Eukaryotische DNA ist in Chromatin verpackt, einem Komplex aus DNA und Proteinen. Das ermöglicht Transkriptionsregulation von Genen durch Modulation ihrer Zugänglichkeit. Histone sind evolutionär konservierte Chromatinproteine, die durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) modifiziert sind. Das legt nahe, dass deren Primärstruktur und ihre PTMs funktionellen Beschränkungen unterliegen. Genetische Ansätze zur Entschlüsselung von Struktur-Funktions-Beziehungen für Histone waren auf Einzeller und D. melanogaster beschränkt. Das Histon-Ersatz-System in D. melanogaster, bei dem Histontransgene verwendet werden, um endogene Histone zu ersetzen, war nicht für systematische Untersuchung dieser Beziehungen ausgelegt. In meiner Arbeit habe ich die Funktion von Threonin 11 in Histon H3 (H3T11) untersucht, das phosphoryliert werden kann. Ich analysierte zwei Mutationen in H3T11 (H3T11A und H3T11E) und stellte fest, dass beide zur Derepression von Transposons führen. H3T11E hat in Gegenwart von Wildtyp-Histon H3 einen dominanten Phänotyp mit transkriptomweiten Folgen. Dazu gehören Induktion von Immun-Genen und Unterdrückung von mit DNA-Stoffwechsel in Verbindung stehenden Genen. Die Mutationen wurden unter der Prämisse charakterisiert, ein Analyse-Schema für eine große Anzahl von Histon-Ersatz-Stämmen zu entwickeln und Probleme zu identifizieren, die die Analyse beeinträchtigen. Dabei habe ich das Verfahren zur Erzeugung von Histon-Ersatz-Stämmen optimiert. Dazu gehören die optionale Verwendung größerer Histon-Transgene und zuverlässigere Produktion und optimierte Rekombinations-Strategie dieser. Ich habe das Klonierungsverfahren gestrafft und eine Plasmid-Bibliothek erstellt, die es erlaubt, 178 verschiedene mutierte Histon-H3-Transgene zu erzeugen. Mit den Änderungen am Produktionsschema, ist diese Bibliothek eine wertvolle Ressource und wird dazu beitragen, die Funktion von Histon H3 und seiner PTMs während der Entwicklung eines Vielzellers besser zu verstehen. / Eukaryotic DNA is packaged into chromatin, a complex composed of DNA and proteins. This enables transcriptional regulation of genes through modulation of their accessibility. Histones are chromatin proteins, modified by post-translational modifications (PTMs) and their sequences are conserved in evolution. This suggests functional constraints for the primary structure of histones and their PTMs. Genetic approaches to decipher structure-function relationships for histone proteins were restricted to unicellular organisms and D. melanogaster. The histone replacement system in D. melanogaster, which uses histone transgenes to replace endogenous histones, was not adapted for systematic interrogation of such relationships. Here, I investigated the function of threonine 11 in histone H3 (H3T11), which can be phosphorylated. I analyzed two mutations in H3T11 (H3T11A and H3T11E) and found that both lead to de-repression of transposable elements. I also found that H3T11E, has a dominant phenotype in the presence of wildtype histone H3 with transcriptome-wide consequences. These include induction of immune-related genes and repression of genes associated with DNA metabolism. I characterized both mutations under the premise of establishing an analysis scheme suitable for a large set of histone replacement strains and identifying problems that interfere with this analysis. As a consequence, I optimized the procedure to generate histone replacement strains. These include an option to incorporate larger histone transgenes, a more reliable production of transgenes and an optimized strategy to recombine them. I streamlined the cloning procedure and created a plasmid library allowing for the generation of 178 distinct mutant histone H3 transgenes. Together with my amendments to the production scheme, this library provides a valuable resource to the field and will help to better understand the function of histone H3 and its PTMs during the development of a multicellular organism.

