Made available in DSpace on 2017-07-10T14:38:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAcaoO-MESTRADO-SANDRA-VERSaO-FINAL.pdf: 1113857 bytes, checksum: e8421d0365b2d79f28487d63317ac109 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The production of xylanolitic enzymes have been widely explored in the past few years by several species of filamentous fungi. The objective of this study was to evaluate the production of xylanases by Penicillium brefeldianum an isolated filamentous fungus of Parana Atlantic Forest using brewers spent grain and evaluate its potential in the agro-waste saccharification. The enzyme extract was obtained from liquid culture using 1% (w / v) brewers spent grain in modified under stationary conditions at 28 ° for 9 days. The fungus had large capacity in the production of xylanase (830 U mL-1), pectinase (295 U mL-1), β-xylosidase (3,46 U mL-1), FPase (0,60 U mL-1), avicelase (13, 71 U ml-1), cellulase (1.89 U mL-1) and β -glycosidase (29,45 U mL-1). The optimum pH of 4.5 was found for xylanase and stability in 98% range of 2.5 to 8.0 for 96 hours. The optimum temperature was 55 °C with a half life of 90 minutes. The zymogram of the crude extract of P. brefeldianum exhibited three bands of xylanase activity with molecular masses of 60 and 97kDa. P. brefeldianum crude enzymatic extract was used for saccharification of various waste (sugarcane bagasse, brewers spent grain, rice straw, corn stover, wheat straw, sorghum biomass and sorghum low-lignin) untreated and previously treated with NaOH 30°C for 12h (NaOH30) and at 121°C for 30 minutes (NaOH121). The best results were obtained with waste treated under high pressure and temperature (121°C). Among waste, wheat straw showed higher amount of total sugar (63%) released after the enzymatic hydrolysis, followed brewers spent grain (60%), corn straw (58%), sorghum biomass (54%) and sorghum low-lignin (35%). The pentose released after saccharification showed that sorghum low-lignin treated at high temperature and pressure was the best substrate releasing 7,35 times more pentose compared to sorghum low-lignin untreated, followed by straw rice (5,52x) and sorghum biomass (4,39x). Thus, the filamentous fungus P. brefeldianum isolated from the West of Paraná Atlantic Forest was able to use the brewers spent grain as inductor of various degrading enzymes the cell wall, and furthermore, showed potential for saccharification of lignocellulosic biomass from agro-waste. / A produção de enzimas xilanolíticas tem sido amplamente explorada nos últimos anos por diversas espécies de fungos filamentosos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de xilanases por Penicillium brefeldianum, um fungo filamentoso isolado da Mata Atlântica do Paraná, utilizando bagaço de cervejaria para avaliar seu potencial na sacarificação de resíduos agroindustriais. O extrato enzimático foi obtido a partir de cultivo líquido contendo 1% de bagaço de cervejaria (p/v) e cultivado em condições estacionárias a 28° por 9 dias. O fungo apresentou versatilidade em produzir diversas enzimas tais como: xilanase (830 U mL-1), pectinase (295 U mL-1), β -glicosidase (29,45 U mL-1), avicelase (13,71 U mL-1) β-xilosidase (3,46 U mL-1), celulase (1,89 U mL-1) e Fpase (0,60 U mL-1). A xilanase produzida por esse fungo apresentou pH ótimo de atividade enzimática de 4,5 e estabilidade de 98% na faixa de pH 2,5 a 8,0 por até 96 horas. A temperatura ótima de atividade da xilanase foi 55°C com meia vida de 90 minutos. No processo de sacarificação enzimática de resíduos (bagaço de cana, bagaço de cervejaria, palha de arroz, palha de milho, palha de trigo, sorgo biomassa) com extrato bruto de P. brefeldianum foi obtido que o bagaço de cervejaria apresentou melhor resultado sem qualquer tipo de pré-tratamento, exibindo 35% de sacarificação. Porém, o pré-tratamento dos resíduos com NaOH 1% a 30°C por 12 horas ou a 121°C e pressão de 1 atm por 30 minutos resultaram em melhores rendimentos de açúcares redutores totais. E dentre os resíduos sacarificados, o bagaço de cervejaria (60%) liberou maior quantidade de açucares totais, seguido de palha de trigo (58,73%), palha de milho (58%) sorgo biomassa (54%) e sorgo com baixa lignina (35%). Entretanto, as pentoses produzidas após sacarificação mostraram que o tratado com NaOH (121ºC e pressão de 1 atm) apresentou 7,35 vezes mais pentoses quando comparado ao in natura, seguido de casca de arroz (5,52 vezes) e sorgo biomassa (4,39 vezes). Dessa forma, o fungo filamentoso P. brefeldianum isolado da Mata Atlântica do Oeste do Paraná foi capaz de utilizar o bagaço de cervejaria como indutor de hemicelulases, celulases e pectinases, além disso, exibiu potencial de sacarificação de resíduos agroindustriais para produção de açucares redutores.

