 5 µg/ml) auf die Expression der Hämoxygenase-1 (HO- 1) mRNA und seines Proteins, einem Vertreter der Hitze-Schock-Proteine mit potentiell antioxidativer Wirkung, in humanen Hepatozytenprimärkulturen untersucht. Warme und kalte Ischämie stimulierten die HO-1 mRNA Expression in humanen Hepatozyten nach 0,5 bis 1h. Das HO-1 Protein wurde über 0,5-6h maximal exprimiert. Der Zellschaden, gemessen an der AST und LDH Freisetzung unter ischämischen Bedingungen wurde insbesondere nach 24 h beobachtet. Nach Zytokinexposition wurde die höchste Expressionsrate der mRNA durch IFN-gamma hervorgerufen, gefolgt von TNF-alpha, LPS und IL-1beta. Jedes einzelne Zytokin stimulierte die HO-1 mRNA Expression nach 0,5 h, erreichte ein Maximum nach 3 h und fiel nach 6 h ab. Nach Stimulation mit einem Zytokinmix (CM; IFN-gamma, TNF-alpha, IL-1beta, LPS) trat ein Maximum der HO-1 mRNA Expression erst nach 6 h ein, wobei ein signifikanter Zellschaden nach 12 h beobachtet wurde. Die HO-1 mRNA und Proteinexpression war nach Exposition von 6 h des Sauerstoffperoxides (H2O2, 200- 1000 µM) erhöht. Die HO-1 mRNA und Proteinexpression war nach S- nitrosoacetylpenicillamin (0.5 mM) Exposition, einem NO Donator, für 3-12 h verstärkt. Nach Cobalt-protoporphyrin (CoPP, 1µM) Exposition, einem potenten HO-1 Induktor, wurde eine erhöhte mRNA- und Proteinexpression beobachtet. Dass CoPP die HO-1 mRNA- und Proteinneusynthese induziert, konnte durch die selektive Blockade mit Actinomycin D und Cycloheximide bewiesen werden. Die Neusynthese konnte ebenfalls unter warmer und kalter Ischämie gezeigt werden. Hemin (10 µM), ein weiterer Induktor der HO-1, induzierte die HO-1 mRNA nach 3 h und das Protein nach 6 h. Die HO-1 Enzymaktivität wurde mittels Bilirubinbildung und Messung des Fe2+ Gehalts der Zellen bestimmt. Bei der Bilirubinbildung wurde die höchste Aktivität nach warmer Ischämie gemessen, gefolgt von kalter Ischämie, CM und der Kontrollgruppe. Die intrazelluläre Fe2+ Messung ergab ebenfalls die höchste Enzymaktivität nach warmer Ischämie. Die Vorbehandlung humaner Hepatozyten mit CoPP (1-50 µM) für 8 h, schützte die Zellen teilweise vor einer warmen und kalten Ischämie. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die pharmakologische Induktion der HO-1 somit bei großen allgemeinchirurgischen Eingriffen, wie der Leberteilresektion oder der Transplantation, einen protektiven Effekt entfalten könnte. / Hepatic injury induced by ischemia/ reperfusion (I/R) and inflammation following surgeries or transplantations creates important clinical problems. In this study, the effect of inflammatory conditions such as cytokine/ endotoxin exposure (IL-1beta, IFN-gamma, TNF-alpha, LPS), warm and cold ischemia on HO-1 mRNA and protein, a member of heat shock proteins, was investigated. It was observed that IFN-gamma caused the highest HO-1 mRNA expression, followed by TNF-alpha, LPS and IL- 1beta. Each stimuli increased HO-1 mRNA expression after 0.5 h, peaked at 3 h and decreased after 6 h. Highest HO-1 protein expression was observed after 0.5 to 1 h of stimulation with IFN-gamma, which was followed by LPS, TNF-alpha and IL-1beta. The peak of HO-1 expression using all four stimuli (CM) was after 6 h. CM caused a significant increase in LDH and AST after 12 h. Warm and cold ischemia stimulated HO-1 mRNA expression in human hepatocytes at 0.5-1 h. HO-1 protein expression had its maximum between 0.5-6 h. Cellular damage measured as the release of LDH and AST was significant after 24 h. Mimicking oxydative stress, hepatocytes were exposed to 200-1000 µM H2O2 for 6 h which also showed an increased HO-1 mRNA and protein expression. HO-1 mRNA and protein expression revealed an increase after SNAP exposure at 3-12 h. Results with CoPP (10 µM), a potent inducer of HO- 1, displayed an increase in HO-1 mRNA and protein expression. It was proved, that CoPP induced new synthesis of mRNA and protein by its blocking agents such as actinomycin D and cycloheximide, respectively. Hemin (10 µM), another inducer of HO-1, triggered HO-1 mRNA expression after 3 h and protein expression after 6 h. The HO-1 enzyme activity was measured by bilirubin production after exposure to CM, as well as warm and cold ischemia. The highest enzyme activity was found after warm ischemia, followed by cold ischemia, CM and then by the control group. Fe2+ content of the cells, used as another method to judge HO-1 activity, confirmed our findings. Pre-treatment of human hepatocytes with different concentrations of CoPP (1-50 µM) protect cells against warm or cold ischemia. Therefore, we conclude that pharmacological induction of HO-1 may have therapeutic potential under inflammatory conditions such as seen during liver resection or liver transplantation.

