A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

Neste trabalho, avaliou-se o potencial do uso de oxidantes quirais em oxidações enantiosseletivas de compostos orgânicos de boro. É de conhecimento geral que compostos orgânicos de boro, especialmente ésteres e ácidos borônicos são facilmente oxidados por hidroperóxidos em meio básico. No entanto, são escassos na literatura exemplos destas reações de modo enantiosseletivo. A fim de realizar as reações mencionadas, sintetizou-se os hidroperóxidos quirais TADOOH ({(4R,5R)-5-[(hidroperoxidifenil)metil]-2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4il}difenilmetanol) e o hidroperóxido quiral derivado de carboidrato, 2,3-dideoxi1-O-oxidanil-4,6-di-O-pivaloil-α-D-eritro-hex-2-enopiranose (di-O-PivOOH). Estes compostos apresentaram resultados interessantes na literatura em oxidações enantiosseletiva de sulfetos orgânicos, em epoxidações de alcenos e em oxidações de Baeyer-Villiger. Inicialmente o potencial oxidativo de ambos hidroperóxidos, bem como a seletividade destes, foi avaliado frente a diversos ésteres borônicos, sendo que somente o TADOOH apresentou resultados promissores. (Ver esquema no PDF) Observou-se uma melhor seletividade do TADOOH frente a ésteres borônicos que possuíam grupos carbonílicos em sua estrutura. Ao submeter o β-boronil-éster, 3-fenil-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)propanoato de etila, à oxidação com o TADOOH em THF utilizando NaOH como base, a -30°C por 1 hora, obteve-se o respectivo álcool com 40% de e.e. Cálculos de DFT para o estado de transição na oxidação dos ésteres borônicos com o TADOOH foram realizados em colaboração com o grupo do Prof. Dr. Ataualpa Albert Carmo Braga. Estes cálculos demonstraram que o estado de transição é estabilizado por uma ligação de hidrogênio não clássica entre o oxigênio da carbonila e umas das ligações C-H dos grupos fenila do TADOOH. Além dos estudos relatados, a reconhecida metodologia de Sharpless na epoxidação assimétrica de alcoóis alílicos foi adaptada para a oxidação enantiosseletiva de ésteres borônicos. Ao trocar o ligante derivado de éster tártarico, normalmente utilizado nas epoxidações de Sharpless, por (-)-efedrina observou-se uma moderada seletividade deste sistema frente ao pinacol l-fenietilboronato. Investigações mais detalhadas demonstraram que a presença do Ti(IV) não era necessária, sendo que a (-)efedrina era a responsável pela ativação e indução quiral nesta reação. / In this work, it was investigated the potential use of chiral oxidants in organic boron compound oxidation. It is known in the literature, that organic boron compounds can be easily oxidized by hydroperoxides. However, an enantioselective approach in literature is scarce. In order to perform these reactions, hydroperoxide TADOOH ({(4R,5R)-5[(hydroperoxydiphenyl)methyl]-2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-yl}diphenylmethanol) and carbohydrate derived hydroperoxide, 2,3-dideoxy-1-O-oxidanyl-4,6-di-O-pivaloyl-α-D-erythro-hex-2-enopyranose (di-O-PivOOH), have been synthesized. These compounds showed interesting results in several enantioselective oxidations, as like, organic sulfides oxidation, alkenes epoxidation and Baeyer-Villiger oxidations. The oxidative potential of both hydroperoxides, as well as their selectivity, were evaluated against several boronic esters. Only TADOOH has shown promissing results for further studies. (See Scheme on PDF). Boronic esters containing a carbonyl moiety showed better selectivities with TADOOH, for example, the reaction of β-boronyl-ester, ethyl 3-phenyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)propanoate, gave the correponding alcohol with 40% e.e. DFT calculations for the transition state in the oxidation of the boronic esters with TADOOH were carried out in collaboration with the group of Prof. Dr. Ataualpa Albert Carmo Braga. These calculations have shown that the transition state is stabilized by a non-classical hydrogen bond between the carbonyl oxygen and one of the C-H bonds of the TADOOH phenyl groups. In addition to the studies, the well-known Sharpless protocol for asymmetric epoxidation of allylic alcohols was adapted in the enantioselective oxidation of boronic esters. By replacing the tartaric ester-derived, commonly used in the Sharpless experiments, for (-)-ephedrine moderate selectivity was observed with pinacol 1-phenylethyl boronate. Further investigations showed that the presence of Ti (IV) was not necessary, and (-)-ephedrine was responsible for the activation and chiral induction in this reaction.