O presente trabalho teve como principal objetivo correlacionar a composição química do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com H2SO4 diluído com a eficiência da sacarificação enzimática da celulose presente no material. Primeiramente, o bagaço in natura foi extraído com água, etanol ou água seguida de etanol, e as composições químicas determinadas. Posteriormente, o bagaço in natura foi pré-tratado com H2SO4 diluído em êmbolos de 200 mL, utilizando 15% de teor de sólidos (m/v). A temperatura (112,5-157,5 °C), o tempo de residência (5-35 min) e a concentração ácida (0-3,0% m/v) variaram de acordo com um planejamento fatorial 23 completo. Após o pré-tratamento, as amostras foram caracterizadas quimicamente. Em seguida, dois extratos enzimáticos comerciais foram caracterizados quanto às atividades de enzimas hidrolíticas e fenoloxidases, e aos teores de proteínas. As condições adequadas de sacarificação enzimática da celulose para a amostra de bagaço pré-tratada com H2SO4 diluído (15% sólidos, 2% ácido, a 150ºC por 30 min) foram determinadas através de planejamentos fatoriais 23 completos, variando teor de sólidos (1,19-4,81% m/v), carga enzimática (1,91-38,09 FPU/g de bagaço) e carga de surfactante (0-0,1 g/g de bagaço), para os dois extratos enzimáticos. As amostras de bagaço pré-tratadas sob diferentes condições de temperatura, tempo de residência e concentração de H2SO4 (primeiro planejamento fatorial) foram submetidas à sacarificação enzimática com um dos extratos. Por fim, amostras selecionadas foram caracterizadas quanto às alterações morfológicas provocadas pelo pré-tratamento e pela hidrólise enzimática, por microscopia eletrônica de varredura. Os resultados mostraram que água seguida de etanol extraiu maior quantidade de extrativos do bagaço. Os extrativos apresentaram absorção de luz apenas na região do ultravioleta. A porcentagem de lignina nos bagaços extraídos com água, etanol e água seguida de etanol foi menor que aquela encontrada no bagaço in natura. De acordo com a condição de pré-tratamento, os teores de celulose, hemicelulose e lignina nos bagaços pré-tratados diferiram substancialmente. A maior variação foi observada para hemicelulose (3,67-27,27%). Os três fatores avaliados no pré-tratamento influenciaram na composição química do bagaço pré-tratado. Por sua vez, os dois extratos enzimáticos apresentaram um complexo celulolítico completo e considerável atividade de xilanases, porém não foi observada atividade de fenoloxidases. O extrato II apresentou maior quantidade de proteínas (152,45±10,0 mg/mL), comparado ao extrato I (105,2±6,6 mg/mL). Para 24 horas de hidrólise enzimática com o extrato I, as três variáveis independentes influenciaram na digestão do bagaço pré-tratado. Somente os efeitos das cargas de enzima e surfactante foram significantes, utilizando o extrato II. Posteriormente, foi possível aumentar o teor inicial de sólidos sem comprometer o rendimento de sacarificação com o extrato II. Não foi possível correlacionar a conversão de celulose com o fator de severidade do pré-tratamento. Por outro lado, foi observada correlação negativa entre o conteúdo de hemicelulose e a conversão enzimática de celulose, enfatizando a influência da composição química do bagaço de cana na hidrólise enzimática da celulose. Observaram-se diferenças morfológicas entre o bagaço in natura e amostras pré-tratadas sob condições branda e severa, bem como após suas respectivas hidrólises enzimáticas. / This study aimed to correlate the chemical composition of a sugarcane bagasse pretreated with dilute H2SO4 with the efficiency of cellulose enzymatic saccharification of this material. First, the sugarcane bagasse was extracted with water, ethanol or water followed by ethanol, and its chemical composition was determined. Subsequently, the sugarcane bagasse was pretreated with dilute H2SO4 in 200 mL stainless steel containers, using 15% of solids loading (w/v). The temperature (112.5-157.5°C), time of residence (5-35 min) and acid concentration (0-3.0% w/v) varied according to a 23 full factorial design. After the pretreatments, the chemical compositions of the pretreated bagasses were determined. Then, two commercial enzymatic extracts were characterized regarding the activities of hydrolytic enzymes and phenoloxidases, and protein contents. The enzymatic saccharification conditions for the bagasse sample pretreated with dilute H2SO4 (15% solids, 2% acid, 150°C for 30 min) were determined through 23 full factorial designs, varying the solids loading (1,19-4.81% w/v), enzyme loading (1.91-38.09 FPU/g of bagasse) and surfactant loading (0-0.1 g/g of bagasse) for the two enzymatic extracts. The bagasse samples pretreated under the different conditions of temperature, time of residence and H2SO4 concentration (first factorial design) were subjected to enzymatic saccharification using one of the extracts. Finally, selected samples were analyzed for morphological changes caused by pretreatment and enzymatic hydrolysis, by scanning electron microscopy. The results showed that water followed by ethanol extracted the highest amount of extractives. The extractives showed light absorption only in the ultraviolet region. The percentage of lignin in the bagasse samples extracted with water, ethanol and water followed by ethanol was lower than that found in the raw material. According to the pretreatment conditions, the amount of cellulose, hemicellulose and lignin in the pretreated bagasse differed substantially. The greatest variation was observed for the hemicellulose content (3.67-27.27%). All the three factors evaluated in the pretreatment affected the chemical composition of the pretreated bagasse. In turn, the two enzymatic extracts showed complete cellulolytic complexes and considerable activities of xylanases, without activities of phenoloxidases. The extract II showed higher protein content (152.45±10.0 mg/mL) when compared with the extract I (105.2±6.6 mg/mL). For 24 hours of enzymatic hydrolysis using the extract I, all the three independent variables influenced the saccharification of pretreated bagasse. Only the enzyme and surfactant loadings were significant, when using the extract II. Later, it was possible to increase the initial solids content without hindering the saccharification yield, using the extract II. It was not possible to correlate the cellulose conversion with the pretreatment severity. On other hand, it was possible to observe a negative correlation between the hemicellulose content and the efficiency of enzymatic conversion, emphasizing the influence of the sugarcane bagasse chemical composition in the enzymatic hydrolysis of cellulose. Morphological differences were observed between the raw material and sugarcane bagasse samples pretreated under high or low severity, as well as after their corresponding enzymatic hydrolysis.