Hämoxygenasen (HO) katalysieren unter der Aufnahme von molekularen Sauerstoff und der Freisetzung von Kohlenmonoxid (CO) und Eisen (Fe2+) die Oxidation von Häm zu Biliverdin. HO-1, eine induzierbare Isoform der HO, wird durch ihre Aktivität mit zellschützenden, antiinflammatorischen und antiapoptotischen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Dabei gilt insbesondere das CO als Mediator dieser Eigenschaften. Die molekularen Wechselwirkungen und genregulatorischen Funktionen von CO sind allerdings noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurden mittels cDNA Microarray-Technologie Gene identifiziert, die in der murinen Leber nach Inhalation von CO oder nach pharmakologischer Induktion von mHO-1 eine differentielle Expression der mRNA aufwiesen. Diese Gene konnten in einen Zusammenhang mit der circadianen Uhr gebracht werden und führten zu der Hypothese, dass CO einen direkten Einfluss auf den molekularen Oszillator der Inneren Uhr hat. Dies konnte in primären Hepatozyten durch eine veränderte circadiane Expression der essentiellen Uhrgene mPer2 und mRev-erba nach CO-Behandlung bestätigt werden. Weiterhin wurde für mHo-1 eine, bisher unbekannte, circadian regulierte Genexpression in primären Hepatozyten und der murinen Leber gezeigt. Es konnte die Funktionalität einer speziesübergreifend, konservierten E-Box im Promotor von mHo-1 nachgewiesen werden, die diese Regulation initiieren kann. Bezüglich der circadianen Oszillation von essentiellen Komponenten der circadianen Uhr zeigten mHo-1 Knockout-Fibroblasten eine veränderte Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren eine enge Kopplung des Häm-Metabolismus mit der circadianen Uhr. HO-1 scheint dabei in diesem regulativen Netzwerk eine funktionale Rolle zu spielen. Einerseits könnte diese Verbindung eine weitere Kommunikation der circadianen Uhr mit metabolischen Prozessen darstellen und bietet andererseits eine neue Sichtweise bezüglich der Aufklärung der zellschützenden Eigenschaften von HO-1. / Heme oxygenases (HO) catalyze the oxidation of heme and generate the bile pigment biliverdin, ferric iron and carbon monoxide (CO). Endogenous produced CO, especially due to the activity of the inducible isoform HO-1, has been associated with cytoprotective, anti-inflammatory and –apoptotic functions. CO is a signalling molecule, but the molecular interactions and gene regulatory functions are still unknown. In the present thesis a cDNA microarray identified genes in murine liver which were expressed differentially after inhalation of CO and pharmacological induction of HO-1. Interestingly, the expression of the candidate genes is directly controlled by the molecular circadian clockwork, and led to the hypothesis that CO has an influence on the molecular oscillator of the circadian clock. It was shown, that CO influences the gene expression of essential clock genes in primary hepatocytes. Furthermore, it was demonstrated that the gene expression and activity of mHO-1 is circadian regulated in primary hepatocytes and liver, and is reasonably based on a functional E-box in the promoter of the mHO-1 gene. The deficiency of HO-1 in HO-1 knockout mice displayed differential gene expression profiles in magnitude and amplitude of the circadian oscillations of essential clock and output genes. In this work it was shown, that the heme metabolism is coupled very close to the molecular circadian oscillator. HO-1 plays a functional role in the regulation of this regulatory network, which could provide insights into the understanding of cytoprotective properties of HO-1.

Die evolutionär konservierten morphogenen Signalwege Wnt/β-Catenin und Hedgehog (Hh) spielen vor allem in der Embryogenese, Zelldifferenzierung und Kanzerogenese eine große Rolle. Es ist bekannt, dass es zwischen Komponenten der beiden Signalkaskaden zu verschiedensten Wechselwirkungen und Hintergrundreaktionen in unterschiedlichsten Organismen und Geweben kommt. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung einzelner mole- kularer, transkriptioneller Prozesse hinter diesen Kreuzreaktionen in primären Hepatozyten und dem Hepatozellulären Karzinom. Dafür sind die beiden Signalwege durch verschiedenste Einflüsse, wie dem Einsatz von siRNAs, transgenen Mausmodellen und rekombinanten Proteinen gegen einzelne Faktoren der Hedgehog, aber auch der Wnt/β-Catenin Kaskade in ihrer Genexpression verändert und die Reaktionen der Signalwegskomponenten mittels der quantitativen Real-Time-PCR untersucht worden. Neben dem Organismus Maus haben einzelne vergleichende Experimente auch auf der humanen Ebene zum Erkenntnisgewinn beigetragen. Durch die Einflussnahme auf den Hedgehog Signalweg in murinen Hepatozyten wird deutlich, dass die Antworten auf die einzelnen Veränderungen in den Signalkaskaden sehr vielschichtig und umfangreich sind. Abhängig vom induzierten bzw. reprimierten Gen, aber auch vom gelenkten Signalweg variieren die Genexpressionen auf unterschiedlichste, und zum Teil gegenläufige Weise. Ferner wird deutlich, dass es zu Unterschieden in der Genantwort bezüglich der verschiedenen Organismen Maus und Mensch, aber auch zu Variationen der Interaktionen in den diversen Gewebe bzw. Zelltypen kommt.