A oxidação lipídica é uma das causas de deterioração e perda de qualidade dos alimentos. Com a intenção de reduzir ou inibir essa reação, são empregados antioxidantes sintéticos. No entanto, com a crescente preocupação sobre o efeito dos mesmos sobre a saúde, diversas pesquisas têm por objetivo buscar alternativas de fontes naturais. A atividade antioxidante de frutas tem sido muito estudada. A acerola se destaca devido aos seus componentes, como o ácido ascórbico, compostos fenólicos, carotenoides e antocianinas, conferindo elevada capacidade antioxidante, principalmente no estádio de maturação verde, o qual pode ser explorado como base para aditivo para a indústria alimentícia. A técnica de microencapsulação pode facilitar a aplicação, proteger os compostos ativos e favorecer sua liberação controlada em um produto. O objetivo deste trabalho foi obter extratos de frutos de acerola em condições otimizadas e submetê-los ao processo de microencapsulação, visando avaliar seu potencial de aplicação como antioxidante em emulsão lipídica. Foi realizada a otimização da extração de compostos ativos de amostras de frutos verdes e maduros de acerola por meio da metodologia de Superfície de Resposta, em que foram determinados os efeitos da proporção amostra:solvente e tempo sobre a atividade antioxidante (DPPH e ABTS) e compostos fenólicos totais (CFT). Os extratos obtidos em condições otimizadas foram caracterizados quanto ao teor de compostos fenólicos totais (CFT), atividade antioxidante (DPPH, ABTS, ORAC-H e FRAP), teores de ácido ascórbico e compostos fenólicos (clorogênico, ferúlico e p-cumárico). O extrato com maior atividade antioxidante foi selecionado para a obtenção de micropartículas por spray drying, com adição de goma arábica e maltodextrina. As micropartículas foram caracterizadas (umidade, aw, solubilidade, higroscopicidade, tamanho de partículas), avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e também quanto à manutenção da atividade antioxidante. As micropartículas, o extrato aquoso de acerola otimizado e o antioxidante sintético TBHQ (Terci-Butil-Hidroquinona) foram aplicados em sistema modelo de emulsão em concentrações de até 200 mg. Kg-1. As emulsões foram submetidas ao teste acelerado de oxidação a 40°C por 9 dias, com acompanhamento da variação do teor de hidroperóxidos, dienos conjugados e índice de cremeação (CI) a cada 3 dias. A otimização propiciou a obtenção de extratos com elevada atividade antioxidante. Para os frutos maduros a melhor proporção amostra:solvente (água) foi de 1:30, já para frutos verdes foi de 1:40. O tempo ótimo identificado foi 10 minutos de extração. Os extratos de frutos verdes apresentaram atividade antioxidante superior aos de frutos maduros, bem como elevadas concentrações de ácido ascórbico e ácidos fenólicos. As micropartículas apresentaram baixa umidade e atividade de água. A maior solubilidade e menor higroscopicidade foi verificada nas produzidas com maltodextrina. Ambas apresentaram partículas pequenas e características tecnológicas adequadas para aplicação em alimentos; entretanto a micropartícula produzida com goma arábica se destacou pelo elevado rendimento no processo e proteção da atividade antioxidante. Os tratamentos com a adição de micropartículas em emulsões apresentaram efeito protetor significativo e semelhante ao antioxidante sintético TBHQ nas concentrações de 100 e 200 mg.kg-1 na avaliação da oxidação lipídica. No entanto, o efeito protetor conferido pela adição de micropartículas com goma arábica e de mistura de micropartículas a 200 mg.kg-1 permitiram maior controle do processo oxidativo, com a observação de baixos teores de hidroperóxidos, dienos conjugados e menores índices de cremeação durante o teste acelerado. Conclui-se que extratos microencapsulados de frutos verdes de acerola são promissores para aplicação em emulsões lipídicas e apresentam potencial para substituir antioxidantes sintéticos em alimentos e cosméticos. / Lipid oxidation is one of the major causes of deterioration and loss of food quality. Synthetic antioxidants are applied in order to reduce or inhibit this reaction. However, with growing concern about health aspects of these antioxidants, several research aims to find alternatives from natural sources. The antioxidant activity in fruits has been studied. Acerola stands out due to its components, such as ascorbic acid, phenolic compounds, carotenoids and anthocyanins, that may are related to high antioxidant capacity, specially at the green maturation stage, which can be exploited as an additive for the food industry. The microencapsulation technique may facilitate its apllication by protecting the compounds and promoting controlled release of active compounds. The objective of this work was to obtain extracts of acerola fruit under optimized conditions and to submit them to the microencapsulation process, aiming to evaluate its potential application as antioxidant in lipid emulsion. The optimization of the extraction of active compounds from green and ripe acerola fruits was achieved through response surface methodology, in which the effects of proportion sample:solvent and time on the antioxidant activity (DPPH and ABTS) and total phenolic compouns (TPC) were determided. The extracts obtained under optimized conditions were characterized as the content of total phenolic compounds (TPC), antioxidant activity (DPPH, ABTS, ORAC-H and FRAP), ascorbic acid and phenolic compounds (chlorogenic, ferulic, and p-coumaric acids). The extract with greater antioxidant activity was selected to obtain microparticles by spray drying, with addition of gum arabic and maltodextrin. The microparticles were characterized (moisture, water activity, hygroscopicity, solubility, particle size), evaluated by scanning electron microscopy (SEM) and the maintenance of the antioxidant activity. The microparticles, the optimized aqueous acerola extract and the synthetic antioxidant TBHQ (terc-butyl-hydroquinone) were applied in model system of emulsion in concentrations up to 200 mg. Kg-1. The emulsions were subjected to accelerated oxidation test at 40°C for 9 days, with monitoring of the variation of the hydroperoxides content, conjugated dienes and creaming index (CI) every 3 days. The optimization promoted to obtention of extracts with high antioxidant activity. For the ripe fruits the best sample:solvent (water) ratio was 1:30 and for green fruits it was 1:40. Optimum time identified was 10 minutes of extraction. The extracts of green fruits showed higher antioxidant activity than mature fruits, as well as higher concentrations of ascorbic acid and phenolic acids. The microparticles had low moisture content and water activity. The greater solubility and lower hygroscopicity was observed in those produced with maltodextrin. Both showed small particles and technological characteristics suitable for application in food; however the microparticle produced with gum arabic was distinguished by the high yield in the process and protection of the antioxidant activity. The treatments with addition of microparticles in emulsions showed significant protective effect similar to the synthetic antioxidant (TBHQ) at concentrations of 100 and 200 mg.kg-1 in the evaluation of lipid oxidation. However, the protective effect conferred by the addition of microparticles with gum arabic and a mixture of microparticles at 200 mg.kg-1 allowed the greater control of the oxidative process, with the observation of low hydroperoxides content, conjugated dienes and lower creaming inde during the accelerated test. It is concluded that microencapsulated extracts of green acerola fruits are a promising for application in lipid emulsions and show a potential to replace synthetic antioxidants in food and cosmetics.