Esta tese apresenta os resultados obtidos com a utilização de efluente produzido em digestor hidrolítico de lodo primário, para a remoção de nutrientes em reator em bateladas seqüenciais (RBS) tratando efluente de reator UASB. Assim, foram realizados dois estudos. O primeiro consistiu na verificação da melhor condição operacional para que se alcançasse a maior produção de ácidos graxos voláteis (AGV) em digestor hidrolítico de lodo (DHL), enquanto que, o segundo estudo, consistiu na avaliação do desempenho do RBS na remoção de nitrogênio e fósforo diante da aplicação dos AGV presentes no sobrenadante de lodo hidrolisado, do DHL. Os resultados do primeiro estudo permitiram a verificação de que a produção de AGV no DHL foi proporcional à taxa de aplicação. Foi verificado, também, que a maior produção destes ácidos se deu com a aplicação de tempos de detenção de lodo da ordem de 2 dias. Os resultados do segundo estudo permitiram a verificação de que a relação C/N igual, ou próxima a 3, se mostrou como a mais viável para o processo de desnitrificação, onde, neste caso foram observadas desnitrificações superiores a 70%. Nesta mesma condição, foram observadas remoções de fósforo da ordem de 25%. Entretanto, a utilização do sobrenadante de lodo hidrolisado, e os AGVs nele contido como fonte de carbono, ficou comprometida devido a alta concentração de nitrogênio (predominantemente sob a forma amoniacal) nele presente. O nitrogênio introduzido no RBS, pela adição de sobrenadante de lodo hidrolisado, se manteve inalterado fazendo com que o RBS acabasse por apresentar altas concentrações deste nutriente ao final do ciclo. Portanto, a aplicação deste tipo de fonte de carbono em escala plena para remoção de nutrientes, acabou ficando inviável da forma como se propôs, nesta pesquisa, que fosse realizada. / This thesis presents the results obtained with the use of effluent produced in primary sludge hydrolytic digester for nutrient removal in sequential batch reactor (SBR) treating effluents from an up-flow anaerobic sludge blanket (UASB) reactor. Two bench scale studies were developed. The first one consisted in verifying the best operational condition to produce volatile fatty acids (VFA) in the primary sludge hydrolytic reactor; the second one aimed to evaluate the sequential batch reactor (SBR) performances in the removal of nitrogen and phosphorus. In this operational condition, VFA from the liquid phase of the hydrolytic reactor was applied as external carbon source. The results from the first study permitted to verify that the VFA production in the HSR was proportional to the application rate (AR). The best VFA production was obtained for sludge retention time (SRT) of two days. In the second study, the best C/N ratio for the denitrification process was found to be close to 3, with denitrification efficiency higher than 70%. In this condition, phosphorus removal efficiency was approximately 25%. However, nitrogen removal was deeply affected by the high concentration of ammonium nitrogen in the liquid phase of the hydrolyzed sludge that remains unaltered in the SBR. Consequently, the use of such endogenous carbon source for denitrification needs further development in order to be applied in full-scale treatment systems.

O cultivo da cana-de-açúcar é uma das atividades agrícolas mais importantes no Brasil, produzindo após a moagem o caldo, utilizado para a produção de açúcar e etanol, e o bagaço, resíduo lignocelulósico. O bagaço é recalcitrante à hidrólise enzimática, em parte pela baixa porosidade, resultante do recobrimento das fibrilas de celulose com lignina e hemicelulose. Neste estudo, o bagaço foi pré-tratado com sulfito alcalino nas concentrações de 2,5% de NaOH e 5% de Na2SO3 versus 5% de NaOH e 10% de Na2SO3 para produzir substratos para hidrólise enzimática. Ambos pré-tratamentos produziram substratos com teor de hemicelulose, grupos ácidos, grau de retenção de água e área superficial semelhantes. O conteúdo de lignina foi bem diferente nos bagaços pré-tratados com 5% de sulfito (21% de lignina) e 10% de sulfito (13% de lignina). A hidrólise da celulose e hemicelulose do bagaço com alto teor de lignina, utilizando a carga enzimática de 40 FPU/g e 80 U/g de ?-glicosidase foram próximas a 50% em 48 horas e, mesmo no bagaço com pouca lignina a conversão dos polissacarídeos não foi completa (90%). Considerando a importância do tipo de enzimas para a conversão dos polissacarídeos dos bagaços pré-tratados, realizou-se um planejamento experimental 24 com 6 pontos centrais ampliado em estrela, para avaliar uma mistura de enzimas partindo de 5 FPU/g do extrato comercial de Trichoderma reesei (celluclast) combinado com enzimas purificadas comerciais: xilanase de Neocallimastix patriciarum (família 10), xilanase de Thermotoga maritima (família 11), ?-xilosidase de Selelomonas ruminantium e ?-glicosidase de Aspergillus niger. A aplicação da mistura de enzimas otimizada no bagaço pré-tratado com alta carga de sulfito aumentou a conversão de celulose e hemicelulose em 6,6% e 15% respectivamente, comparado com a mistura de referência (5FPU de celluclast e 10UI de Novozyme 188 por grama de bagaço). A suplementação da celluclast com ?-xilosidase e ?- glicosidase foi estatisticamente significativa em 24 horas de hidrólise a um nível de 95% de confiança e a interação da xilanase 10 e 11 foi significativa com um nível de confiança de 90%. Quando foram realizados os mesmos ensaios do planejamento com o substrato com alto teor de lignina, as hidrólises da celulose e hemicelulose com a mistura de enzimas foram inferiores à obtida com a referência. A suplementação com xilanases e ?-xilosidase aumentou a conversão enzimática da hemicelulose apenas do substrato com pouca lignina, entretanto nos hidrolisados de ambos os substratos foi detectada a presença de xilooligossacarídeos, indicando a necessidade de adição de mais ?