Orientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/09/2016 / Inclui referências : f. 83-92 / Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma proteobacteria endofítica e fixadora de nitrogênio capaz de acumular polihidroxibutirato. O polihidroxibutirato é um poliéster produzido por diversos tipos de bactéria e é utilizado como reserva de carbono além de atuar na resposta ao estresse ambiental. Este polímero vem sendo utilizado como substituto a materiais plásticos derivados de petróleo, graças as suas características termoplásticas semelhantes às do polipropileno e polietileno e, também devido a sua alta biodegradabilidade. A biossíntese do polímero é altamente dependente da concentração do cofator NADPH. Este estudo visa avaliar estratégias para melhoria na produção de PHB por Herbaspirillum seropedicae SmR1 através da aplicação de técnicas de engenharia metabólica. As estratégias testadas consistem na expressão de genes heterólogos gnd de Escherichia coli MG1655 e gap2 de Synechococcus elongatus PCC 7942, sob controle de promotores endógenos, para modificar os fluxos do metabolismo central de carbono de H. seropedicae de forma a gerar mais cofator reduzido por molécula de substrato consumida. Os genes gnd e gap2 codificam a 6-fosfogluconato desidrogenase e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase NADP+-dependente, respectivamente. Ambas as enzimas geram NADPH como subproduto e não tem homólogos correspondentes no genoma de H. seropedicae SmR1. Observou-se que a expressão dos genes afeta de forma negativa o crescimento e pode provocar mutações, sendo tais fenótipos dependentes da atividade dos genes heterólogos e por consequência, da força da transcrição dos mesmos. Realizando experimento de evolução induzida com a estirpe expressando gnd, obteve-se um mutante com capacidade de crescimento superior a estirpe selvagem, que ainda mantem a atividade do gene e maior produtividade de PHB. / Abstract: Herbaspirillum seropedicae is an endophytic betaproteobacteria capable to fix nitrogen and to accumulate polyhydroxybutyrate. Polyhydroxybutyrate is a kind of polyester produced by a variety of bacteria, serving as energy reserve and is involved in the environmental stress response of the bacteria. This polymer is used as substitute for oil-based plastics, due to its similar thermoplastic proprieties and fast biodegradability in the environment. The PHB biosynthesis is highly dependent on intracellular NADPH concentration. This study evaluated the expression of NADPH-generating enzyme as an strategy to increase PHB production in Herbaspirillum seropedicae SmR1 through metabolic engineering. Strategies applied in this study involve heterologous expression of gnd from Escherichia coli MG1655 and gap2 from Synechococcus elongatus PCC 7942, under control of endogenous promoter sequences in order to modify the carbon flux through the central carbon metabolism of H. seropedicae in order to generate extra NADPH molecules per substrate of molecule consumed. It was not identified any homologous to these genes in the genome of H. seropedicae SmR1 and we have observed that the expression of such genes severely depressed growth and stimulated the occurrence of mutation. These phenotypes are strongly correlated with heterologous gene activity, and as consequence, with the transcriptional strength of the promoters. By performing induced evolution experiments, we have obtained a mutant capable of superior growth relative to the parental strain, which still exhibits heterologus gene activity as well as increased productivity of PHB.

Resumo: Herbaspirillum seropedicae SmR1 é uma ?-proteobactéria capaz de colonizar de forma endofítica diversas plantas de interesse comercial, sugerindo o seu uso como um potencial biofertilizante. Este trabalho é apresentado em dois blocos que descrevem a caracterização de proteínas de H. seropedicae SmR1 envolvidas no metabolismo do polímero polihidroxibutirato (PHB) e na regulação pós-transcricional da expressão gênica, com o objetivo de explorar os mecanismos regulatórios destas proteínas do ponto de vista molecular e estrutural. O capítulo 1 descreve a caracterização das proteínas PhbF e PhaP1 envolvidas no metabolismo de PHB. A capacidade de produzir este poliéster alifático é um importante fator associado à