O colesterol é um importante componente das membranas celulares em eucariotos superiores, desempenhando papéis estruturais e funcionais. O colesterol possui uma insaturação em sua estrutura sendo, portanto, alvo de oxidação mediada por espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio. A oxidação não enzimática do colesterol gera, como produtos primários, os hidroperóxidos de colesterol. Tais moléculas, por sua vez, são altamente reativas e podem reagir com metais livres e/ou metaloproteínas, trazendo consequências à celula. Neste sentido, o primeiro capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação dos hidroperóxidos de colesterol (ChOOH) com o citocromo c (citc), uma heme proteína envolvida no transporte de elétrons na mitocôndria. Análises de espectroscopia no UV-Vis mostraram que o ChOOH promove o bleaching da banda Soret do citc de uma maneira dose-dependente. Mais ainda, esta reação leva à formação de radicais centrados em carbono tanto na proteína como no lipídeo, sugerindo uma redução homolítica do ChOOH. Como consequências, pode-se observar a oligomerização do citc, um processo que pode influenciar no transporte de elétrons bem como na sinalização para a apoptose. A partir da reação do citc com ChOOH podem surgir, direta ou indiretamente, outras espécies reativas, como aldeídos, cetonas e epóxidos. Dentre estas, destacam-se os aldeídos de colesterol, em particular o colesterol secoaldeído (CSec) e o carboxialdeído (ChAld), uma vez que foram encontrados elevados em placas ateroscleróticas e em tecidos cerebrais de pacientes com doenças neurodegenerativas. Tais espécies podem reagir com resíduos de aminoácidos provocando alterações estruturais e funcionais em proteínas. Neste sentido, o segundo capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação do ChAld com citc. Usando modelos mimétivos de membrana e espectrometria de massas, foi mostrado que o ChAld modifica covalentemente o citc por um mecanismo consistente com a formação de bases de Schiff. Tal modificação ocorre preferencialmente em resíduos de lisina que interagem com a membrana. Estas modificações influenciam na afinidade do citc pela membrana, aumentando sua aderência, o que pode ter influência no transporte de elétrons e sinalização para a apoptose. No terceiro e último capítulo deste trabalho nós buscamos uma ferramente analítica que permitisse analisar modificação de proteínas promovidas por produtos de oxidação de colesterol e outros esteróis. Em um estudo realizado em colaboração com o grupo do professor Porter na Universidade de Vanderbilt, utilizamos ensaios baseados em click chemistry para buscar proteínas modificadas. Para isso, foram sintetizados derivados de colesterol e 7-deidrocolesterol (7-DHC, precursor imediato do colesterol) contendo um grupo alquinil na sua cadeia lateral. Este grupo pode ser ligado a um grupo azida por meio de uma reação de cicloadição, em um processo conhecido como click chemistry. Após a síntese e caracterização dos derivados lipídicos contendo o grupo alquinil na cadeia lateral, células Neuro2a foram tratadas com o alquinil-7-DHC e o alquinil-colesterol para averiguar seu metabolismo. Análises por HPLC-MS/MS mostraram que ambos derivados contendo o grupo alquinil foram metabolisados e convertdos nos respectivos ésteres. Usando um modelo celular para a doença conhecida como Sindrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS), doença caracterizada pela deficiência na enzima 7-deidrocolesterol redutase, foi mostrado que o acúmulo característico de 7-DHC nos pacientes pode levar a uma maior modificação de proteínas promovidas por seus derivados, o que pode contribuir para o desenvolvimento da doença. / Cholesterol is an important component of eukaryotic cellular membranes, where it has an influence in the fluidity and stability. Due to the presence of a double bond in its structure, cholesterol can be oxidized by reactive oxygen and nitrogen species. This non-enzymatic oxidation generates, as primary products, cholesterol hydroperoxides. Such molecules, in turn, are highly reactive and can react with free metal ions and/or metalloproteins, affecting cell metabolism. Therefore, the first chapter of the present study aims to investigate the reaction of cholesterol hydroperoxides (ChOOH) with cytochrome c (cytc), a heme protein involved in the mitochondrial electron transport. Spectroscopic analyses in the UV-Vis region showed that ChOOH induces a dose-dependent bleaching of cytc\'s Soret band. In addition, this reaction leads to the formation of carbon-centered radicals on both protein and lipid, suggesting a homolytic reduction of ChOOH. As consequences, cytc undergoes oligomerization, a process that can influence electron transport and apoptosis signaling. The