-xilosidase à mistura enzimática. As velocidades iniciais de hidrólise da celulose e hemicelulose foram pouco alteradas quando a lignina do bagaço reduziu de 21% para 13%, porém a conversão em 48 h de reação foi o dobro. Este estudo mostrou que o acesso das enzimas à hemicelulose foi limitado pelo alto teor de lignina do substrato, e que o benefício do uso de xilanases para a conversão de celulose foi obtido no substrato pré-tratado com alta carga de sulfito. / The cultivation of sugarcane is one of the most important agricultural activities in Brazil. The juice obtained from the crushed stalks of sugarcane is used to produce sugar and ethanol and the dry, fibrous residue remaining is the bagasse. Bagasse is recalcitrant to enzymatic hydrolysis, in part by low porosity due to the partial filling of space between the cellulose microfibrils by lignin and hemicelluloses. In this study, bagasses were pretreated with alkaline sulfite at concentrations of 2.5% NaOH and 5% Na2SO3 NaOH versus 5% and 10% Na2SO3 to produce substrates for enzymatic hydrolysis. Both substrates presented similar hemicellulose content, acid groups, water retention and specific surface area. Lignin content differed between pretreated bagasse with 5% sulfite (21%) and 10% sulfite (13%). The hydrolysis of cellulose and hemicellulose of bagasse with high lignin content, using 40 FPU/g and 80 U/g of ?-glucosidase was aproximately 50% in 48 hours and even on bagasse with low lignin content, the polysaccharides conversion was not complete (90%). Considering the importance of the type of enzymes for the conversion of polysaccharides of pretreated bagasses, a 24 full factorial experimental design with six central points was performed to evaluate a mixture of enzymes. A load of 5 FPU/g of Trichoderma reesei extract (celluclast) was combined with purified commercial enzymes: Neocallimastix patriciarum xylanase (family 10), Thermotoga maritima xylanase (family 11), Selelomonas ruminantium ?-xylosidase and ?-glucosidase from Aspergillus niger. The optimized mixture improved the conversion of cellulose and hemicellulose of the substrate with low lignin content in 6.6% and 15% respectively, when compared to the reference mixture (5FPU of celluclast and 10 IU of novozyme 188 per gram of bagasse). Supplementation with ?-xylosidase and ?-glucosidase was statistically significant at 24 hours of reaction and also the interaction of xylanases 10 and 11. When the same assays were performed with the substrate with low lignin, hydrolysis of the cellulose and hemicellulose with a mixture of purified enzymes was inferior to that obtained by the reference. Supplementation with xylanase and ?-xylosidase improved the enzymatic conversion only for substrate with low lignin content, however in supernatants of both substrates was detected the presence of xylo-oligosaccharides, suggesting the need for further addition of ?-xylosidase to the enzyme mixture. Initial rate of cellulose and hemicellulose hydrolysis changed very little when the lignin in the bagasse was reduced from 21% to 13%, but the conversion at 48 h conversion time was twice higher. This study showed that access of enzymes to the hemicellulose was limited by the high lignin content of the substrate, and that the benefit of using xylanases for the conversion of cellulose was obtained on the substrate pretreated with high sulfite load.

Os materiais lignocelulósicos possuem características que limitam a sacarificação enzimática da celulose. Entre essas características pode-se classificar a porosidade como uma das mais importantes, sendo usualmente mensurada pela técnica de exclusão de solutos. A secagem do material também pode aumentar sua recalcitrância por meio do fenômeno de hornificação. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do teor de lignina e da secagem na porosidade e na sacarificação enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. A partir de uma amostra in natura quatro amostras com teores de lignina decrescentes foram geradas, utilizando o método de deslignificação por clorito-ácido. Uma fração destas amostras foi seca ao ar em temperatura ambiente e o restante teve seu teor de umidade mantido. A análise das modificações estruturais promovidas pelo tratamento citado foi feita utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV). A porometria das amostras, determinada via técnica de exclusão de solutos, foi realizada utilizando 1 g de massa seca de amostra e 20 g de soluções de sondas moleculares com concentração de 1,5% (m/m); após 24 h sob agitação manual ocasional a 25 °C a determinação da distribuição do volume e área superficial de poros foi realizada com base na redução da concentração inicial da solução. O valor de retenção de água das amostras foi calculado via centrifugação. As amostras foram submetidas à sacarificação com cargas enzimática e de surfactante de 10 FPU e 0,025 g de Tween 20 por grama de bagaço, respectivamente. A reação ocorreu a 45 °C sob agitação de 150 rpm e a conversão de celulose foi medida após 2, 8, 24 e 72 h. As amostras deslignificadas por 1, 2, 3 e 4 horas apresentaram 14,2; 9,2; 8,0 e 5,9% de lignina, respectivamente, enquanto que a amostra in natura foi composta por 20,7%. Por meio das análises feitas por MEV, pôde-se observar que a remoção de lignina acarretou em uma descompactação estrutural dos feixes vasculares. As amostras com maiores teores de lignina apresentaram menores volumes e áreas superficiais de poros e piores conversões enzimáticas de celulose. Para a amostra in natura o volume total de poros foi de 0,89 mL/g de bagaço enquanto que para as amostras deslignificadas por 1, 2, 3 e 4 horas este