Der SET-Bereich befindet sich unter den verschiedenen Proteinsequenzbereichen, die mit epigentischer Regulation hauptsächlich durch die Präsenz von Trihtorax (trxG) und Polycomb (PcG) Gruppen von Chromatinmodifikatoren in Zusammenhang gebracht werden. Nach der Entdeckung des ersten SET-Bereichs vor einigen Jahren, welcher die Histon-Lysin-Methyltransferase (Su(var)39) enthält, wurde den Proteinen mit SET-Bereich sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt. Obwohl die Histon-Lysin-Methylierung schon länger als 30 Jahre bekannt ist, war ihre Funktion vor diesem überragenden Ergebnis größten Teils unbekannt. In meiner Arbeit beschreibe ich die kombinatorische und funktionale Charakterisierung von 3 Hefe Proteinkomplexen durch die Anwendung von proteomischer SEAM (Sequential Epitope Tagging and Mass Spectrometry). Zwei dieser Komplex enthalten einen SET-Bereich und die Dritte ist der Rad6 Komplex aus S. pombe (Sp_Rad6C). Der Set1 Komplex (Set1C) beinhaltet 8 Bausteine, methylisiert Lysin 4 in Histon H3 und ist die erste, entdeckte Histone H3 Lysin 4 Methyltransferase. Es beinhaltet ein Ash2 Homolog (Bre2), einen bekannten Baustein von trxG. Kürzlich wurden Rad6 beinhaltende Komplexe gezeigt, die in engem Bezug zu der H3-K4 und H3-K79 Methylation durch ubiquitinierung von Histon H2B und die Etablierung von trans-histonen Signalwegen stehen. Unsere Analysen von Sp-Rad6C führten zu mehreren interessanten Ansichten. Der Set3 Komplex (Set3C) hat keine feststellbare Aktivität einer Methyltransferase, enthält jedoch zwei Histon deacetylasen (HDACs) ? eine klassische HDAC (Hos2) und eine NAD-abhängige HDAC (Hst1). Unsere funktionelle Analyse von Set3C zeigt, dass Set3C bei der Regulierung des meiotischen Genexpressionsprogramms in knospenden Hefen (S. cerevisiae) beteiligt ist. Evolutionbiologisch betrachtet, ist die Spalt-Hefe (S. pombe) sehr weit von S. cerevisiae entfernt und wird meist als ein besserer Modellorganismus fur höhere Eukaryoten angesehen. In einem Versuch, unser Wissen uber andere Organismen zu vergrößern, haben wir ähnliche Untersuchungen in S. pombe unternommen und haben herausgefunden, dass Set1C in beiden Hefen sehr stark konserviert ist. Darüberhinaus waren die Set1-Ash2 Verbindungen konserviert und wir nehmen an, dass auch in höheren Eukaryoten Set1-ahnliche Methyltransferasen Ash2-ahnliche Proteinen angehören. Dies wurde später durch mehrere Studien von anderen Gruppen bestätigt, die an Säugetieren arbeiten. Was Set3C anbelangt, wurden unsere weiteren Analysen nur durch vergleichende Proteomik beschränkt. Wir zeigen, dass der proteomische Kern von Set3C in Spalt-Hefe konserviert wird. Im Gegensatz zu Set3C in S. cerevisiae, beinhaltet diese in S. pombe nur eine HDAC, die zur Hos2 Familie gehört,. Die präsentierte Arbeit hat auch viele Auswirkungen auf die übergreifende Organisation von Proteomen. Wir beschreiben verschiedene Beispiele von gemeinsamen Komponenten zwischen unterschiedlichen Komplexen und prägen den Begriff "proteomischer Hyperlink". Wir waren in der Lage zu zeigen, dass proteomische Kerne sogar für unwesentliche Proteinkomplexe hoch konserviert sind. Die generelle proteomische Schaltung über proteomische Hyperlinks scheint jedoch verworrener und unvorhersehbar zu sein. Wir schlussfolgern, dass die Erschaffung von zuverlässigen, detailierten, proteomischen Abbildungen, welche auf dem Wissen von niederen Organismen fundieren, zur Zeit nicht möglich ist.

Hohenheim, Univ., Diss., 2006.

SIRT1 histone deacetylase acts towards many epigenetic and non-epigenetic targets. The involvement of SIRT1 in oocyte maturation is assumed and the importance of ooplasmic SIRT1 pool for further destiny of matured oocyte is strongly suggested. We hypothesized that SIRT1 play role of the signal molecule in mature oocyte through selected epigenetic and non- epigenetic regulation. We observed SIRT1 re-localization in mature oocyte and the association with spindle microtubules. In matured oocyte, SIRT1 shows a spindle-like pattern and spindle- specific SIRT1 action is supported decreasing α-tubulin acetylation. Based on the observation of histone code in immature and matured oocytes, we suggest that SIRT1 is mostly predestined for epigenetic mode of action in germinal vesicle (GV) of immature oocyte. Accordingly, SIRT1- driven trimethylation of histone H3 on lysine K9 in matured oocyte is considered to be an inheritance of GV epigenetic transformation. Taken together, our observations point out the dual spatiotemporal SIRT1 action in oocyte capable to be switched from epigenetic to the non- epigenetic mode of action readily depending on meiosis progress. Keywords: oocyte, SIRT1, histone, developmental competence, tubuline, epigenetics