reaction of cytc and ChOOH can produce, directly or indirectly, reactive species such as epoxides, aldehydes and ketones. Among them, cholesterol aldehydes, such as cholesterol secoaldehyde (CSec) and cholesterol carboxyaldehyde (ChAld), are of particular interest, since they were previously found elevated in atherosclerotic plaques and brain tissue of patients bearing neurodegenerative diseases. These species can also react with amino acid residues leading to protein denaturation and malfunction. With that in mind, the second chapter of this study aims to investigate the reaction of ChAld and cytc. Using mimetic membrane models and mass spectrometry analyses, we showed that ChAld covalently modifies cytc through a mechanism consistent with the formation of Schiff base adducts. Such modification occurs mostly at lysine residues that are known to interact with the membrane. The modifications have an influence in the affinity of cytc to the membrane, where they increase its binding to the membrane, a process that could affect the electron transport and apoptosis signaling. In the last and third chapter of this study we wanted an analytical tool that allowed the investigation of protein adduction promoted by cholesterol and other sterols-derived oxidation products. In a study performed in collaboration with the Porter group from Vanderbilt University, we used analyses based on click chemistry to search for protein adduction. To address that, we first synthesized derivatives of cholesterol and 7-dehydrocholesterol (7-DHC, the immediate precursor of cholesterol) containing an alkynyl group in the side chain. The alkynyl group can be ligated to an azide group through a cycloaddition reaction, in a process known as click chemistry. After the synthesis and characterization of alkynyl derivatives, Neuro2a cells were treated with alkynyl-7-DHC and alkynyl-cholesterol to check their metabolism. HPLC-MS/MS analyses showed that both alkynyl derivatives are metabolized and converted into their respective esters. In addition, using a cell model for Smith-Lemli-Optiz Syndrome (SLOS), a disease characterized by the deficiency in the dehydrocholesterol reductase 7, we showed that the characteristic accumulation of 7-DHC in SLOS patients might be associated with protein adduction promoted by its oxidation products, which might contribute to the development of the disease.

O colesterol é um importante componente das membranas celulares em eucariotos superiores, desempenhando papéis estruturais e funcionais. O colesterol possui uma insaturação em sua estrutura sendo, portanto, alvo de oxidação mediada por espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio. A oxidação não enzimática do colesterol gera, como produtos primários, os hidroperóxidos de colesterol. Tais moléculas, por sua vez, são altamente reativas e podem reagir com metais livres e/ou metaloproteínas, trazendo consequências à celula. Neste sentido, o primeiro capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação dos hidroperóxidos de colesterol (ChOOH) com o citocromo c (citc), uma heme proteína envolvida no transporte de elétrons na mitocôndria. Análises de espectroscopia no UV-Vis mostraram que o ChOOH promove o bleaching da banda Soret do citc de uma maneira dose-dependente. Mais ainda, esta reação leva à formação de radicais centrados em carbono tanto na proteína como no lipídeo, sugerindo uma redução homolítica do ChOOH. Como consequências, pode-se observar a oligomerização do citc, um processo que pode influenciar no transporte de elétrons bem como na sinalização para a apoptose. A partir da reação do citc com ChOOH podem surgir, direta ou indiretamente, outras espécies reativas, como aldeídos, cetonas e epóxidos. Dentre estas, destacam-se os aldeídos de colesterol, em particular o colesterol secoaldeído (CSec) e o carboxialdeído (ChAld), uma vez que foram encontrados elevados em placas ateroscleróticas e em tecidos cerebrais de pacientes com doenças neurodegenerativas. Tais espécies podem reagir com resíduos de aminoácidos provocando alterações estruturais e funcionais em proteínas. Neste sentido, o segundo capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação do ChAld com citc. Usando modelos mimétivos de membrana e espectrometria de massas, foi mostrado que o ChAld modifica covalentemente o citc por um mecanismo consistente com a formação de bases de Schiff. Tal modificação ocorre preferencialmente em resíduos de lisina que interagem com a membrana. Estas modificações influenciam na afinidade do citc pela membrana, aumentando sua aderência, o que pode ter influência no transporte de elétrons e sinalização para a apoptose. No terceiro e último capítulo deste trabalho nós buscamos uma ferramente analítica que permitisse analisar