Die vorliegende Arbeit untersucht mit bioinformatischen Methoden die biologische Bedeutung von Ähnlichkeiten in Kleinstrukturen und peptidischen Sequenzmotiven sowie lokaler und globaler Sequenzähnlichkeit. Der erste Teil der Arbeit behandelt chemische Ähnlichkeiten. Ausgehend von bekannten Inhibitoren der Fehlfaltung des Prionproteins wurde eine Datenbank pharmakologischer Wirkstoffe nach chemisch und strukturell ähnlichen Substanzen durchsucht und 16 Substanzen als neue potentielle Inhibitoren der Fehlfaltung vorgeschlagen. Der nächste Teil untersucht Ähnlichkeiten in Sequenzmotiven, die eine Interaktion mit Pex19, dem Importrezeptor für peroxisomale Membranproteine, vermitteln. In Zusammenarbeit mit einer experimentellen Arbeitsgruppe konnte die Bindestelle charakterisiert und Präferenzen für bestimmte Aminosäuren herausgearbeitet werden. Das Bindemotiv ist eine vermutlich helikale Region mit verzweigtkettigen aliphatischen und basischen Aminosäuren. Aus experimentellen Daten konnte eine positionsabhängige Vorhersagematrix erstellt und validiert werden. Die Beziehung zwischen lokalen Sequenzähnlichkeiten und der Konformation von Prolylbindungen in Proteinen ist Thema des dritten Teils. Die Aminosäurepräferenzen in der Nachbarschaft von cis- und trans-Prolylresten unterscheiden sich, und beide zeigen unterschiedliche Austauschpräferenzen bei Mutationen. Im Gegensatz zu lokaler Sequenzähnlichkeit ist eine globale Sequenzähnlichkeit von nur 20% ein wesentlich besserer Indikator für das Auftreten von cis-Prolylbindungen. Der letzte Teil befaßt sich mit inverser Sequenzähnlichkeit zwischen Proteinen, die wesentlich öfter auftritt als erwartet. Proteine aus einem nichtredundanten Datensatz wurden gleich- und gegenläufig aligniert und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen den aufgefundenen Proteinpaaren untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß bis auf kurze Sekundärstruktur-Einheiten eine inverse Sequenzähnlichkeit zwischen Proteinen keine strukturelle Ähnlichkeit impliziert. / This work is dealing with the biological impact of similarities between chemical structures, protein sequence motifs and local sequence surrounding as well as global sequence similarity. All four aspects are analyzed by computational methods. The first part is dealing with chemical similarities. Based on a recently published set of prion protein misfolding inhibitors, a data base of approved drugs has been screened for compounds with chemical and structural similarities to these substances. 16 drugs are proposed as new potential inhibitors of prion protein aggregation. The next part addresses similarities of sequence motifs which mediate the interaction with the peroxisomal membrane protein import receptor Pex19. In cooperation with an experimental group, the binding site could be characterized, and amino acid preferences of the different positions of the motif have been determined. The binding motif is a probably helical region of target proteins bearing branched aliphatic and basic residues. A position specific scoring matrix for the prediction of Pex19 binding sites could be generated and validated. The relation between local sequence similarity and prolyl bond conformation is examined in the third part. Amino acid preferences of neighboring residues differ between cis and trans prolyl residues, and both species show different amino acid exchange patterns upon mutation. In contrast to local sequence similarity, overall sequence similarity between proteins as low as 20% is a much better indicator for the occurrence of cis prolyl bonds. The last part focuses on inverse sequence similarity between proteins which occurs far more often than expected by chance. Proteins from a nonredundant data set have been aligned in parallel and antiparallel, and structural similarities between the detected protein pairs have been examined. It could be shown that, with the exception of short secondary structural elements, inverse sequence similarity does not imply structural similarity.