sobrevivência no ambiente em condições de estresse e competitividade com outras bactérias. Este polímero é estocado no interior das células na forma de grânulos cobertos por uma camada de várias classes de proteínas que regulam desde a produção/degradação do polímero, passando por seu tamanho e chegando a transcrição. PhbF está relacionada com a regulação transcricional e PhaP1 ou fasina está envolvida na regulação da relação volume/superfície dos grânulos. Estas proteínas foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli e purificadas com sucesso na forma fusionada a uma cauda de histidinas, utilizando o detergente TritonX-100. Experimentos de gel filtração revelaram PhbF como uma proteína tetramérica e PhaP1 como uma proteína pentamérica, ambas em solução. A proteína PhbF foi capaz de ligar-se a onze prováveis regiões promotoras de genes envolvidos com o metabolismo de PHB em H. seropedicae, confirmando a sua atividade de ligação ao DNA. A análise in silico destas regiões promotoras indicou a sequência consenso 5`-TG[N]TGC[N]3GCAA-3` que foi protegida da ação da DNaseI na região promotora de phbF. Esta proteína foi também capaz de ligar-se ao polímero PHB extraído de H. seropedicae assim como PhaP1. A fasina interagiu fortemente com o PHB e foi capaz de aderir a um filme deste polímero onde foram observadas várias estruturas proteicas individualizadas com dimensão lateral média de 177,8 ± 11,7 Å. Esta dimensão é compatível com a distância máxima de 200 Å calculada para PhaP1 em solução pelo método de SAXS. Esta técnica permitiu também acessar o envelope molecular das proteínas PhbF e PhaP1. Aspectos in vivo relacionados à correlação entre o metabolismo de PHB e a transcrição dos genesphbF e phaP1 foram abordados através de fusões transcricionais ao gene lacZ. PhbF foi capaz de reprimir a sua própria expressão e a do gene phaP1 em E. coli sem a interferência do polímero PHB. Em H. seropedicae, foi possível observar o acoplamento entre a expressão dos genes phbF e phaP1 ao metabolismo de PHB assim como a mobilidade da proteína PhbF entre as formas ligada ao DNA e ligada ao grânulo de PHB. O capítulo 2 descreve a caracterização da chaperona de RNA Hfq de H. seropedicae. Esta é uma proteína homohexamérica, identificada em E. coli como um fator do hospedeiro envolvido na replicação do bacteriófago Q? e como um importante regulador pós-transcricional de vários tipos de RNA afetando uma série de funções bacterianas. A estrutura da proteína Hfq foi determinada por cristalografia de raios-X e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). A estrutura cristalográfica revelou uma topologia do tipo Sm conservada, composta por uma ?-hélice N-terminal seguida de cinco fitas ?, e uma nova interação intra-subunidades do tipo empilhamento ?-? entre dois resíduos de histidinas ausente em outras Hfqs com estrutura resolvida. Além disso, o envelope molecular calculado com base nos dados de SAXS concordou com a estrutura cristalográfica, sugerindo que a proteína tem a mesma

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo quantificar a expressão de genes responsáveis pelo metabolismo de nitrato em H. seropedicae, estirpes SmR1 e DCP286A (ntrC-), por PCR quantitativo em tempo real. A quantificação dos níveis de expressão nas estirpes SmR1 e DCP286A demonstraram que o transportador de nitrato NasFED tem sua expressão dependente de nitrato, possivelmente controlada pela proteína NtrC e ativação dependente da proteína NasR. Os genes narK1UnarGHJI estão organizados em um operon e sua expressão depende de NtrC, da proteína FNR e ainda da proteína NarL. Os genes narKnirBDCnasA também estão organizados em um operon e sua expressão possivelmente está sob o controle de NtrC e de NasR. A expressão genes do sistema de dois componentes narXL parece ser dependente de NtrC, porém os sítios promotores encontrados são fracos. A expressão do gene nasR ainda não está clara, porém a presença de grampos terminadores de transcrição sugerem uma possível auto-regulação. A expressão do gene ntrY na estirpe SmR1 se demonstrou constitutiva e a diminuição da expressão na estirpe DCP286A sugere uma possível dependência da proteína NtrC para expressão de ntrY, porém os dados obtidos não são suficientes para elucidar o papel deste gene no metabolismo de nitrato em H. seropedicae.

Orientador : Profª. Drª. Maria Berenice Reynaud Steffens / Coorientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/05/2015 / Inclui referências: f. 115-136 / Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria da classe Betaproteobacteria que pode colonizar plantas de forma endofítica e epifítica, e promover o crescimento vegetal. Esta propriedade está relacionada à sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico, produzir fitormônios e colonizar o interior dos tecidos vegetais. Além disso, produz polihidroxialcanoatos (PHAs), uma classe de polímeros biodegradáveis constituídos de resíduos de ácidos 3-hidroxialcanóicos sintetizados como reserva de energia e carbono. O polihidroxibutirato (PHB) é o PHA melhor caracterizado. Este polímero é sintetizado em condições limitantes de crescimento e é armazenado na forma de grânulos no interior da célula bacteriana. O genoma de Herbaspirillum seropedicae SmR1 apresenta 13 genes potencialmente envolvidos no metabolismo de PHA, dentre os quais quatro foram anotados como codificadores de PHA sintases. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel das PHA sintases de H. seropedicae codificadas pelos genes phaC1, 2, 3 e 4, bem como, os efeitos fisiológicos causados pela ausência deste polímero. O nível de transcrição destes genes foi avaliado nas estirpes selvagem SmR1 e ?phaC1 (deficiente na síntese de PHB), contendo fusões transcricionais com o gene repórter lacZ. Somente o promotor phaC2 no mutante ?phaC1 apresentou expressão inferior. Um possível efeito da proteína reguladora PhaR ou da proteína sensora de níveis redox, Fnr, na baixa taxa de transcrição de phaC2, na estirpe ?phaC1, foi investigado. Não houve alteração do nível de expressão dos genes phaC no mutante ?phaR. Também não houve expressão diferencial dos genes phaC1, 3 e 4 nos mutantes ?fnr, mas phaC2 foi reprimido principalmente nos mutantes fnr1 e 3. Estes resultados sugerem que a expressão do gene phaC2 seja dependente de Fnr e não de PhaR. Como o gene phaC2 apresentou baixo nível de transcrição nas estirpes ?phaC1 e ?fnr, foi investigado se a expressão diminuída de phaC2 estaria relacionada com a ausência de PHB e se esta ausência poderia afetar negativamente a atividade de Fnr. Todos os mutantes ?fnr produziram quantidades de PHB similares a estirpe selvagem SmR1 e isto indica que que é a deleção dos genes fnr que afeta a transcrição de phaC2 e não a ausência de PHB. Assim, conclui-se que é a deleção dos genes fnr que afeta a transcrição de phaC2 e não a ausência de PHB. Ensaios com fusões transcricionais fnr1-lacZ e fixNlacZ, cujas expressões dependem de Fnr, mostraram que ambos os genes apresentam expressão diminuída na estirpe ?phaC1, indicando um efeito negativo da ausência de PHB na atividade de Fnr. Em relação à fixação biológica de nitrogênio (BNF), a estirpe ?phaC1 apresentou uma redução de 89% na capacidade de reduzir o acetileno e isto indica que a mutação também interfere na BNF. Em relação à sensibilidade ao estresse oxidativo, a estirpe ?phaC1 foi mais sensível ao metilviologênio (gerador de superóxido) e produziu mais EROs que a estirpe SmR1, em condições padrão de crescimento. O ambiente desfavorável provocado pela produção mais elevada de EROs pela estirpe ?phaC1 afeta negativamente os grupamentos Fe-S das metaloproteínas como Fnr e Nitrogenase. Provavelmente, o metabolismo do PHB em H. seropedicae funcione como um ciclo que pode estocar carbono e oxidar NADPH durante sua síntese e liberar carbono e reduzir NAD+ durante sua mobilização. Este metabolismo modula a disponibilidade de equivalentes redutores que reduzem o estresse oxidativo, que é um desiquilíbrio do controle e da sinalização do estado redox. Os resultados desta Tese mostram a importância da produção de PHB no controle oxidativo e na proteção das proteínas Fnr e Nitrogenase e poderão contribuir para a elucidação do controle redox via a produção de PHB também em outras bactérias produtoras deste polímero, sugerindo uma nova função ao PHB além de estoque de carbono e energia. Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae; PHA sintases; PHB. / Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a bacterium that belongs to â-proteobacteria class, which is able to establish endophityc associations and to promote plant growth. This property is related to its ability to fix atmospheric nitrogen and to produce phytohormones. Furthermore, it produces polyhydroxyalkanoates (PHAs), which are a class of biodegradable polymers containing 3-hydroxyalkanoic acid monomers synthesized as a carbon and energy source. PHB is the best characterized PHA. This polymer is synthesized under limited nutrient conditions and stored as granules inside bacteria cells. The genome of H. seropedicae SmR1 revealed 13 genes potentially involved in PHA metabolism and 4 of these were annotated as PHA synthases. The aim of this work was to investigate the role of the PHA synthases from H. seropedicae encoded by phaC1, 2, 3 and 4 genes, as well as physiological effects produced by the absence of this polymer. Transcription level of these genes was evaluated in wild-type SmR1 and ÄphaC1, which does not produce PHB, carrying out lacZ transcriptional fusions. The phaC2 promoter showed lower expression only in ÄphaC1 mutant. A possible effect of transcriptional regulators PhaR and/or Fnr in lower transcription in ÄphaC1 strain was investigated. There was not expression change of phaC genes in ÄphaR mutant. There was not expression change of phaC1, 3 e 4 genes in Äfnr mutants either, but phaC2 was repressed mainly fnr1 and 3 mutants. These results suggest that phaC2 showed an Fnr-dependent expression and independent of PhaR. Since phaC2 did shown low transcription in ÄphaC1 and Äfnr mutant strains, it was investigated if low expression of phaC2 would be related to the PHB absence and/or if the lacking of PHB would affect negatively the Fnr activity. The PHB accumulation was measured in Äfnr mutants and all of them produced similar PHB moieties as compared to SmR1. Therefore, it is possible to conclude that the fnr deletions, instead the lack of PHB, affect the phaC2 transcription. Assays with fnr1-lacZ e fixN-lacZ transcriptional fusions, whose expressions depend on Fnr, showed that both genes exhibited lower expression in ÄphaC1 strain, indicating a negative effect of PHB absence in the Fnr activity. With regard to biological nitrogen fixation (BNF), ÄphaC1 strain showed an 89% reduction in acetylene reduction, indicating that the lack of PHB affects BNF as well. Concerning sensitivity to oxidative stress, the ÄphaC1 was more susceptible to methyl viologen (a superoxide generator) and produces more ROS than SmR1. The unfavorable environment created by more elevated production of ROS in ÄphaC1 strain affects negatively the Fe-S cluster of metalloproteins, such as Fnr and nitrogenase. Possibly PHB metabolism in H. seropedicae functions as cycle which can store carbon and oxidize NADPH in its synthesis and, release carbon and reduce NAD+ in its mobilization. This metabolism modulates the availability of reducing equivalents that alleviates the oxidative stress, which is a disruption of redox signaling and control. The results of this work showed the importance of PHB synthesis in oxidative control and possibly for protection of metalloproteins, and may contribute to elucidate the redox control through PHB synthesis in other PHB-accumulating bacteria, bring a new function to PHB further the carbon and energy storage. Key-words: Herbaspirillum seropedicae; PHA synthases; PHB.

Orientadora : Profª. Drª. Rose Adele Monteiro / Coorientador : Profª. Drª. Maria Berenice R. Steffens / Coorientador :Dr. Marcelo Bueno Batista / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/09/2016 / Inclui referências : f. 71-81 / Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio, Gram negativa, pertencente à classe ? do filo Proteobacteria, encontrada associada a várias plantas de interesse econômico como milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), sorgo (Sorghum bicolor), trigo (Triticum aestivum), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), entre outras. No genoma de H. seropedicae SmR1 foram anotados cinco genes possivelmente codificadores de globinas do tipo hemoglobinas truncadas (Hsero_0935, Hsero_1880, Hsero_2698, Hsero_2855 e Hsero_2872), sendo que dois deles (Hsero_2855 e Hsero_2872) estão dentro do cluster nif. A família das hemoglobinas truncadas (trHb) é constituída de pequenas hemeproteínas ligadoras de oxigênio, distribuídas em bactérias, plantas e eucariotos unicelulares, em concentração intracelular de nano a micromolar e, geralmente, contém 20 a 40 resíduos de aminoácidos a menos que as hemoglobinas de vertebrados. São classificadas em três grupos: I (N ou trHbN), II (O ou trHbO) e III (P ou trHbP), e recentemente sugeriram a existência de um pequeno grupo nomeado como IV (Q ou trHbQ). Alguns organismos que possuem trHbs apresentam propriedades patogênicas, realizam fotossíntese, fixam nitrogênio ou possuem capacidades metabólicas distintas. A análise in silico demonstrou que as globinas Hsero_1880 e Hsero_2855 pertencem ao grupo II das trHb e podem atuar no metabolismo de óxido nítrico. A ausência dos produtos dos genes Hsero_1880 e Hsero_2855 não influencia o perfil de crescimento de H. seropedicae, uma vez que os mutantes apresentaram tempo de duplicação semelhante ao da estirpe selvagem. Os genes Hsero_1880 e Hsero_2855 tem, aparentemente, efeito no metabolismo de nitrogênio, uma vez que a atividade de nitrogenase dos mutantes nos genes Hsero_1880 e Hsero_2855 foram de, aproximadamente, 50% e 30% da atividade da estirpe selvagem em 24 horas, respectivamente. O gene Hsero_2855 é expresso no início na colonização da planta. O gene Hsero_1880 é ativado em baixas concentrações de oxigênio, sugerindo que este pode ser ativado nas condições de fixação de nitrogênio e também pode estar relacionado com adaptação a baixas concentrações de O2. A concentração de nitrogênio, independente da fonte utilizada como amônio, glutamato e nitrato, não influencia na ativação do gene Hsero_1880. Palavras chave: H. seropedicae, globina truncada, fixação biológica do nitrogênio / Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a Gram-negative nitrogen-fixing bacterium belonging to the class ? of the Proteobacteria phylum, it is associated with several plants of economic value such as corn (Zea mays), rice (Oryza sativa), sorghum (Sorghum bicolor), wheat (Triticum Aestivum), sugarcane (Saccharum officinarum), among others. In the H. seropedicae SmR1 genome, five genes possibly encoder of the truncated hemogoblins (Hsero_0935, Hsero_1880, Hsero_2698, Hsero_2855 and Hsero_2872) were annotated, two of them (Hsero_2855 and Hsero_2872) are inside the nif cluster. The family of truncated hemoglobins (trHb) consists of small oxygen-binding hemeproteins, distributed in bacteria, plants and unicelular eukaryotes, in intracellular nano-to-micromolar concentration and generally contains 20 to 40 amino less than the vertebrate hemoglobins. They are classified into three groups: I (N or trHbN), II (O or trHbO) and III (P or trHbP), and recently a forth small group named IV (Q or trHbQ) was created. Some organisms that have trHbs present pathogenic properties, perform photosynthesis, fix nitrogen or have different metabolic capacities. The in silico analysis demonstrated that the globins Hsero_1880 and Hsero_2855 belong to the group II of the trHb and can act in the metabolism of nitric oxide. The absence of the products of the Hsero_1880 and Hsero_2855 genes does not influence the growth profile of H. seropedicae, since the mutants had duplication time similar to that of the wild strain. The Hsero_1880 and Hsero_2855 genes apparently have an effect on nitrogen metabolism, since the nitrogenase activity of the mutants in the Hsero_1880 and Hsero_2855 genes was approximately 50% and 30% of the wild type activity in 24 hours, respectively. The Hsero_2855 gene is expressed early in plant colonization. The Hsero_1880 gene is activated at low oxygen concentrations, suggesting that it can be activated under nitrogen fixation conditions and may also be related to adaptation to low O2 concentrations. The concentration of nitrogen, regardless of the source used as ammonium, glutamate and nitrate, does not influence the activation of the Hsero_1880 gene. Key words: H. seropedicae, truncated globin, biological nitrogen fixation

Orientador : Prof. Dr. Leonardo Magalhães Cruz / Co-orientador : Prof. Dr. Roberto Tadeu Raittz / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/03/2014 / Inclui referências / Resumo: O Herbaspirillum lusitanum P6-12 foi isolado de nódulos de raiz da planta Phaseolus vulgaris (feijão) em Portugal. O genoma foi obtido através do programa CLCWorkbench utilizando a combinação de leituras de sequências SOLiD e Illumina. Utilizando o programa RAST e posterior revisão manual, a anotação do genoma obteve 4488 genes, cobrindo 87% do genoma, 51 tRNA e um operon ribosomal na ordem 16S rRNA-23S rRNA-5S rRNA. O H. lusitanum P6-12 possui as vias metabólicas Entner-Doudoroff, pentoses fosfato, ácidos tricarboxílicos Embden Meyerhof-Parnas, com exceção da enzima 6-fosfofrutoquinase (EC 2.7.1.11). Não foram encontrados os genes responsáveis pela fixação de nitrogênio, mas foi encontrado o gene que codifica a 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase, relacionada ao desenvolvimento da planta sob condições de estresse. Também foi encontrada a sequência parcial do gene que codifica para a proteína Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RuBisCO), ligada a fixação do carbono, embora os outros genes desta via não tenham sido identificados. Análises na diferença de cobertura global em relação à cobertura na região do operon, sinalizaram a presença de mais um operon ribosomal. Foram desenvolvidos métodos de tratamento das regiões de gap que permitiram a finalização do draft em 30 supercontigs, totalizando 4.919.496 pb. A análise do gene 16S rRNA confirmou que a espécie de Herbaspirillum sequenciada foi a de H. lusitanum estirpe P6-12. Foram utilizadas duas metodologias de agrupamento para as proteínas, a ligação simples e a ligação completa. Os grupos de genes ortólogos foram determinados como a intersecção entre os três métodos empregados nas análises OrthoMCL, INPARANOID e BBH, identificando 5218 grupos de genes ortólogos entre as 12 espécies estudas: Herbaspirillum sp. JC206, CF444, GW103, YR522, H. seropedicae SmR1, Os45, Os34, AU14040, H. rubrisubalbicans M1, H. frisingense GSF30 e H. huttiense subsp putei 7-2. Dentro dos 5218 grupos de ortólogos, 768 estiveram presentes em todos os genomas e foram definidos como core genoma. As análises filogenéticas baseadas nos grupos ortólogos sinalizaram uma possível classificação das estirpes Herbaspirillum sp. CF444 como Herbaspirillum lusitanum CF444 e Herbaspirillum sp. GW103 como H. huttiense subsp. putei GW103. Palavras-chave: Herbaspirillum lusitanum P6-12, anotação, grupos ortólogos, bioinformática, genômica. / Abstract: The Herbaspirillum lusitanum P6 -12 was isolated from root nodules of the Phaseolus vulgaris plant (beans) in Portugal. The genome was assembled in CLCWorkbench program using the combination of SOLiD and Illumina reads. Using the RAST program and subsequent manual review, the genome annotation obtained 4.488 genes, covering 87 % of the genome, 51 tRNA and one ribosomal operon 16S rRNA-23S rRNA-5S rRNA. H. lusitanum P6-12 has the Entner- Doudoroff, pentose phosphate, citric acid and Embden Meyerhof-Parnas metabolic pathways, with the exception of the enzyme 6-phosphofructokinase (EC 2.7.1.11). The presence of genes responsible for nitrogen fixation have not been found, but the gene encoding 1- aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase was present. This gene is related with plant development under stress conditions. Another finding was the partial sequence from the carbon fixation protein, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco). Analysis of the difference in overall genome coverage compared to the operon coverage, showed the presence of another ribosomal operon. Methods of treating regions of gap were developed and allowed the completion of the draft in 30 super-contigs and 4.919.496 bp. The analysis confirmed that the 16S rRNA gene of the species Herbaspirillum lusitanum was sequenced strain P6-12. Orthologous analysis showed the difference in prediction between three methods evaluated, OrthoMCL, INPARANOID and BBH. Two methods of clustering, simple and complet link were used. Groups of orthologous genes were determined as the intersection between the three methods identifying 5218 clusters of orthologous genes among the 12 species studied: Herbaspirillum sp. JC206, CF444, GW103, YR522, H. seropedicae SMR1, Os45, Os34, AU14040, H. rubrisubalbicans M1, H. frisingense GSF30 and H. huttiense subsp. putei 7-2. Within the groups of orthologous, 768 were present in all genomes being defined as core genome. Phylogenetic analysis based on orthologous groups showed a possible classification of Herbaspirillum CF444 as Herbaspirillum lusitanum CF444 and Herbaspirillum GW103 as H. huttiense subsp. putei GW103. Keywords: Herbaspirillum lusitanum P6-12, annotation, orthologous clustering, bioinformatics, genomics.

Orientador : Profª. Drª. Maria Berenice R. Steffens / Coorientador : Profª. Drª. Michelle Zibetti Tadra Sfeir / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/09/2016 / Inclui referências : f. 89-116 / Resumo: Herbapirillum seropedicae SmR1 é uma bactéria diazotrófica que coloniza, de forma endofítica, várias plantas de interesse econômico. A identificação e caracterização de RNAs não codificadores (ncRNAs) no gênero Herbaspirillum é uma etapa importante para o estudo da interação dessas moléculas com mRNAs- ou proteínas-alvo, no processo de regulação pós-transcricional. Neste trabalho foi ampliou-se a análise estrutural e funcional de ncRNAs com função regulatória em H. seropedicae SmR1. Além disso, foram preditos ncRNAs em outras bactérias do gênero Herbaspirillum. Utilizando a ferramenta Infernal 1.1.1 foram identificados 55 novos ncRNAs H. seropedicae SmR1, com expressão confirmada, que foram somados aos 173 já relatados por Moreno (2013) e Cirino (2014). Os novos ncRNAs foram classificados de acordo com a sua estrutura, como ncRNA cis-encoded ou ncRNAs trans-encoded. Foram também encontrados riboswitches e um representante da nova classe de RNA, a sequência CRISPR. Utilizando a ferramenta TargetRNA2 foram preditos diversos mRNAs-alvos. Dez ncRNAs de H. seropeddicae SmR1 com expressão confirmada em experimentos de RNAseq foram selecionados e oligonucleotídeos foram desenhados para futura validação por qRT-PCR. Finalmente, estes resultados contribuirão para o entendimento da participação desse tipo de RNA na regulação do metabolismo de bactérias do gênero Herbaspirillum. Palavras-chave: H. seropedicae SmR1; RNA não codificador, ncRNA, cis-encoded ncRNA, trans-encoded ncRNA, riboswitch, CRISPR. / Abstract: Herbaspirillum seropedicae SmR1 is a diazotrophic bacterium that colonizes endophytically several plants of economic interest. The identification and characterization of non-coding RNAs (ncRNAs) in the genus Herbaspirillum is an important step in the study of the interaction of these molecules with mRNAs- or proteins-tragets, in the post-transcriptional regulation process. In this work we continued the study of the structural and functional analysis of ncRNAs with regulatory function in H. seropedicae SmR1. In addition, new ncRNAs were predicted in other bacteria of the genus Herbaspirillum. Using the Infernal 1.1.1 tool, 55 new ncRNAs, with confirmed expression, were identified in the H. seropedicae SmR1 genome. They were added to the 173 ncRNas already reported by Moreno (2013) and Cirino (2014). The new ncRNAs were classified as cis-encoded ncRNAs or trans-encoded ncRNAs. We also found riboswitches and a representative of the new RNA class, the CRISPR sequence. Using the TargetRNA2 tool, several mRNAs-target were predicted. Ten ncRNAs of H. seropedicae SmR1, with confirmed expression in RNAseq experiments, were selected and oligonucleotides were designed for further validation by qRT-PCR. Finally, these results will contribute to the understanding of the participation of this type of RNA in the regulation of the metabolism of bacteria of the genus Herbaspirillum. Key-words: H. seropedicae SmR1; RNA non-coding (ncRNA), ncRNA cis_encoded, trans-encoded, riboswitches, CRISPR, mRNA.

Orientador : Prof. Dr. Marcelo Muller dos Santos / Coorientadora : Profa. Dra. Leda Satie Shubatsu / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 20/03/2017 / Inclui referências : f. 89-89 / Resumo: O acumulo de rejeitos plásticos no mundo representa na atualidade um dos maiores problemas ambientais. Os "bioplásticos" são compostos com propriedades muito similares aos plásticos que sintetizados por numerosos organismos. Os polihidroxialcanoatos são um tipo de bioplásticos produzidos por diversos grupos de bactérias como estoque de carbono e energia, possuem propriedades termoplásticas, elastoméricas e são resistentes a ruptura. Herbaspirillum seropedicae é uma betaproteobactéria fixadora de nitrogênio também capaz de produzir polihidroxibutirato (PHB). Foram identificados vários genes implicados na biossintesse e formação do grânulo de PHB dentro de bactéria, além dos genes das fasinas phaP, phaP2, encontrou-se o gene phaR que codifica para uma proteína reguladora PhaR, a qual se liga ao DNA na região de vários genes implicados na biossíntese de PHB. Em estudos prévios feitos pelo grupo de Fixação Biológica de Nitrogênio da Universidade Federal do Paraná foi gerado o mutante ?phaR derivado da estirpe parental SmR1 que apresentou uma dinâmica de produção de PHB diferente na estirpe selvagem SmR1, neste projeto foi estudado o perfil transcriptómico do mutante ?phaR de H. seropedicae comparando os níveis de expressão dos genes com a estirpe selvagem propondo uma possível via de regulação da proteína repressora PhaR, também foi avaliado o crescimento do mutante em diferentes fontes de carbono e a produção de PHB. O mutante ?phaR apresentou uma diminuição na produção de PHB e diferenças no perfil de crescimento em meio com galactose respeito à estirpe parental SmR1. Na avaliação transcriptômica foram encontrados sobre expressos genes envolvidos na síntese de ácidos graxos assim enquanto transportadores de aminoácidos ramificados e acetaldeído desidrogenase tiveram a sua expressão diminuida; revelando um possível redirecionamento do Acetil-coA que não está sendo empregado na síntese de PHB. Além disso, foi encontrado sobre expresso um gene que codifica para uma proteína envolvida no estresse oxidativo enquanto genes que codificam para o complexo IV da cadeia respiratória tiveram a sua expressão diminuída, indicando uma possível resposta ao estresse gerado pelo acumulo de fatores redutores como NADH. Genes envolvidos no metabolismo de galactose tiveram a sua expressão aumentada, enquanto vários reguladores transcricionais, entre eles um envolvido no metabolismo de arabinose araC, tiveram expressão diminuída. Foi demostrado também o papel de PhaR como regulador de fasinas já que ambos genes tiveram a sua expressão aumentada. Palavras chave: Polihidroxibutirato, Transcriptoma, Herbaspirillum seropedicae, repressor, expressão genética. / Abstract: Worldwide plastic waste accumulation is one of the main issues to address today, current alternatives are based on the development of new materials that can be easily degraded biologically in short periods without any contamination. "Bioplastics" are compounds whose properties are very similar to oil derived plastics but they are synthetized by living organisms. Polyhydroxyalkanoates are compounds related to bioplastics produced by several bacteria as an energy and carbon storage. They have good thermoplastics and elastomeric properties and are resistant to break. Herbaspirillum seropedicae it's a nitrogen fixating betaproteobacteria, also able to produce Polyhydroxybatyrate (PHB). There were identified several genes involved in PHB synthesis and granule formation, besides the phasins genes phaP1, phaP2, there was found the phaR gene that codifies a regulatory protein PhaR, wich is able to bind DNA in several regions of genes involved in PHB synthesis. In previous studies developed by the Nitrogen Fixation Group of the Universidade Federal do Paraná the ?phaR mutant was constructed from the parental strain SmR1, this mutant showed differences in the PHB production when compared to the wild type SmR1, in this work the transcriptomic profile of the ?phaR mutant was studied and the levels of expression compared with the wild type SmR1, a possible regulation pathway of the PhaR protein was proposed, also the growth dynamics in different carbon sources and PHB production was assayed. The ?phaR mutant showed a decreased in PHB production, and differences in growth patterns when grown in galactose. The transcriptomic profile showed an over expression of genes involved in fatty acid biosynthesis whereas there was a decrease on the expression of branched chain aminoacids and acetaldehyde dehydrogenase genes, this shows a possible path for redirecting Acetil-coA surplus because of low PHB production. Besides, there were found over expressed genes involved in oxidative stress whereas transcription of genes responsible for the synthesis of complex IV of the respiratory chain were decreased, indicating a possible response to stress generated for excess of NADH. Genes involved in galactose metabolism had an augmented expression in the ?phaR mutant whereas genes involved in transcription regulation included araC, a regulator of the arabinose metabolism presented a decrease on its transcription. It was demonstrated also the role of PhaR as a phasin regulator since both phasins presented an augmented transcription. Keywords: Polyhydroxibutyrate, Transcriptome, Herbaspirillum seropedice, repressor, gene expression.

Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria gram-negativa, fixadora de nitrogênio, endofítica, que se associa com plantas de interesse comercial, como milho, cana-de-açúcar e arroz, sem causar danos à planta hospedeira. H. seropedicae produz a auxina ácido indol acético (AIA), através de quatro possíveis vias, sendo que a proteína indol piruvato ferrodoxina oxiredutase (Ior), codificada pelo gene ior, está envolvida na rota indol-3-piruvato. Estudos mostraram que a expressão do gene ior (Hsero_4278) é reprimida por naringenina e AIA. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a regulação deste gene utilizando a estirpe mutante T1A8 de H. seropedicae que apresenta uma fusão cromossomal ior::lacZ e fusões plasmidiais contendo a sequência promotora de ior e deleções de potenciais segmentos sinalizadores nesta região promotora. A expressão do gene ior na estirpe T1A8 foi monitorada durante 24 horas e observou-se uma alta expressão durante a fase estacionária de crescimento celular. A expressão de ior mostrou ser regulada negativamente por naringenina e AIA de forma dose-dependente. Outros compostos como triptofano, indol, e os flavonóides crisina e quercetina não apresentaram efeito sobre a expressão de ior nas condições testadas. Resultados obtidos com as fusões plasmidiais ior::lacZ também indicaram a expressão tardia do gene ior, sugerindo a participação do fator sigma S. Análises de sequência e deleções na região promotora do gene ior indicaram que a região -10 foi identificada a -315 pb a montante do códon de iniciação do gene ior, reforçando a transcrição dependente de sigma S.

Orientadora : Profa. Dra. Rose Adele Monteiro / Co-orientador : Prof. Dr. Emanuel M. de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 13/12/2013 / Inclui bibliografia / Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma beta-proteobactéria encontrada em associação com várias plantas economicamente importantes e pode promover o aumento do crescimento e produtividade vegetal. Este estímulo efetivo do crescimento vegetal depende de uma colonização eficiente da planta hospedeira. A associação com o hospedeiro inicia-se com a adesão da bactéria à superfície radicular, seguida de colonização de pontos de emergência de raízes secundárias e penetração através de descontinuidades da epiderme. Ocorre então uma rápida ocupação dos espaços intercelulares, procedendo com colonização do xilema e porções aéreas. Entretanto, a natureza molecular da colonização não está claramente compreendida. Nestas associações, o evento chave parece ser a colonização da rizosfera. Portanto, a identificação e análise dos produtos gênicos envolvidos na colonização de bactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPRs) como H. seropedicae em plantas tem importância científica e interesse econômico para potencializar sua aplicação. Assim, este trabalho descreve que o lipopolissacarídeo de H. seropedicae atua como molécula de ancoragem em lectinas radiculares durante adesão, e que o exopolissacarídeo atua como matriz na formação de biofilme em superfícies abióticas. Outros fatores moleculares foram também identificados por análise transcriptômica dessa bactéria durante colonização de milho, discriminando as adaptações moleculares de H. seropedicae para perceber o ambiente, aderir à superfície radicular e sobreviver nos primeiros estágios da colonização da rizosfera. / Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a betaproteobacteria found in association with several crops and can promote plant growth and increase productivity. This effective stimulus of plant growth depends on an efficient colonization of the host plant. The association with the host begins with the bacterial attachment onto the root surface, followed by the colonization on points of secondary root emergency and penetration through epidermis discontinuities. A rapid occupation of intercellular spaces then occurs, proceeding with xylem and aerial portions colonization. However, the molecular nature of the colonization is not clearly understood. In these associations, the key event seems to be the rhizosphere colonization. Therefore, the identification and characterization of genic products involved in the plant colonization by plant growth promoting rhizobacteria (PGPRs) such as H. seropedicae has scientific importance and economic interest to potentiate its application. This way, this work describes that the H. seropedicae lipopolysaccharide act as anchoring molecule to radicular lectins during attachment and that the exopolysaccharide act as matrix in biofilm formation on abiotic surfaces. Other molecular factors were also identified by transcriptomic analyses of bacteria during maize colonization, discriminating the molecular adaptations of H. seropedicae when perceiving the environment, attaching onto root surface and surviving in the first stages of rhizosphere colonization.