modificação de proteínas promovidas por produtos de oxidação de colesterol e outros esteróis. Em um estudo realizado em colaboração com o grupo do professor Porter na Universidade de Vanderbilt, utilizamos ensaios baseados em click chemistry para buscar proteínas modificadas. Para isso, foram sintetizados derivados de colesterol e 7-deidrocolesterol (7-DHC, precursor imediato do colesterol) contendo um grupo alquinil na sua cadeia lateral. Este grupo pode ser ligado a um grupo azida por meio de uma reação de cicloadição, em um processo conhecido como click chemistry. Após a síntese e caracterização dos derivados lipídicos contendo o grupo alquinil na cadeia lateral, células Neuro2a foram tratadas com o alquinil-7-DHC e o alquinil-colesterol para averiguar seu metabolismo. Análises por HPLC-MS/MS mostraram que ambos derivados contendo o grupo alquinil foram metabolisados e convertdos nos respectivos ésteres. Usando um modelo celular para a doença conhecida como Sindrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS), doença caracterizada pela deficiência na enzima 7-deidrocolesterol redutase, foi mostrado que o acúmulo característico de 7-DHC nos pacientes pode levar a uma maior modificação de proteínas promovidas por seus derivados, o que pode contribuir para o desenvolvimento da doença. / Cholesterol is an important component of eukaryotic cellular membranes, where it has an influence in the fluidity and stability. Due to the presence of a double bond in its structure, cholesterol can be oxidized by reactive oxygen and nitrogen species. This non-enzymatic oxidation generates, as primary products, cholesterol hydroperoxides. Such molecules, in turn, are highly reactive and can react with free metal ions and/or metalloproteins, affecting cell metabolism. Therefore, the first chapter of the present study aims to investigate the reaction of cholesterol hydroperoxides (ChOOH) with cytochrome c (cytc), a heme protein involved in the mitochondrial electron transport. Spectroscopic analyses in the UV-Vis region showed that ChOOH induces a dose-dependent bleaching of cytc\'s Soret band. In addition, this reaction leads to the formation of carbon-centered radicals on both protein and lipid, suggesting a homolytic reduction of ChOOH. As consequences, cytc undergoes oligomerization, a process that can influence electron transport and apoptosis signaling. The reaction of cytc and ChOOH can produce, directly or indirectly, reactive species such as epoxides, aldehydes and ketones. Among them, cholesterol aldehydes, such as cholesterol secoaldehyde (CSec) and cholesterol carboxyaldehyde (ChAld), are of particular interest, since they were previously found elevated in atherosclerotic plaques and brain tissue of patients bearing neurodegenerative diseases. These species can also react with amino acid residues leading to protein denaturation and malfunction. With that in mind, the second chapter of this study aims to investigate the reaction of ChAld and cytc. Using mimetic membrane models and mass spectrometry analyses, we showed that ChAld covalently modifies cytc through a mechanism consistent with the formation of Schiff base adducts. Such modification occurs mostly at lysine residues that are known to interact with the membrane. The modifications have an influence in the affinity of cytc to the membrane, where they increase its binding to the membrane, a process that could affect the electron transport and apoptosis signaling. In the last and third chapter of this study we wanted an analytical tool that allowed the investigation of protein adduction promoted by cholesterol and other sterols-derived oxidation products. In a study performed in collaboration with the Porter group from Vanderbilt University, we used analyses based on click chemistry to search for protein adduction. To address that, we first synthesized derivatives of cholesterol and 7-dehydrocholesterol (7-DHC, the immediate precursor of cholesterol) containing an alkynyl group in the side chain. The alkynyl group can be ligated to an azide group through a cycloaddition reaction, in a process known as click chemistry. After the synthesis and characterization of alkynyl derivatives, Neuro2a cells were treated with alkynyl-7-DHC and alkynyl-cholesterol to check their metabolism. HPLC-MS/MS analyses showed that both alkynyl derivatives are metabolized and converted into their respective esters. In addition, using a cell model for Smith-Lemli-Optiz Syndrome (SLOS), a disease characterized by the deficiency in the dehydrocholesterol reductase 7, we showed that the characteristic accumulation of 7-DHC in SLOS patients might be associated with protein adduction promoted by its oxidation products, which might contribute to the development of the disease.