Der Endozytoserezeptor Megalin gehört zu einer Gruppe von strukturell und funktionell verwandter Rezeptoren, der LDL R Gen Familie. Es sind zwei Arten von Lipidtransportpartikel beschrieben worden, die durch Megalin in Zellen aufgenommen werden. Zum einen werden Lipoproteine über ihre Apoproteine von Megalin erkannt und endozytiert. Zum anderen nimmt Megalin die hydrophoben Vitamine A und D über ihre Carrierproteine in ihre Zielzellen auf. Es handelt sich um Vitamin D bindendes Protein (DBP) und Retinol bindendes Protein (RBP). Zweck dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob die Endozytose von Steroidcarriern durch Megalin ein genereller Mechanismus ist oder ob DBP und RBP Ausnahmen darstellen. Hierzu wurden exemplarisch drei Carrierproteine (24p3, Apo D und CCSP) für Steroide ausgesucht, die in Megalin-exprimierende Gewebe aufgenommen werden. Der (rekombinante) Retinolcarrier 23p3 zeigte bei surface plasmon resonance Analysen keine direkte Bindung an Megalin. Der Progesteron-Carrier Apo D hingegen bindet Megalin, ferner konnte in Zellkulturversuchen Endozytose und lysosomale Degradation von Apo D in Megalin-exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Auch der Progesteron-Carrier CCSP wird durch Megalin in Zellen aufgenommen, allerdings ist zur Endozytose von CCSP ein Co-Rezeptor notwendig. Mit dieser Arbeit ist die erste in vivo-Beschreibung eines dualen Rezeptorsystems aus Megalin und einem peripheren Membranprotein namens Cubilin gelungen, welches u.a. im proximalen Tubulus der Niere existiert. Abschließend wurde exemplarisch für ein Steroidhormon-abhängiges Gewebe der murine Uterus hinsichtlich seiner Megalin-Expression untersucht. Es konnte ein bereits bekannter Ligand Megalins, das Glykoprotein Laktoferrin, aus der uterinen, luminalen Flüssigkeit aufgereinigt werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Expression von Laktoferrin im Uterus strenger hormoneller Kontrolle unterliegt. / The endozytic receptor Megalin belongs to a group of structurally and functionally related receptors called LDL R gene family. Two different types of lipid particles are taken up by Megalin into target cells. The first type, lipoproteins are recognized and internalized by Megalin via their apoproteins. In addition, Megalin mediates the endocytosis of the lipophilic vitamins A and D into target cells by means of their carrier proteins. These proteins are the vitamin D binding protein (DBP) and retinal binding protein (RBP). The aim of the investigations was to determine, if the endocytosis of steroid hormone carriers by Megalin is a common occurrence or restricted only to DBP and RBP. Therefore, three carrier proteins for steroids (24p3, Apo D and CCSP) were chosen as an example. All of them are known to be taken up in Megalin expressing tissues. In surface plasmon resonance analysis recombinant 24p3, a carrier of retinol, showed no affinity to Megalin. Whereas the progesterone carrier Apo D bound to Megalin. Furthermore, it was endozytosed and degraded in lysosomes by Megalin expressing cells. The cellular uptake of the progesterone carrier CCSP is mediated by Megalin as well, however a co-receptor is needed. This work demonstrates for the first time the existence of a dual receptor pathway consisting of Megalin and a peripheral membrane protein named Cubilin in vivo. This systems is functional in addition to other tissues in the proximal tubule of the kidney. Finally, the Megalin expression in the murine uterus as an example of a steroid dependent tissue was investigated. Lactoferrin a known Megalin ligand was purified from the luminal uterine fluid. Furthermore, Lactoferrin expression in the uterus was shown to be under tight hormonal control.