Die Arbeit beschäftigt sich mit dem Problem der Fettlebererkrankung. In der Einleitung wird auf die aktuelle Relevanz der Gesundheitsstörung und Therapiemöglichkeiten eingegangen, insbesondere durch das, in der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 gebräuchliche Biguanid Metformin. Der Bezug zu molekularbiologischen Signalwegen wird hergestellt und verschiedene in vitro Modellsysteme werden vorgestellt. Anschließend wird auf die Herkunft und genetische Besonderheiten der verwendeten primären Maushepatozyten und Hepatomzellen eingegangen, bevor die angewandten Methoden vorgestellt werden. Zum Einsatz kam in dieser Arbeit vor allem die Lipidmessung mittels Fettrot, um das Ausmaß an Steatosis quantifizierbar zu machen. Im Ergebnisteil folgen zuerst Versuche zur Zytotoxizität der einzelnen Chemikalien und deren Einfluss auf intrazelluläre Energieniveaus, bevor der Einfluss auf die hepatozellulären Fetteinlagerungen im Detail untersucht wird. Unterstützt werden die Ergebnisse durch mikroskopische Bilder der Hepatozyten, welche die beschriebenen Effekte verdeutlichen. Insgesamt konnten folgende Thesen aufgestellt werden: • Zwischen primären Hepatozyten von Wildtyp- und Knockout-Mäusen, bestehen nach 24 stündiger Kultivierung Unterschiede bezüglich des intrazellulären Lipidgehaltes, welche sich nach 72 stündiger Kultivierungszeit nivellieren. • Metformin- und Fructoseinkubation senken den intrazellulären ATP-Gehalt, gleichzeitige Anwesenheit von Metformin und Glucose vermindern den Effekt. • Durch 72-stündige Inkubation der primären Hepatozyten und Behandlung mit Metformin konnte der intrazelluläre Lipidgehalt um circa 40% gesenkt werden. • Durch 72-stündige Inkubation der primären Hepatozyten mit Glucose konnte der intrazelluläre Lipidgehalt um circa 100% gesteigert werden. • Bei humanen Hepatomzellen (HuH7) konnte kein Metformin- und kein Glucoseeffekt beobachtet werden. • Der LXR-Agonist TO901317 wirkt auf den intrazellulären Lipidgehalt Metformin entgegen.

In vitro liver models allow the investigation of the cell behavior in disease conditions or in response to changes in the microenvironment. A major challenge in liver tissue engineering is to mimic the tissue-level complexity: besides the selection of suitable biomaterial(s) replacing the extracellular matrix (ECM) and cell sources, the three-dimensional (3D) microarchitecture defined by the fabrication method is a critical factor to achieve functional constructs. In this study, coaxial extrusion-based 3D bioprinting has been applied to develop a liver sinusoid-like model that consists of a core compartment containing pre-vascular structures and a shell compartment containing hepatocytes. The shell ink was composed of alginate and methylcellulose (algMC), dissolved in human fresh frozen plasma. The algMC blend conferred high printing fidelity and stability to the core–shell constructs and the plasma as biologically active component enhanced viability and supported cluster formation and biomarker expression of HepG2 embedded in the shell. For the core, a natural ECM-like ink based on angiogenesis-supporting collagen-fibrin (CF) matrices was developed; the addition of gelatin (G) enabled 3D printing in combination with the plasma-algMC shell ink. Human endothelial cells, laden in the CFG core ink together with human fibroblasts as supportive cells, formed a pre-vascular network in the core in the absence and presence of HepG2 in the shell. The cellular interactions occurring in the triple culture model enhanced the albumin secretion. In conclusion, core–shell bioprinting was shown to be a valuable tool to study cell–cell-interactions and to develop complex tissue-like models.

The liver is a multi-functional organ that regulates major physiological processes and that possesses a remarkable regeneration capacity. After loss of functional liver mass the liver grows back to its original, individual size through hepatocyte proliferation and apoptosis. How does a single hepatocyte ‘know’ when the organ has grown to its final size? This work considers the initial growth phase of liver regeneration after partial hepatectomy in which the mass is restored. There are strong and valid arguments that the trigger of proliferation after partial hepatectomy is mediated through the portal blood flow. It remains unclear, if either or both the concentration of metabolites in the blood or the shear stress are crucial to hepatocyte proliferation and liver size control. A cell-based mathematical model is developed that helps discriminate the effects of these two potential triggers. Analysis of the mathematical model shows that a metabolic load and a hemodynamical hypothesis imply different feedback mechanisms at the cellular scale. The predictions of the developed mathematical model are compared to experimental data in rats. The assumption that hepatocytes are able to buffer the metabolic load leads to a robustness against short-term fluctuations of the trigger which can not be achieved with a purely hemodynamical trigger.