Neste trabalho, avaliou-se o potencial do uso de oxidantes quirais em oxidações enantiosseletivas de compostos orgânicos de boro. É de conhecimento geral que compostos orgânicos de boro, especialmente ésteres e ácidos borônicos são facilmente oxidados por hidroperóxidos em meio básico. No entanto, são escassos na literatura exemplos destas reações de modo enantiosseletivo. A fim de realizar as reações mencionadas, sintetizou-se os hidroperóxidos quirais TADOOH ({(4R,5R)-5-[(hidroperoxidifenil)metil]-2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4il}difenilmetanol) e o hidroperóxido quiral derivado de carboidrato, 2,3-dideoxi1-O-oxidanil-4,6-di-O-pivaloil-α-D-eritro-hex-2-enopiranose (di-O-PivOOH). Estes compostos apresentaram resultados interessantes na literatura em oxidações enantiosseletiva de sulfetos orgânicos, em epoxidações de alcenos e em oxidações de Baeyer-Villiger. Inicialmente o potencial oxidativo de ambos hidroperóxidos, bem como a seletividade destes, foi avaliado frente a diversos ésteres borônicos, sendo que somente o TADOOH apresentou resultados promissores. (Ver esquema no PDF) Observou-se uma melhor seletividade do TADOOH frente a ésteres borônicos que possuíam grupos carbonílicos em sua estrutura. Ao submeter o β-boronil-éster, 3-fenil-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)propanoato de etila, à oxidação com o TADOOH em THF utilizando NaOH como base, a -30°C por 1 hora, obteve-se o respectivo álcool com 40% de e.e. Cálculos de DFT para o estado de transição na oxidação dos ésteres borônicos com o TADOOH foram realizados em colaboração com o grupo do Prof. Dr. Ataualpa Albert Carmo Braga. Estes cálculos demonstraram que o estado de transição é estabilizado por uma ligação de hidrogênio não clássica entre o oxigênio da carbonila e umas das ligações C-H dos grupos fenila do TADOOH. Além dos estudos relatados, a reconhecida metodologia de Sharpless na epoxidação assimétrica de alcoóis alílicos foi adaptada para a oxidação enantiosseletiva de ésteres borônicos. Ao trocar o ligante derivado de éster tártarico, normalmente utilizado nas epoxidações de Sharpless, por (-)-efedrina observou-se uma moderada seletividade deste sistema frente ao pinacol l-fenietilboronato. Investigações mais detalhadas demonstraram que a presença do Ti(IV) não era necessária, sendo que a (-)efedrina era a responsável pela ativação e indução quiral nesta reação. / In this work, it was investigated the potential use of chiral oxidants in organic boron compound oxidation. It is known in the literature, that organic boron compounds can be easily oxidized by hydroperoxides. However, an enantioselective approach in literature is scarce. In order to perform these reactions, hydroperoxide TADOOH ({(4R,5R)-5[(hydroperoxydiphenyl)methyl]-2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-yl}diphenylmethanol) and carbohydrate derived hydroperoxide, 2,3-dideoxy-1-O-oxidanyl-4,6-di-O-pivaloyl-α-D-erythro-hex-2-enopyranose (di-O-PivOOH), have been synthesized. These compounds showed interesting results in several enantioselective oxidations, as like, organic sulfides oxidation, alkenes epoxidation and Baeyer-Villiger oxidations. The oxidative potential of both hydroperoxides, as well as their selectivity, were evaluated against several boronic esters. Only TADOOH has shown promissing results for further studies. (See Scheme on PDF). Boronic esters containing a carbonyl moiety showed better selectivities with TADOOH, for example, the reaction of β-boronyl-ester, ethyl 3-phenyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)propanoate, gave the correponding alcohol with 40% e.e. DFT calculations for the transition state in the oxidation of the boronic esters with TADOOH were carried out in collaboration with the group of Prof. Dr. Ataualpa Albert Carmo Braga. These calculations have shown that the transition state is stabilized by a non-classical hydrogen bond between the carbonyl oxygen and one of the C-H bonds of the TADOOH phenyl groups. In addition to the studies, the well-known Sharpless protocol for asymmetric epoxidation of allylic alcohols was adapted in the enantioselective oxidation of boronic esters. By replacing the tartaric ester-derived, commonly used in the Sharpless experiments, for (-)-ephedrine moderate selectivity was observed with pinacol 1-phenylethyl boronate. Further investigations showed that the presence of Ti (IV) was not necessary, and (-)-ephedrine was responsible for the activation and chiral induction in this reaction.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal causada pela degeneração seletiva dos neurônios motores do cérebro e medula. Dos casos familiares de ELA (fELA), 20% são causados por mutações pontuais no gene da sod1. O ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3, DHA) é um ácido graxo altamente insaturado, sendo um dos principais ácidos graxos da massa cinzenta do cérebro. Estudos têm correlacionado mutações de SOD1 com a formação de agregados que poderiam ser induzidos por ácidos graxos insaturados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos e mecanismos do DHA e de seus hidroperóxidos (DHAOOH) na agregação de SOD1 in vitro. As análises de dicroísmo circular (CD) mostraram mudanças na estrutura secundária de ambas as proteínas apo-SOD1WT e G93A promovidas pelo DHA, resultando em aumento de superfície hidrofóbica e formação de estruturas do tipo beta-amilóide, como mostrado pelos ensaios do bis- ANS e Tioflavina, respectivamente. Estas mudanças resultam na formação de agregados amorfos como observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Espécies de alto peso molecular foram observadas nas incubações do DHA com as formas apo da SOD1 por SDS-PAGE sob condições não redutoras e também por cromatografia de exclusão por tamanho. A formação dos agregados mostrou-se dependente de resíduos de Cys na sua forma desprotonada, visto que agregados não foram observados na presença de beta-mercaptoetanol e sua formação foi inibida na presença de bloqueador de tióis e em pH ácido. Além disso, análises por cromatografia de exclusão mostraram que a agregação é dependente da insaturação e conformação cis dos ácidos