Der erste Teil dieser Arbeit untersucht die Ladungswechselwirkung zwischen Proteinen und Polyelektrolyten. Dabei wird die Bindung von Polyakrylsäure (PAA) als kurzes Modell-Polyelektrolyt an Humanalbumin (HSA) in einer umfassenden experimentellen und theoretischen Studie untersucht und sehr gute Übereinstimmung der Resultate konnte festgestellt werden. Die Computersimulationen in dieser Arbeit wurden von Xiao Xu im Rahmen seiner Promotion durchgeführt. Thermodynamische Daten wurden mit Hilfe von Isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) gesammelt und strukturelle Untersuchungen wurden mit Hilfe von Neutronenkleinwinkelstreuung (SANS) durchgeführt. Die Analyse von Bindungsaffinitäten zeigte eine eins zu eins Bindung von PAA mit HSA, die entropisch getrieben ist und strukturellen Untersuchungen weisen eine stabile Proteilstruktur unabhängig von der Adsorption durch PAA auf. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Wechselwirkung zweier uremischer Toxinen, nämlich Phenylessigsäure (PhAA) und Indoxylsulfat (IDS), mit HSA untersucht. Eine wichtige Schlussfolgerung aus der Analyse der ITC Daten ist, dass begünstigende, hydrophobe Wechselwirkungen die treibende Kraft für die Adsorption von Toxinen an HSA sind, und dass hierbei die Enthalpie-Entropie-Kompensation (EEC) zu tragen kommt. Weiterhin zeigen SANS Untersuchungen, dass die Proteinstruktur trotz Adsorption stabil bleibt und konnte außerdem über Interpartikulare Wechselwirkung von HSA-Toxin Komplexen aufklären. Im Allgemeinen ist HSA strukturell unverändert durch die Adsorption von Liganden. Diese Feststellung erlaubt die Interpretation von ITC Daten, da damit gemessene Wärmeprozesse ausschließlich von Bindungsprozessen herrühren. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass eine ausführliche thermodynamische Analyse durch Kombination von theoretischer mit experimenteller Arbeit, eine umfassende Einsicht in die Mechanismen von Bindungsprozessen ermöglicht. / The first part of the thesis explores the charge-charge interaction between proteins and polyelectrolytes. Polyacrylic acid (PAA) is used as a short model polyelectrolyte to interact with human serum albumin (HSA) the most abundand protein in blood, in a comprehensive experimental and theoretical study. The results thereby coincide very well. Computer simulation studies were performed by Xiao Xu within the framework of his PhD thesis. Thermodynamic data were collected by means of isothermal titration calorimetry (ITC) and structural analysis performed using small-angle neutron scattering (SANS). The analysis of binding free energies revealed one to one binding that is mainly driven by entropy. Structural investigations give proof of the stability of the protein beside adsorption. In the second part, the interaction of two uremic toxins, namely phenylacetic acid (PhAA) and indoxyl sulfate (IDS), with HSA is studied. Systematic ITC experiments reveal two binding sites for both of the two toxins and show small dependence of binding affinities on ionic strength in contrast to PAA adsorption to HSA. This leads to the key conclusion that the favorable hydrophobic interaction is the driving contribution for adsorption and enthalpy-entropy compensation (EEC) effect comes into play. SANS studies of high concentrated HSA-toxin solutions proofed the stability of the protein structure and shed light on the interparticle interaction of HSA-toxin complexes. In general, HSA is structurally robust regardless of ligand uptake. This finding allows the interpretation of ITC data by confirming that the measured heat signals are purely associated to the binding process. The present thesis has demonstrated that a full thermodynamic analysis in combination with theoretical modelling can provide a comprehensive understanding of binding in terms of identifying driving forces and their contributions to protein ligand interaction.

Eukaryotische DNA ist in Chromatin verpackt, einem Komplex aus DNA und Proteinen. Das ermöglicht Transkriptionsregulation von Genen durch Modulation ihrer Zugänglichkeit. Histone sind evolutionär konservierte Chromatinproteine, die durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) modifiziert sind. Das legt nahe, dass deren Primärstruktur und ihre PTMs funktionellen Beschränkungen unterliegen. Genetische Ansätze zur Entschlüsselung von Struktur-Funktions-Beziehungen für Histone waren auf Einzeller und D. melanogaster beschränkt. Das Histon-Ersatz-System in D. melanogaster, bei dem Histontransgene verwendet werden, um endogene Histone zu ersetzen, war nicht für systematische Untersuchung dieser Beziehungen ausgelegt. In meiner Arbeit habe ich die Funktion von Threonin 11 in Histon H3 (H3T11) untersucht, das phosphoryliert werden kann. Ich analysierte zwei Mutationen in H3T11 (H3T11A und H3T11E) und stellte fest, dass beide zur Derepression von Transposons führen. H3T11E hat in Gegenwart von Wildtyp-Histon H3 einen dominanten Phänotyp mit transkriptomweiten Folgen. Dazu gehören Induktion von Immun-Genen und Unterdrückung von mit DNA-Stoffwechsel in Verbindung stehenden Genen. Die Mutationen wurden unter der Prämisse charakterisiert, ein Analyse-Schema für eine große Anzahl von Histon-Ersatz-Stämmen zu entwickeln und Probleme zu identifizieren, die die Analyse beeinträchtigen. Dabei habe ich das Verfahren zur Erzeugung von Histon-Ersatz-Stämmen optimiert. Dazu gehören die optionale Verwendung größerer Histon-Transgene und zuverlässigere Produktion und optimierte Rekombinations-Strategie dieser. Ich habe das Klonierungsverfahren gestrafft und eine Plasmid-Bibliothek erstellt, die es erlaubt, 178 verschiedene mutierte Histon-H3-Transgene zu erzeugen. Mit den Änderungen am Produktionsschema, ist diese Bibliothek eine wertvolle Ressource und wird dazu beitragen, die Funktion von Histon H3 und seiner PTMs während der Entwicklung eines Vielzellers besser zu verstehen. / Eukaryotic DNA is packaged into chromatin, a complex composed of DNA and proteins. This enables transcriptional regulation of genes through modulation of their accessibility. Histones are chromatin proteins, modified by post-translational modifications (PTMs) and their sequences are conserved in evolution. This suggests functional constraints for the primary structure of histones and their PTMs. Genetic approaches to decipher structure-function relationships for histone proteins were restricted to unicellular organisms and D. melanogaster. The histone replacement system in D. melanogaster, which uses histone transgenes to replace endogenous histones, was not adapted for systematic interrogation of such relationships. Here, I investigated the function of threonine 11 in histone H3 (H3T11), which can be phosphorylated. I analyzed two mutations in H3T11 (H3T11A and H3T11E) and found that both lead to de-repression of transposable elements. I also found that H3T11E, has a dominant phenotype in the presence of wildtype histone H3 with transcriptome-wide consequences. These include induction of immune-related genes and repression of genes associated with DNA metabolism. I characterized both mutations under the premise of establishing an analysis scheme suitable for a large set of histone replacement strains and identifying problems that interfere with this analysis. As a consequence, I optimized the procedure to generate histone replacement strains. These include an option to incorporate larger histone transgenes, a more reliable production of transgenes and an optimized strategy to recombine them. I streamlined the cloning procedure and created a plasmid library allowing for the generation of 178 distinct mutant histone H3 transgenes. Together with my amendments to the production scheme, this library provides a valuable resource to the field and will help to better understand the function of histone H3 and its PTMs during the development of a multicellular organism.

MHC Klasse II Moleküle präsentieren Peptidantigene für die Überwachung durch CD4+ T Zellen an der Zelloberfläche. Um Sicherzustellen, dass diese Peptidliganden möglichst genau die intrazelluläre Proteinzusammensetzung widerspiegeln, hat sich im Verlauf der Evolution ein komplexer Prozessierungsweg entwickelt, welcher möglichst stabile Peptid/MHC Komplexe an die Zelloberfläche liefert. MHC Moleküle, welche ihren Liganden verloren haben, konvertieren zudem spontan in einen ‚nichtrezeptiven’ Zustand, was als zusätzlicher Sicherheitsmechanismus dient. Diese Studie zeigt jedoch, dass Aminosäureseitenketten kurzer Peptide diesen Sicherheitsmechanismus umgehen können indem sie katalytisch einen reversiblen Ligandenaustausch auslösen. Die katalytische Aktivität von Dipeptiden, wie z.B. Tyr-Arg (YR), war dabei stereospezifisch und konnte durch zusätzliche Modifikationen verstärkt werden, welche das konservierte H-Brückennetzwerk der so genannten P1-Tasche des MHC Moleküls adressierten. Die Dipeptide verstärkten dabei sowohl die Antigenbeladung als auch den Ligandenaustausch, wobei deren relative Aktivität genau mit den bekanten Ankerpräferenzen der P1 Tasche korrelierte. Letzteres weist somit auf eine direkte Interaktion der katalytischen Seitenkette des Dipeptides mit dieser Tasche hin. Der Verstärkungseffekt war auch in CD4+ T Zellassays zu beobachten, bei denen der alleleselektive Einfluss der Dipeptide direkt in eine deutliche Erhöhung der Sensitivität der antigenspezifischen T Zellantwort führte. Durch weitere molekulardynamische Berechnungen konnte die Hypothese unterstützt werden, dass die Besetzung der P1 Tasche durch Aminosäureseitenketten einen Kollaps der leeren Bindungstasche zum ‚nichtrezeptiven’ Zustand verhindert. Während der Antigenpräsentation könnte P1 somit unmittelbar als ‚Sensor’ für die Beladung mit Peptiden dienen. Diese Annahme konnte experimentell durch spektroskopische Untersuchungen unter Verwendung des ANS-Farbstoffes (8-Anilino-1-Naphtalensulfonsäure) sowie durch Messung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz bestätigt werden. Darüber hinaus konnten konformationsspezifische Antikörper, welche bislang lediglich mit unbeladenen MHC Molekülen in Verbindung gebracht wurden, hier als spezifische Sonden für den nichtrezeptiven Zustand definiert werden. Als mögliche Risikofaktoren könnten katalytische kurze Peptide eine Rolle bei der Auslösung von Autoimmunerkrankungen spielen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass sie die Beladung von Glutenantigenen auf das Zöliakie-assozierte HLA-DQ2 Molekül verstärken können. Zumindest in vitro konnte ihre Anwesenheit deshalb auch die antigenspezifische Antwort von CD4+ T Zellen verstärken, welche zuvor von Zöliakiepatienten isoliert worden waren. Auf der einen Seite könnten diese Peptide als ‚MHC-loading enhancer’ (MLE) deshalb als mögliche Risikofaktoren die Ausbildung entzündlicher (Auto-) Immunerkrankungen beschleunigen. Auf der anderen Seite könnten sie jedoch auch als ‚drug-like’ Vakzinadditiv zur Verbesserung von Immuntherapien führen. / MHC class II molecules present antigenic peptides on the cell surface for the surveillance by CD4+ T cells. To ensure that these ligands accurately reflect the content of the intracellular MHC loading compartment, a complex processing pathway has evolved that delivers only stable peptide/MHC complexes to the surface. As additional safeguard mechanism, MHC molecules quickly acquire a ‘non-receptive’ state once they have lost their ligand. This study shows that amino acid side chains of short peptides can bypass these safety mechanisms by triggering the reversible ligand-exchange. The catalytic activity of dipeptides such as Tyr-Arg (YR) is stereo-specific and could be enhanced by modifications addressing the conserved H-bond network near the P1 pocket of the MHC molecule. It enhanced both antigen-loading and ligand-release and strictly correlated with reported anchor preferences of P1, the specific target site for the catalytic side chain of the dipeptide. The effect was evident also in CD4+ T cell assays, where the allele-selective influence of the dipeptides translated into increased sensitivities of the antigen-specific immune response. The hypothesis that occupation of P1 prevents the ‘closure’ of the ‘empty’ peptide binding site into the ‘non-receptive’ state was further supported by molecular dynamic calculations. During antigen processing and presentation P1 may therefore function as important ‘sensor’ for peptide-load. Spectroscopic studies using ANS dye (8-aninilino-1-napthalenesulfonic acid) and intrinsic tryptophan fluorescence data, confirm the postulate by providing direct evidence for the conformational transitions. Moreover conformation specific antibodies previously described to be specific for ‘empty’ MHC could be shown to be a ‘probe’ for ‘receptive conformation’. As potent risk factors short peptides may be involved in the induction of autoimmune diseases. It could be shown here that they could enhance the loading of gluten derived antigen on celiac disease linked-HLA-DQ2 allele. At least in vitro the effect could enhance gluten specific CD4+ T cell response on T cell clones obtained from celiac disease patients. Thus, on one hand short peptides might work as ‘MHC loading enhancer’ (MLE) in the precipitation of inflammatory-‘autoimmune’ disorder, on the other hand they might be used as drug like vaccine ‘additive’ in various therapeutic settings.