volume foi de 1,19, 1,77, 1,92 e 2,21 mL/g de bagaço, respectivamente. A secagem reduziu o volume total de poros das amostras deslignificadas por 2, 3 e 4 horas para 1,47, 1,55 e 1,98 mL/g de bagaço respectivamente. Os valores de retenção de água foram similares aos valores de volume total de poros obtidos via técnica de exclusão de solutos. Enquanto cerca de apenas 20% da celulose da amostra in natura foi convertida após 72 h de sacarificação, a amostra com o menor teor de lignina apresentou conversão próxima a 100%. A secagem das amostras deslignificadas não alterou as taxas nem os rendimentos de sacarificação. Pode-se concluir então que o teor de lignina desempenha um papel importante na limitação da sacarificação enzimática da celulose, e que sua remoção implica num aumento do volume de poros do material. / Lignocellulosic materials present characteristics that limit the enzymatic saccharification of cellulose. Among these features, the porosity, usually measured by the solute exclusion technique, can be classified as one of the most important. Drying of the material can also increase its recalcitrance by the hornification phenomenon. In this context, this study aimed to evaluate the influences of lignin content and drying in the porosity and enzymatic saccharification of the sugar cane bagasse. From an in natura sample, other four samples with decreasing lignin contents were generated using the method of delignification by acid chlorite. A fraction of these samples was air dried at room temperature and the remainder one was kept wet. The analysis of the structural changes promoted by the aforementioned treatment was performed using scanning electron microscopy (SEM). The samples porometry, carried out using the solute exclusion technique, was performed using 1 g of sample (dry weight) and 20 g of solutions of molecular probes with concentration of 1.5% (w/w); after 24 h under occasional manual agitation at 25 °C, determination of the volume and surface area distribution of pores was carried out based on the reduction of the initial concentration of the solution. The water retention value of the samples was calculated by centrifugation. The samples were subjected to enzymatic saccharification with enzyme and surfactant loads of 10 FPU and 0.025 g of Tween 20 per gram of bagasse, respectively. The reaction was carried at 45 °C under agitation of 150 rpm and the cellulose conversion was measured after 2, 8, 24 and 72 h. Sample delignified by 1, 2, 3 and 4 hours showed 14.2, 9.2, 8.0 and 5.9% of lignin content, respectively, while the in natura sample was composed of 20.7%. Through SEM analysis, it was observed that the lignin removal resulted in a material with the vascular bundles structurally less compact and ordered. The samples with higher contents of lignin had lower volumes and surface areas of pores and worse enzymatic cellulose conversions. For the in natura sample the total pore volume was 0.89 mL/g of bagasse while for the samples delignified by 1, 2, 3 and 4 hours this volume was 1.19, 1.77, 1.92 and 2.21 mL/g of bagasse, respectively. Drying reduced the total pore volume of samples delignified by 2, 3 and 4 hours to 1.47, 1.55 and 1.98 mL/g of bagasse, respectively. The water retention values were similar to the total pore volume obtained by the solute exclusion technique. While only about 20% of the cellulose in the in natura sample was converted after 72 h of saccharification, the sample with the lowest lignin content showed a conversion close to 100%. Drying of the delignified samples did not change rates and yields of saccharification. It can be concluded then that the lignin content plays an important role on limiting the enzymatic saccharification of cellulose, and that its removal implies in increase in the pore volume of the material.

Atualmente, o aumento da preocupação com a sustentabilidade ambiental, alinhado às perspectivas de esgotamento das reservas de petróleo, tem direcionado às buscas por fontes renováveis de energia. O emprego de resíduos agroindustriais, principalmente de usinas sucroalcooleiras destaca-se como sendo uma alternativa para a produção de etanol de segunda geração. Dentre as metodologias aplicadas para disponibilização dos açúcares fermentescíveis está a hidrólise enzimática. Ainda, para facilitar esta etapa e torná-la mais acessível, submete-se, previamente, o material lignocelulósico a um pré-tratamento, com o objetivo de contribuir com a susceptibilidade da celulose a ataques enzimáticos. No entanto, devido à complexidade das estruturas lignocelulósicas, os processos de hidrólise e pré-tratamento precisam se tornar mais eficientes e economicamente viáveis. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar e caracterizar os pré-tratamentos hidrotérmico e organossolve (etanol 50%), isoladamente, e estes combinados em diferentes condições, assim como a influência destes procedimentos na estrutura e composição da biomassa, bem como na hidrólise enzimática. Os resultados demonstraram que os pré-tratamentos hidrotérmicos a 160 ºC nas condições analisadas foram pouco efetivos na melhora do acesso enzimático durante a etapa de hidrólise, pois atuaram de maneira branda na parede celular, pouco solubilizando a hemicelulose e lignina, conforme as análises físicas comprovaram. Os tratamentos combinados hidrotérmico 30 min e 60 min a 160 ºC seguidos pelo organossolve por 150 min apresentaram semelhança morfológica e alta solublização da lignina e hemicelulose, justificando os valores de hidrólise. Nossos resultados abrem perspectivas de novos estudos que visam a otimização dos pré-tratamentos hidrotérmicos e organossolve, além da compreensão das alterações composicionais e morfológicas que levam à melhoria da hidrólise enzimática na biomassa lignocelulósica. / The concerns with environmental sustainability and perspectives of petroleum reserves depletion motivated exploration of new and sustainable energy sources. In this context, renewable energies start to receive significant attention in the world´s energy matrix, with biofuels playing a special role. The use of agro-industrial residues, mainly from the sugarcane industry, stands out as a viable alternative for the production of second-generation ethanol. The enzymatic hydrolysis of the biomass has a number of advantages for polysaccharides depolimerization, such as high substrate specificity, low environmental impact and lack of corrosion issues. To further facilitate this procedure and to make biomass more accessible, the lignocellulosic material has to be previously submitted to a pretreatment in order to increase the cellulose accessibility and susceptibility to the enzymatic action. This process aims at the disorganization of the chemical structure of the lignocellulosic matter, facilitating the further steps of hydrolysis and fermentation. Due to the complexity of the lignocelluloses structures, their pretreatment and hydrolysis processes have to become more efficient and economically viable to be efficiently applied at an industrial scale. Therefore, the objective of this work is to evaluate the hydrothermal and organosolv (50% ethanol) pretreatments, separately and combined in different conditions, and the influence of these procedures on the structure and composition of the biomass and on the efficiency of enzymatic hydrolyses. Our results demonstrated that the hydrothermal pretreatments at 160ºC within the analyzed reaction conditions had minor effects on improving the enzymatic efficiency, being not harsh enough to introduce significant modifications of the cell wall composition and structure, as demonstrated by our physical and chemical analyses. The combined hydrothermal treatments lasting 30 min and 60 min at 160ºC followed by the organosolv step for 150 min resulted in significant morphological changes and high lignin and hemicelluloses solubilization, resulting in an efficient enzymatic hydrolysis. Our results open perspectives of further studies aimed at optimization of hydrothermal and organosolv pretreatments and comprehension of compositional and morphological changes which lead to improved enzymatic hydrolysis of the lignocelulosic biomass.

Atualmente os processos biotecnológicos têm conquistado um lugar de destaque no desenvolvimento tecnológico mundial, tendo as enzimas como as celulases, grande importância econômica e diferentes aplicações industriais. O objetivo deste trabalho foi à obtenção de fungos isolados e selecionados do ambiente agroindustrial, com a capacidade de hidrolisar a fração celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Um total de 46 isolados foram obtidos de bagaço de cana coletados em 3 destilarias. Quinze apresentaram a formação de halo pela coloração com vermelho Congo, os quais foram avaliados quanto a atividade celulolítica (F1 a F15), tendo como referência o fungo Trichoderma ressei 9414. Os isolados foram cultivados em bagaço de canade- açúcar 1% e conduziu-se a determinação da atividade de endoglucanase (CMCase) empregando-se carboximetilcelulose (CMC) como substrato, e da atividade da celulase total (FPase) empregando papel de filtro como substrato. Após 21 dias de cultivo em bagaço de canade- açúcar nenhum dos isolados apresentou atividade da celulase total maior que T. ressei QM9414. Destes isolados, F9 apresentou maior valor para a atividade da celulase total após 7 dias de cultivo. Com relação a atividade da endoglucanase, no sétimo dia de cultivo o isolado F27 obteve melhor resultado que T. ressei QM 9414. Quanto à cinética da atividade de endoglucanase os isolados 9, 23 e 27 apresentaram atividades enzimáticas muito próximas do fungo referência (QM9414). Os resultados mostram o grande potencial da biodiversidade existente em nichos industriais, na busca de linhagens com potencialidade na hidrólise enzimática de substrato lignocelulósico, como o bagaço de cana- de-açúcar. / Biotechnological processes are achieving increased relevance in today\'s technological development, being enzymes such as celullases, of great economical importance in different industrial applications. The objective of this work was the isolation and selection of fungi from agroindustrial environment, with capacity of hydrolysing the cellulosic fraction of sugar cane bagasse. Forty six isolates were evatuated for their cellulolytic activity using CMC as carbon source and Cong Red as staining indicator . Fifteen isolates showed halo formation by red Congo staining, and they were evaluated for cellulolytic activity (F1 to F15), using Trichoderma ressei 9414 as a reference. The isolates were cultivated in 1% sugar cane bagasse and the cellulolytic activities were assessed by the determination of endoglucanase activity (CMCase) using carboximetilcelulose (CMC) as substrate, and the total celullase activity (FPase) applying filter paper as substrate. After 21 days of cultivation in sugar cane bagasse neither of the isolates showed total cellulase activity higher than T. ressei QM9414. From these isolates, F9 showed higher total cellulase activity after 7 cultivation days. For endoglucanase activity, the isolate F27 showed better result than T. ressei QM 9414 in the seventh cultivation day. For the endoglucanase activity kinetics, the isolates 9, 23 and 27 showed enzymatic activities very close to the reference fungus (QM9414). These results allow to suggest a great biotechnological potential for the biodiversity found in industrial niches, regarding the enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates, namely the sugar cane bagasse.

Tese de mestrado integrado. Engenharia Química. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-04-24T16:05:47Z No. of bitstreams: 1 DOUGLAS ALEXANDRE SARAIVA LEÃO - TESE PPGEP 2014..pdf: 1444579 bytes, checksum: 17272fc64c2d76578d08692395e65bfe (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-24T16:05:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DOUGLAS ALEXANDRE SARAIVA LEÃO - TESE PPGEP 2014..pdf: 1444579 bytes, checksum: 17272fc64c2d76578d08692395e65bfe (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / A matriz energética brasileira é uma das mais limpas do mundo e, atualmente, mais de 45% de toda energia consumida no país provém de fontes renováveis. O álcool é um combustível que já tem o seu lugar assegurado nessa matriz, diante disso, o etanol de segunda geração pode se tornar uma fonte de energia para o Brasil e o mundo. Uma planta promissora na produção de bioetanol é o sisal, pois possui 90 % de açúcares fermentáveis e 10 % a mais de celulose que a cana-de-açúcar, além disso, o Brasil é o maior produtor de sisal do mundo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a fibra do sisal, quanto à concentração de açucares por CLAE e a composição físico-química e térmica por meio de métodos convencionais e das técnicas de DRX, TG, DSC e MEV; determinar as melhores condições para o pré-tratamento ácido seguido de básico e realizar a hidrólise ácida e enzimática. Além de fermentar o licor hidrolisado de maior concentração de glicose. Para avaliar o pré-tratamento e a hidrólise ácida, usou-se duas granulometrias 0,21 e 0,49 mm da fibra e verificou-se os efeitos da temperatura e concentração de ácido na produção da xilose e glicose, utilizando como ferramenta um planejamento experimental fatorial. Para avaliar a hidrólise enzimática, verificou-se, por meio da aplicação de um planejamento experimental fatorial, o efeito da carga enzimática e a razão massa seca de fibra de sisal e extrato enzimático. Foram usadas as enzimas comerciais Celluclast 1.5L da Novozyme e betaglicosidase da Proenzyme. O pré-tratamento ácido seguido de básico mostrou-se bastante eficiente em concentrar a celulose, pela retirada da hemicelulose e lignina, provocando um aumento da celulose de 54 para 83%. Evidenciou-se a cristalinidade da fibra de sisal, comprovada por Difração de Raios X, modificou-se a morfologia da fibra, verificada por Microscopia Eletrônica de Varredura, e, por meio da Termogravimetria e Calorimetria Exploratória Diferencial comprovou-se a degradação da hemicelulose e lignina. Com o material pré-tratado, o processo de hidrólise enzimática foi mais eficiente na sacarificação, não ocorrendo eficácia para a hidrólise ácida. A hidrólise ácida com o material sem prétratamento provocou a sacarificação da celulose, no entanto, os valores obtidos de glicose são menores do que os obtidos na hidrólise enzimática que foi de 39000 ± 2700 mg.L-1. O licor hidrolisado enzimaticamente foi usado para a produção de etanol por meio de fermentação submersa, utilizando S. cerevisiae (Y904), desta forma, obteve-se uma produção de etanol de 19,4 g.L-1 em 7,3 h de fermentação. O monitoramento da cinética fermentativa em reator de batelada permitiu a avaliação do consumo de glicose, produção de etanol e massa microbiana. Em nível laboratorial a taxa especifica máxima de crescimento foi de 0,3 h-1, 96% de rendimento e produtividade de 2,7 g. L-1.h-1. / The Brazilian energy matrix is one of the cleanest in the world and currently more than 45% of all energy consumed in the country comes from renewable sources. The alcohol is a fuel already has its place assured in the Brazilian energy matrix, therefor the second-generation ethanol can become a source of energy for Brazil and the world. A promising plant to produce bioethanol is the sisal because it has 90% of fermentable sugars and 10% more cellulose than sugar cane, in addition to Brazil is the world's largest sisal producer. The objective was to characterize the sisal fiber, as the concentration of sugars by HPLC and the physicochemical composition chemical and thermal by means of conventional methods and techniques XRD, TG, DSC and MEV; determine the best conditions for the pre-treatment followed by acid perform basic and acidic and enzymatic hydrolysis. In addition to ferment the hydrolyzate liquor higher concentration of glucose. To evaluate the pre-treating and the acid hydrolysis it was used two grain sizes 0.21 and 0.49 mm fiber and found the effects of temperature and the concentration of acid in the production of xylose and glucose using as a tool factorial design. To assess the enzymatic hydrolysis was verified by applying a factorial design, the load effect enzyme and the dry weight ratio of sisal fiber and enzyme extract. The were used commercial enzymes of Celluclast 1.5L and Novozyme beta-glucosidase proenzyme. The pretreatment followed basic acid proved to be very effective in concentrating cellulose, by removing the hemicellulose and lignin, resulting in an increase in cellulose from 54 to 83%. Revealed a crystallinity of sisal fiber, proven by X-ray diffraction, has changed the morphology of the fiber, verified by microscopy Scanning Electron, and by Thermogravimetry and Scanning Calorimetry Differential proved the degradation of hemicellulose and lignin. With the material pretreated the enzymatic hydrolysis process was more efficient in saccharification, not occurring efficiency for acid hydrolysis. Acid hydrolysis of the material without pretreatment caused saccharification of cellulose however the values obtained glucose are smaller than those obtained in the enzymatic hydrolysis was 39000 ± 2700 mg l-1. The enzymatically hydrolysed liquor was used to produce ethanol by through submerged fermentation using S. cerevisiae (Y904), this way was obtained an ethanol yield of 19.4 gL1 in 7.3h of fermentation. The monitoring fermentation kinetics in batch reactor allowed assessment of glucose uptake, ethanol and microbial mass. In laboratory level the maximum specific rate growth was 0.3 h-1, 96% yield and productivity 2.7 g.L-1.h-1.

Submitted by Emanuel Varela Cardoso (emanuel.varela@ufcg.edu.br) on 2018-06-04T20:46:40Z No. of bitstreams: 1 DANIEL BARACUY DA CUNHA CAMPOS – TESE (PPGEP) 2015.pdf: 3497658 bytes, checksum: 6dcb8085c55f4c0f3aee4733980bdacd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-04T20:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIEL BARACUY DA CUNHA CAMPOS – TESE (PPGEP) 2015.pdf: 3497658 bytes, checksum: 6dcb8085c55f4c0f3aee4733980bdacd (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / Capes / Os resíduos lignocelulósicos são os mais abundantes no mundo e há atualmente uma preocupação mundial em aproveitá-los como matéria-prima na produção de bioetanol, sendo isso possível devido a esses resíduos serem materiais ricos em celulose. A celulose é um polímero de cadeia longa composta de um só monômero a glicose, unidos por uma ligação glicosídica β-1-4. A glicose pode ser transformada em álcool etílico via fermentação, podendo a mesma ser obtida da celulose via hidrólise enzimática ou via hidrólise ácida. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial da utilização do sorgo sacarino (Sorghum bicolor L. Moench) através da hidrólise enzimática, para produção de açúcares fermentescíveis. O sorgo sacarino foi caracterizado fisico-quimicamente in natura e após as etapas de pré-tratamento através de métodos convencionais e por meio das técnicas DRX, MEV, TG, DSC, também foram realizadas análises granulométricas, ensaios de resistência a flexão e quantificação de açúcares pelo método CLAE. Foram realizadas etapas de pré-tratamento básico e ácido, cujas foram conduzidas em um reator pressurizado, assim como realizado a hidrólise enzimática, em ambos os processos foi utilizado como ferramenta um planejamento experimental 23, no qual foi avaliado o tempo, temperatura e concentração de NaOH e H2SO4 nas etapas de prétratamento, e o efeito da carga enzimática (FPU.g-1), da relação massa de sorgo/volume extrato (g.mL-1) e a rotação do shaker, para etapa de hidrólise. Foram utilizadas na hidrólise enzimática as enzimas comercias Celluclast 1.5L da Novozyme e a betaglicosidase da Proenzyme, 3,00g de substrato, temperatura de 55 °C e pH 4,8. As etapas de pré-tratamento concentraram a alfa-celulose, a qual passou de 32,75% no sorgo in natura para 66,15% no sorgo pré-tratado básico e 54,99% no sorgo pré-tratado básico seguido de pré-tratamento ácido. As análises por DRX comprovaram mudanças na cristalinidade do material e as análises por MEV mostraram modificações na morfologia do bagaço. Por meio das análises de TG/DTG e DSC foi comprovado a degradação da hemicelulose e lignina, quando se utilizou os pré-tratamentos. Através do ensaio de resistência a flexão verificou-se mudanças nas propriedades mecânicas do sorgo in natura, para sorgo após etapas de pré-tratamento. A hidrólise enzimática foi realizada no sorgo sacarino in natura e pré-tratado com NaOH, obteve-se uma concentração de glicose de 16713,7 mg.L-1 para o sorgo sacarino in natura e de 31639,3 mg.L-1 para o bagaço pré-tratado com NaOH, ambos no tempo de hidrólise de 48 horas. / The lignocellulosic residues are the most abundant in the world and currently there is a worldwide concern in reuses them as raw material in the production of bioethanol, its being possible due to these waste materials are rich in cellulose. Cellulose is a long chain polymer composed of one monomer glucose, linked by a glycosidic bond β-1-4. Glucose can be converted into ethyl alcohol via fermentation, and this can be achieved by enzymatic hydrolysis of cellulose and via acid hydrolysis. The main goal of this work was to evaluate the potential use of sweet sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) by enzymatic hydrolysis to produce fermentable sugars. The sorghum was characterized physico-chemically in nature and after completes the pretreatment steps by conventional methods and through techniques of DRX, MEV, TG, DSC, It was also held grain size analysis strength flexion assay and sugars quantification by CLAE method. The basic pretreatment steps ware performed and acid, which were conducted in a pressurized reactor, as carried out enzymatic hydrolysis in both cases it was used as an experimental planning tool, design 23, in which was evaluated time, temperature and NaOH and H2SO4 concentration, in the stages of pretreatment, and the effect of the enzyme load (FPU.g-1), the mass of sorghum / volume ratio extract (g.mL-1) and the rotation shaker for hydrolysis step. They were used in the enzymatic hydrolysis of commercial enzymes Celluclast 1.5L and Novozyme beta-glucosidase proenzyme, 3,00g substrate temperature of 55 °C and pH 4.8, The pretreatment steps concentrate alpha-cellulose, which increased from 32.75% to sorghum in nature to 66.15% in the basic pre-treated sorghum and 54.99% in the basic pretreated sorghum followed by pretreatment acid. The DRX analyzes confirmed changes in crystallinity and MEV analysis showed changes in the residue morphology. Through TG/DTG and DSC analysis was confirmed the hemicellulose and lignin degradation, when using pretreatments. Through the flexural strength assay was found that are changes in the mechanical properties of the in nature sorghum after pretreatment steps. Enzymatic hydrolysis was conducted on sweet sorghum in natura and pretreated with NaOH, obtained a glucose concentration of 16713.7 mg l-1 for sweet sorghum in nature and 31639.3 mg L-1 for the pre-treated pulp with NaOH, both in the hydrolysis time was 48 hours.