graxos. Comparativamente ao DHA, os hidroperóxidos do DHA tiveram um efeito menor na agregação de SOD1, porém revelaram a propriedade de induzir a dimerização covalente de SOD1. No geral, os dados mostram que o DHA induz a agregação de SOD1, através de um processo envolvendo a exposição de superfícies hidrofóbicas, formação de pontes dissulfeto e também de possíveis cross-links envolvendo reações do tipo \"ene-tiol\". / ALS is a progressive and fatal disease caused by selective degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. Twenty percent of familial ALS (fALS) cases are caused mainly by point mutations in the sod1 gene. Docosahexaenoic acid (C22:6, n-3, DHA) is a highly unsaturated fatty acid, wich is one of the main fatty acids in the cerebral gray matter. Studies have linked SOD1 mutations to the formation of aggregates that could be induced by unsaturated fatty acids. The aim of this study was to evaluate the effect of DHA on aggregation of SOD1 fALS mutants in vitro and its mechanisms. CD analysis shows changes in the secondary structure of both apo-SOD1WT and G93A promoted by DHA resulting in an increase in the surface hydrophobicity and formation of structures such as beta amyloid, which was also confirmed by bis-ANS assay and Thioflavin, respectively. These changes enhance the interaction of SOD1 and DHA, leading to amorphous aggregates as revealed by FESEM. Incubation of DHA with apo-SOD1 forms results in high-molecular weight species as detected by SDS-PAGE analyses under non-reducing conditions and also by size exclusion chromatography. This appears to require Cys residues in their thiolate forms because high aggregates are not observed under reducing conditions and also by size exclusion chromatography or at acidic pH. Also, size-exclusion chromatography indicates that the mutant apo-SOD1 aggregation is dependent on the unsaturation and cis-conformation of fatty acids. Compared to the DHA, DHAOOH had a minor effect on SOD1 aggregation, however revealed the ability to induce covalent dimerization of SOD1. Overall, the data suggest a mechanism of DHA aggregation, by a process involving exposure to hydrophobic surfaces, formation of disulfide bonds and also for possible cross-links involving reactions such \"thiol-ene\".

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal causada pela degeneração seletiva dos neurônios motores do cérebro e medula. Dos casos familiares de ELA (fELA), 20% são causados por mutações pontuais no gene da sod1. O ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3, DHA) é um ácido graxo altamente insaturado, sendo um dos principais ácidos graxos da massa cinzenta do cérebro. Estudos têm correlacionado mutações de SOD1 com a formação de agregados que poderiam ser induzidos por ácidos graxos insaturados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos e mecanismos do DHA e de seus hidroperóxidos (DHAOOH) na agregação de SOD1 in vitro. As análises de dicroísmo circular (CD) mostraram mudanças na estrutura secundária de ambas as proteínas apo-SOD1WT e G93A promovidas pelo DHA, resultando em aumento de superfície hidrofóbica e formação de estruturas do tipo beta-amilóide, como mostrado pelos ensaios do bis- ANS e Tioflavina, respectivamente. Estas mudanças resultam na formação de agregados amorfos como observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Espécies de alto peso molecular foram observadas nas incubações do DHA com as formas apo da SOD1 por SDS-PAGE sob condições não redutoras e também por cromatografia de exclusão por tamanho. A formação dos agregados mostrou-se dependente de resíduos de Cys na sua forma desprotonada, visto que agregados não foram observados na presença de beta-mercaptoetanol e sua formação foi inibida na presença de bloqueador de tióis e em pH ácido. Além disso, análises por cromatografia de exclusão mostraram que a agregação é dependente da insaturação e conformação cis dos ácidos graxos. Comparativamente ao DHA, os hidroperóxidos do DHA tiveram um efeito menor na agregação de SOD1, porém revelaram a propriedade de induzir a dimerização covalente de SOD1. No geral, os dados mostram que o DHA induz a agregação de SOD1, através de um processo envolvendo a exposição de superfícies hidrofóbicas, formação de pontes dissulfeto e também de possíveis cross-links envolvendo reações do tipo \"ene-tiol\". / ALS is a progressive and fatal disease caused by selective degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. Twenty percent of familial ALS (fALS) cases are caused mainly by point mutations in the sod1 gene. Docosahexaenoic acid (C22:6, n-3, DHA) is a highly unsaturated fatty acid, wich is one of the main fatty acids in the cerebral gray matter. Studies have linked SOD1 mutations to the formation of aggregates that could be induced by unsaturated fatty acids. The aim of this study was to evaluate the effect of DHA on aggregation of SOD1 fALS mutants in vitro and its mechanisms. CD analysis shows changes in the secondary structure of both apo-SOD1WT and G93A promoted by DHA resulting in an increase in the surface hydrophobicity and formation of structures such as beta amyloid, which was also confirmed by bis-ANS assay and Thioflavin, respectively. These changes enhance the interaction of SOD1 and DHA, leading to amorphous aggregates as revealed by FESEM. Incubation of DHA with apo-SOD1 forms results in high-molecular weight species as detected by SDS-PAGE analyses under non-reducing conditions and also by size exclusion chromatography. This appears to require Cys residues in their thiolate forms because high aggregates are not observed under reducing conditions and also by size exclusion chromatography or at acidic pH. Also, size-exclusion chromatography indicates that the mutant apo-SOD1 aggregation is dependent on the unsaturation and cis-conformation of fatty acids. Compared to the DHA, DHAOOH had a minor effect on SOD1 aggregation, however revealed the ability to induce covalent dimerization of SOD1. Overall, the data suggest a mechanism of DHA aggregation, by a process involving exposure to hydrophobic surfaces, formation of disulfide bonds and also for possible cross-links involving reactions such \"thiol-ene\".