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第22854号 / 農博第2437号 / 新制||農||1082(附属図書館) / 学位論文||R2||N5314(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)教授 本田 与一, 教授 田中 千尋, 准教授 坂本 正弘 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

Neutrophils are major cell type of innate immunity, that can eliminate pathogens by different mechanisms. One of these mechanisms is called NETosis, which leads to release of decondensed chromatin and citrullinated histone proteins. Citrullination is post-translational modification catalysed by peptidylarginine deiminase (PAD) and causing transformation of possitively charged arginin to neutral citrullin and can change expression of cytokine genes. Concetrations of pro-inflammatory cytokines (IL-8, TNF, IL-1) were measured after activation of PAD4 and induction of citrullination. Calcium ionophore was used to induce citrullinaton, Cl-amidine and TDFA were used as inhibitors. Production of cytokines was assessed by ELISA on protein level and by qPCR on mRNA level. It was found that induction of citrullination led to increased concentrations of IL-8 and IL-1. Elevated gene expression of IL-8 was confirmed on mRNA level. Both inhibitors were able to decrease level of histone H3 citrullination and IL-8 and IL-1 concentrations. Expression of TNF was not detected on protein and mRNA level.

Protein Prp45, the yeast ortholog of the human transcription coregulator SNW1/SKIP, has been previously associated only with the regulation of pre-mRNA splicing. However, our laboratory found that protein Prp45 genetically interacts not only with the proteins involved in pre-mRNA splicing, but also with factors important for transcription elongation and with chromatin modifying enzymes. Our data and the information about the human ortholog SNW1/SKIP suggest that Prp45 could serve as a regulator coupling splicing, transcription and chromatin state in S. cerevisiae. The main aim of this diploma thesis was to find out whether the protein Prp45, which is essential for cotranscriptional assembly of the spliceosome, affects posttranslational modifications of chromatin on transcribed genes. Using chromatin immunoprecipitation, the influence of prp45(1-169) mutation on trimethylation of histone H3 at lysine 4 and acetylation of histone H3 at lysines 9, 14 and 18 on transcriptionally active genes was not confirmed. The other aim was to analyse the behavior of cells synchronized by α-factor by using flow cytometry. According to our results, prp45(1-169) mutation leads to the prolongation of the cell cycle. For the purpose of monitoring the dynamics of nucleosomes in S. cerevisiae strains, the system of...

Der SET-Bereich befindet sich unter den verschiedenen Proteinsequenzbereichen, die mit epigentischer Regulation hauptsächlich durch die Präsenz von Trihtorax (trxG) und Polycomb (PcG) Gruppen von Chromatinmodifikatoren in Zusammenhang gebracht werden. Nach der Entdeckung des ersten SET-Bereichs vor einigen Jahren, welcher die Histon-Lysin-Methyltransferase (Su(var)39) enthält, wurde den Proteinen mit SET-Bereich sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt. Obwohl die Histon-Lysin-Methylierung schon länger als 30 Jahre bekannt ist, war ihre Funktion vor diesem überragenden Ergebnis größten Teils unbekannt. In meiner Arbeit beschreibe ich die kombinatorische und funktionale Charakterisierung von 3 Hefe Proteinkomplexen durch die Anwendung von proteomischer SEAM (Sequential Epitope Tagging and Mass Spectrometry). Zwei dieser Komplex enthalten einen SET-Bereich und die Dritte ist der Rad6 Komplex aus S. pombe (Sp_Rad6C). Der Set1 Komplex (Set1C) beinhaltet 8 Bausteine, methylisiert Lysin 4 in Histon H3 und ist die erste, entdeckte Histone H3 Lysin 4 Methyltransferase. Es beinhaltet ein Ash2 Homolog (Bre2), einen bekannten Baustein von trxG. Kürzlich wurden Rad6 beinhaltende Komplexe gezeigt, die in engem Bezug zu der H3-K4 und H3-K79 Methylation durch ubiquitinierung von Histon H2B und die Etablierung von trans-histonen Signalwegen stehen. Unsere Analysen von Sp-Rad6C führten zu mehreren interessanten Ansichten. Der Set3 Komplex (Set3C) hat keine feststellbare Aktivität einer Methyltransferase, enthält jedoch zwei Histon deacetylasen (HDACs) ? eine klassische HDAC (Hos2) und eine NAD-abhängige HDAC (Hst1). Unsere funktionelle Analyse von Set3C zeigt, dass Set3C bei der Regulierung des meiotischen Genexpressionsprogramms in knospenden Hefen (S. cerevisiae) beteiligt ist. Evolutionbiologisch betrachtet, ist die Spalt-Hefe (S. pombe) sehr weit von S. cerevisiae entfernt und wird meist als ein besserer Modellorganismus fur höhere Eukaryoten angesehen. In einem Versuch, unser Wissen uber andere Organismen zu vergrößern, haben wir ähnliche Untersuchungen in S. pombe unternommen und haben herausgefunden, dass Set1C in beiden Hefen sehr stark konserviert ist. Darüberhinaus waren die Set1-Ash2 Verbindungen konserviert und wir nehmen an, dass auch in höheren Eukaryoten Set1-ahnliche Methyltransferasen Ash2-ahnliche Proteinen angehören. Dies wurde später durch mehrere Studien von anderen Gruppen bestätigt, die an Säugetieren arbeiten. Was Set3C anbelangt, wurden unsere weiteren Analysen nur durch vergleichende Proteomik beschränkt. Wir zeigen, dass der proteomische Kern von Set3C in Spalt-Hefe konserviert wird. Im Gegensatz zu Set3C in S. cerevisiae, beinhaltet diese in S. pombe nur eine HDAC, die zur Hos2 Familie gehört,. Die präsentierte Arbeit hat auch viele Auswirkungen auf die übergreifende Organisation von Proteomen. Wir beschreiben verschiedene Beispiele von gemeinsamen Komponenten zwischen unterschiedlichen Komplexen und prägen den Begriff "proteomischer Hyperlink". Wir waren in der Lage zu zeigen, dass proteomische Kerne sogar für unwesentliche Proteinkomplexe hoch konserviert sind. Die generelle proteomische Schaltung über proteomische Hyperlinks scheint jedoch verworrener und unvorhersehbar zu sein. Wir schlussfolgern, dass die Erschaffung von zuverlässigen, detailierten, proteomischen Abbildungen, welche auf dem Wissen von niederen Organismen fundieren, zur Zeit nicht möglich ist.

Histone post-translational modifications (PTMs), as the histone code assumes, are related with regulation of gene transcription, an important mechanism of cells in the differentiation process. Many PTMs are simultaneously present in histone proteins, and changes in the PTM stoichiometric ratios can have several effects, like changes in the chromatin structure leading to a transcriptionally active or repressive state. Significant progresses were made to map variations of histone PTMs by mass spectrometry (MS), and although many protocols were developed there are still some drawbacks. Incomplete and side reactions were identified, which can directly affect the quantification of histone PTMs, because both (incomplete and side reactions) can be misinterpreted as endogenous histone post translational modifications. Therefore, a protocol for derivatization of histones with no noticeable undesired reactions (<10%) was required. In this thesis a new chemical modification methodology is presented, which allows the improvement of sequence coverage by acylation with propionic anhydride of lysine residues and N-terminal (free ε- and α- amino groups) and trypsin digestion. more than 95% of complete reaction was achieved with the new derivatization methodology. This strategy (chemical derivatization of histones), in combination with bottom-up MS approach, allows the quantification of lysine methylation (Kme) and acetylation (Kac) in histones from Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae), mouse embryonic stem cells (mESCs) and human cell lines. The results showed histone H3 PTM pattern as the most variable profile regarding histone Kme and Kac across the three different organisms and experimental conditions. Therefore, it was concluded that quantification of H3 PTM pattern can be used to examine changes in chromatin states when cells are subjected to any kind of perturbation.

The replication cycle of polyomaviruses is, consistently with other viruses, fully dependent on host cells. Not only the cellular replicational and translational mechanisms are important for viruses, but also the virus infection is affected by other cellular proteins. This work is focused on the role of major cytoplasmic deacetylase, histone deacetylase 6 (HDAC6) in replication cycle of murine polyomavirus (MPyV). We showed that the presence of fully functional HDAC6 is essential for successful and productive infection. We found that HDAC6 affects not only early phase, but also late phase of infection. Cells with inhibited, or absent HDAC6 are infected with decreased effectivity and moreover lower amount of infectious viral particles is produced. On the other side, using cells with partially functional HDAC6, either in its deacetylase activity or in ubiquitin-binding activity, leads to increased ability of MPyV to infect those cells. Analysis of levels of early LT antigen and late structural protein VP1 in the infected cells showed, that viral proteins are affected by HDAC6. Our data suggest, that in the replication cycle of MPyV mainly the ubiquitin-binding domain of HDAC6 is required and the role of this domain in protein metabolism and degradation. In the second part of diploma project, we...