O estudo do processo da peroxidação de lipídios tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido à implicação dos hidroperóxidos de lipídios (LOOH) em diversos processos patológicos. A decomposição destes LOOH é capaz de gerar subprodutos capazes de promover danos em biomoléculas, incluindo proteínas e DNA. No presente trabalho, utilizando hidroperóxidos de ácido linoléico isotopicamente marcado com átomo de oxigênio-18 (LA18O18OH), fomos capazes de demonstrar que estas moléculas gerararam oxigênio singlete marcado [18(1O2)] em células em cultura. A detecção de tal espécie foi possível através da utilização de uma nova metodologia utilizando um derivado antracenico. Para este propósito foi utilizado o derivado de antraceno 3,3\'-(9,10-antracenodiil) bisacrilato (DADB), cujo produto especifico da reação com o 1O2 (o endoperóxido do DADB DADBO2) do pode ser facilmente detectado por HPLC-MS/MS. De forma a expandir a compreensão dos efeitos tóxicos desses LOOH, investigamos o efeito destes compostos gerados intracelularmente. Para tal, foi utilizado o Rosa bengala (RB), um fotosensibilizador que tem afinidade por espaços apolares como membranas e lisossomos. A fotosenssibilização deste composto foi capaz de induzir a morte celular, e esta morte estaria relacionada a uma maior formação de 1O2 e a um maior acumulo de peróxidos. Nestes estudos foi possível demonstrar que carotenóides e sistemas antioxidantes dependentes de glutationa foram capazes de proteger contra os efeitos tóxicos da fotosensibilização na presença de RB. Adicionalmente foram avaliados os efeitos da hemoglobina (Hb) e do hidroperóxido do ácido linoléico (LAOOH) em uma série de parâmetros toxicológicos, como citotoxicidade, estado redox, a peroxidação lipídica e dano ao DNA. Nós demonstramos que a pré-incubação das células com Hb e sua posterior exposição à LAOOH (Hb + LAOOH) levou a um aumento na morte celular, a oxidação do DCFH, formação de malonaldeído e fragmentação do DNA e que esses efeitos estavam relacionados com o grupo peróxido e ao heme presentes na Hb. Foi demonstrado que as células incubadas com LAOOH e Hb apresentaram um nível maior das lesões de DNA; 8-oxo-7,8-diidro-2 \'desoxiguanosina e 1,N2-etheno-2\'-desoxiguanosina. Além disso, as incubações com Hb levaram a um aumento nos níveis de ferro intracelular, e este alto nível de ferro correlacionada com a oxidação do DNA, avaliadas através da medida de sitios EndoIII e Fpg sensíveis. Nossos resultados comprovam que os LAOOHs apresentaram efeito citotóxico e genotóxico, mesmo em concentrações muito baixas, podendo contribuir para o desencadeamento de processos patologicos como o câncer e doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. / The study of the process of lipid peroxidation has increased in recent years, mainly due to the involvement of lipid hydroperoxide (LOOH) in a series of pathological processes. The decomposition of LOOH is able to generate products that can promote damage to biomolecules, including proteins and DNA. In the present work, using linoleic acid hydroperoxide isotopically labeled with 18O2 (LA18O18OH), we demonstrate that these molecules were able to generate labeled singlet oxygen [18(1O2)] in cultured cells. The detection of such species was possible using a new methodology using an anthracene derivative .For this purpose we used the anthracene derivative of 3,3\'-(9,10-antracendiil) bisacrilate (DADB), whose specific reaction product with 1O2 (DADB endoperoxide DADBO2) can be easily detected by HPLC-MS/MS. In order to expand the understanding of the toxic effects of LOOH, we investigated the effect of these compounds generated intracellularly. For this porpoise, we used Rose Bengal (RB), a photosensitizer that has affinity for apolar spaces such as membranes and lysosomes. The photosensitization of this compound was able to induce cell death, and this death was related to increased formation of 1O2 and a higher accumulation of peroxides. In these studies we have shown that carotenoids and glutathione-dependent antioxidant systems were capable of protecting against the toxic effects of photosensitization in the presence of RB. Additionally, we evaluated the effects of hemoglobin (Hb) and linoleic acid hydroperoxide (LAOOH) in a series of toxicological endpoints such as cytotoxicity, redox status, lipid peroxidation and DNA damage. We demonstrated that preincubation of cells with Hb and its subsequent exposure to LAOOH (Hb + LAOOH) led to an increase in cell death, DCFH oxidation, formation of malonaldehyde and DNA fragmentation, and that these effects were related to the peroxide and the heme group. It was demonstrated that cells incubated with LAOOH and Hb showed a higher level of the DNA lesions, 8-oxo-7,8-dihydro-2\'deoxyguanosine and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine. Furthermore, incubations with Hb led to an increase in intracellular iron levels, and this high level of iron correlates with the oxidation of DNA, measured as EndoIII and Fpg-sensitive sites. Our results show that the LOOHs showed cytotoxic and genotoxic, even at very low concentrations and may contribute to the onset of chronic malignancies like cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases.