Memoria para optar al Título de Bioquímica / Las histonas son proteínas pequeñas con una alta carga positiva, capaces de interactuar con el ADN y ayudar en su compactación. Antes de poder ejercer esta función estas proteínas son sintetizadas en el citoplasma celular, en donde adquieren su correcto plegamiento y modificaciones post-traduccionales características por el paso secuencial a través de una serie de complejos proteicos. Pero no todas las proteínas recientemente sintetizadas adoptan su estructura nativa, y hasta un 30% de ellas son marcadas co-traduccionalmente para ser degradadas por el sistema ubiquitina-proteosoma. El objetivo de este trabajo fue dilucidar la función que cumple este mecanismo proteolítico enfrentado a una población de histonas H3 citosólicas mal plegadas. Para esto se trabajó con dos análogos aminoacídicos, AZC y Can, inductores del mal plegamiento, además de MG132, un inhibidor del proteosoma. Mediante técnicas de fraccionamiento subcelular se obtuvo el extracto citosólico y se demostró la acumulación de la histona H3 cuando se inhibe la subunidad 20S del proteosoma en paralelo a la inducción del mal plegamiento. Con estos resultados se concluyó que, al utilizar análogos de aminoácidos que inducen mal plegamiento proteico, las histonas recientemente sintetizadas se degradan por la vía ubiquitina-proteosoma. Trabajos a futuro debiesen enfocarse en investigar la potencial participación de otros mecanismos de degradación para esta proteína / Histones are small highly positive charged proteins, capable of interact with the DNA to assist in its compaction. Before being able to exert this function, these proteins are synthesized in the cellular cytoplasm and then sequentially associate with different protein complexes to acquire their correct conformation and to establish their characteristic post-translational modifications. But not all newly synthesized proteins succeed in acquiring their native structure, indeed, up to 30% of them are marked to be degraded by the ubiquitin-proteasome system. We focus our study on understand the participation of this proteolytic mechanism when faced to a population of cytosolic misfolded histone H3. To this end we worked with two amino acid analogues, AZC and Can, whose presence increases the amount of aberrant proteins, in addition to MG132, a proteasome inhibitor. By using subcellular fractionation techniques, the cytosolic extract was isolated and we demonstrated that the proteasomal 20S subunit inhibition, together with the induction of the misfold, leaded to a significant accumulation of the histone H3. With this, we established the participation of the ubiquitin-proteasome system in the degradation of the newly synthesized histone H3 in conditions of induced misfolding. Future work should investigate the potential participation of other degradation mechanisms for this protein / FONDECYT 1160480; Proyecto Basal PFB-16

Una vez que las histonas son traducidas en los ribosomas, estas sufren una serie de modificaciones post-traduccionales antes de entrar al núcleo. En particular, se han descrito las modificaciones y los complejos que forman las histonas H3 y H4 con distintas chaperonas. En esta cascada de maduración, la primera modificación que se establece es H3K9me1, la cual se genera de manera cotraduccional mediante la metiltransferasa SetDB1 asociada al ribosoma. Sin embargo, sólo el 36% de H3 soluble presenta esta modificación, lo que sugiere la existencia de un mecanismo de regulación, el cual no ha sido descrito hasta la fecha. Utilizando células sincronizadas realizamos un análisis mediante Western Blot para evaluar la presencia de SetDB1, H3 y H3K9me1 en ribosomas provenientes de células enriquecidas en distintas fases del ciclo celular. Logramos determinar que hacia el final de la fase S, hay una mayor presencia de SetDB1 en los ribosomas. En cuanto a H3 y H3K9me1, observamos una acumulación de la proteína y la marca tanto al inicio como al final de la fase S. Por lo tanto, se concluye que existiría un mecanismo de regulación dependiente del ciclo celular para la generación de la marca H3K9me1. Futuros estudios se requerirán para identificar las bases moleculares y el mecanismo de regulación de este proceso / Once histones are translated in the ribosomes, they are post-translationally modified before entering in the nucleus. Previous studies characterized the maturation cascade involved in the establishment of modifications and folding of histones H3 and H4. On this maturation cascade, the first modification imposed is H3K9me1, which occurs cotranslationally by SetDB1, a methyltransferase associated to the ribosome. However, only 36% of the soluble H3 carries this modification, which suggests the existence of a regulation mechanism for the generation of this mark. Using synchronized cells, we performed a Western Blot analysis to assess the presence of SetDB1, H3, and H3K9me1 on ribosomes obtained from cells enriched in different phases of the cell cycle. We found that SetDB1 is enriched on ribosomes at late S phase. We observed an accumulation of H3 and H3K9me1 at early and late S phase. We concluded that there is a cell cycle dependent regulatory mechanism for the generation of H3K9me1. Future studies will be required to identify the molecular basis of this process.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-10T17:38:54Z No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) Previous issue date: 2018-04-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O DNA de organismos eucarióticos é organizado sob a forma de cromatina, sendo responsável pela regulação da transcrição, replicação e reparo do DNA. O nucleossomo, unidade fundamental da cromatina, compreende estrutura formada por uma sequência de DNA enrolada no octâmero de histonas, chegando a altos níveis de compactação que dão origem ao cromossomo. Para o estudo da estrutura do nucleossomo, é imprescindível a sua reconstituição in vitro, na qual faz-se necessário um método eficiente para a obtenção de histonas recombinantes. Existem diversos protocolos para expressão e purificação de histonas recombinantes publicados na literatura. Portanto, o objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo para obtenção de histonas canônicas recombinantes. Para estabelecimento do protocolo de expressão, duas cepas competentes de E. coli (Rosetta gami e Rosetta pLysS) foram testadas quanto a capacidade de produzir grande quantidade de histona recombinante por duas diferentes metodologias: expressão clássica com uso de IPTG e expressão espontânea. As histonas foram purificadas por extração de corpos de inclusão seguido por cromatografia de troca iônica. Surpreendentemente, os melhores resultados de expressão, para todas as histonas, foram obtidos pela metodologia de auto-expressão com uso de Rosetta pLysS. No entanto, com exceção da H3, bons resultados também foram adquiridos por expressão clássica com IPTG. Ajustes no protocolo de purificação foram realizados de forma a reduzir a degradação por proteases, grande desafio encontrado nesta etapa. A utilização de associação de inibidores favoreceu a modulação desta degradação. Assim, foi possível estabelecer um método para expressão e purificação de histonas de forma a obter grande quantidade de histona recombinante livres de degradação. / Eukaryotic DNA is organized into chromatin that regulates gene transcription, DNA replication and repair. Nucleosomes, the basic unit of chromatin, are formed by a sequence of DNA wrapped around a histone octamer, achieving high levels of compaction that goes to chromosome. In order to reconstitute nucleosomes in vitro to perform structural studies on chromatin, it is necessary to have an efficient method for recombinant histone production. Although there is several established protocols for expression and purification of recombinant histones, our challenge is to adapt a protocol that will be compatible with laboratory. For establishment of histone expression protocol, two competent E. coli strains (Rosetta gami and Rosetta pLysS) were tested about the ability to produce large amounts of recombinant histone by two different methodologies: classical expression using IPTG and spontaneous expression. The human histones H2A, H2B, H3 e H4 were purified from inclusion body followed by ion exchange chromatography. Surprisingly, the best expression results for all histones were obtained by spontaneous expression methodology using Rosetta pLysS. However, with the exception of H3, good results were also acquired by classical expression with IPTG. Adjustments in purification protocol were performed in order to reduce degradation by proteases, a challenge encountered in this step. The use of association of inhibitors helped the modulation of degradation. Thus, it was possible to establish a method for expression and purification of histones in order to obtain large amounts of recombinant histone free of degradation

El aislamiento, purificación y caracterización de la histona H1 del esperma del erizo rojo Loxechinus albus se describe en el presente trabajo, que consiste en la purificación y caracterización de la histona H1 de los espermatozoides del erizo rojo Loxechinus albus, Molina 1782. Esta especie representa un recurso económico muy importante de la costa central y sur del Estado Peruano. Los pasos fundamentales del presente estudio fueron la obtención de células espermáticas maduras, extracción de las histonas totales y H1, cuantificación de de histonas y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE–SDS y PAGE–AU), determinación del peso molecular de la histona H1, mediante el uso de software específicos (GelAnalizer) y por último, la composición de aminoácidos de la histona H1, por cromatografía líquida de alta performance (HPLC). Se estimó que el peso molecular de la histona H1 es aproximadamente 22 kD y aproximadamente 200 residuos de aminoácidos. Se puede evidenciar que la histona H1, presenta una mayor variabilidad debido a que presenta un par de aminoácidos resaltantes dentro de su constitución: lisina y arginina, son éstos los que brindan variabilidad a nivel del nucleosoma de éstas células, que también se puede evidenciar la movilidad electroforética de las demás histonas (histonas core), en ambos geles de electroforesis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-16T14:01:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339914.pdf: 2025505 bytes, checksum: 8fcd42629046acd83de795d33a29b226 (MD5) Previous issue date: 2016 / A acetilação de histonas é uma das alterações epigenéticas que tem sido reconhecida como um processo fundamental com fortes efeitos na regulação da transcrição dos genes. A expressão das enzimas modificadoras de histonas: histonas desacetilases (HDAC) e histona acetiltransferases (HAT), tem sido avaliada em diferentes tipos de tumores malignos. Este trabalho teve como objetivo investigar a expressão de HDAC1, HDAC2 e HAT1, em carcinoma epidermoide de lábio (CEL) e queilite actínica (QA). Para tanto foi realizada uma revisão da literatura e, foram avaliados, através de imuno-histoquímica, 30 casos de CEL e 30 casos de QA além de 28 casos de epitélio não neoplásico (ENN), como controle. Houve diferença estatisticamente significante entre as médias de porcentagem de imunopositividade de HDAC2 entre os grupos de QA (75,07%±29,70) e CEL (51,06%±39,02) (Teste de Kruskal-Wallis, p=0,022). Para HDAC1 as porcentagens de imunomarcação foram de 77,49% (±24,95) no grupo das QA, 74,76% (±25,78) nos CEL e 67,73% (±29,14) no grupo dos ENN (Teste de Kruskal-Wallis, p=0,3625) enquanto para HAT1, as QA mostraram média de imunopositividade de 89,59% (±13,12), os CEL 87,02% (±14,56), e os ENN 84,81% (±19,67) (Teste de Kruskal-Wallis, p=0,7134). Os resultados mostraram maiores níveis de imunopositividade nas QA e nos CEL para HDAC1, HDAC2 e HAT1 em relação ao ENN em grande parte dos casos. A confirmação futura de que estas alterações possam estar envolvidas no desenvolvimento do câncer de lábio, facultará a sua utilização como marcadores de diagnóstico e prognóstico, especialmente das lesões potencialmente malignizáveis, e será imprescindível para evitar ou reduzir procedimentos cirúrgicos por vezes mutiladores por permitir o uso de inibidores de HDAC (HDACi) no tratamento dessas lesões.<br> / Abstract: Histone acetylation, an epigenetic change, has been recognized as a fundamental process with strong effects on regulation of gene transcription. Expression of histone modifying enzymes: Histone deacetylases (HDACs) and histone acetyltransferases (HAT), has been evaluated in different types of malignant tumors. This study aimed to investigate the expression of HDAC1, HDAC2 and HAT1 in squamous cell carcinoma of the lip (SCCL) and actinic cheilitis (AC). For this, 30 cases of SCCL and 30 cases of AC, as well as 28 cases of non-neoplastic epithelium (NNE), used as a parameter, were evaluated through immunohistochemistry. There was a statistically significant difference between mean percentages of immunopositivity for HDAC2 AC groups (75.07% ± 29.70) and SCCL (51.06% ± 39.02) (Kruskal-Wallis test, p = 0.022). HDAC1 immunostaining percentages were 77.49% (± 24.95) in the AC group, 74.76% (± 25.78) in the CEL, and 67.73% (± 29.14) in the group of NNE. For HAT1, AC showed a mean immunopositivity of 89.59% (± 13.12), SCCL of 87.02% (± 14.56), and NNE of 84.81% (± 19.67). Results showed higher levels of immunopositivity in AC and SCCL to HDAC1, HDAC2 and HAT1 compared to NNE in large part of the cases. Future confirmation that these alterations are involved in the development of lip cancer, would provide their use as diagnostic and prognostic markers, especially precancerous lesions, and is essential for avoiding or reducing surgical procedures, often maiming, for allowing the use of HDAC inhibitors (HDACi) in the treatment of these injuries.

O objetivo do estudo foi avaliar, in vitro, a influência da fotobiomodulação (PBM) na, viabilidade e migração, relacionados à acetilação das histonas, e na diferenciação de células-tronco da polpa de dentes permanentes humanos (hDPSCs); e, in vivo, sua influência no reparo radicular de molares de ratos com necrose pulpar e rizogênese incompleta. hDPSCs foram caracterizadas e utilizadas nos experimentos de três artigos científicos. A PBM foi empregada utilizando-se laser diodo InGaAlP (100mW, 660nm, 3J/cm2, energia total por aplicação 1J em 10s). Em todos os experimentos in vitro os grupos foram divididos de acordo com o uso da PBM e os intervalos de irradiação foram de 6 horas. A viabilidade destas células foi avaliada pelo ensaio de MTT e a migração pelo scratch. A acetilação das histonas das hDPSCs foi avaliada por imunofluorescência. Para avaliar o potencial de diferenciação e a deposição de tecido mineralizado, foram utilizados os meios adipogênico, condrogênico e osteogênico, complementado pelo ensaio de atividade ALP, em modelo 3D, em gel de agarose 0,3%. Nos ensaios de diferenciação também foi avaliada a condição nutricional (regular: 10% SFB; ou déficit: 5%SFB). Os resultados do MTT, scratch e da acetilação das histonas foram obtidos em até 24 horas e nos ensaios de diferenciação foram analisados em 7 e 14 dias. Para o experimento in vivo, molares inferiores de ratos Wistar foram expostos ao meio bucal por 3 semanas e, após, tratados com pasta antibiótica por uma semana. A seguir, os canais foram irrigados e divididos em 6 grupos (n=6): MTA; coágulo sanguíneo (CS); hDPSC; MTA+PBM; CS+PBM; hDPSC+PBM. Dois grupos não foram expostos ao meio bucal: Dente hígido+PBM (n=6), Dente hígido (controle positivo, n=3); e um grupo foi mantido exposto durante todo o período experimental: Dente necrótico (controle negativo, n=3). Durante 30 dias as irradiações foram feitas com intervalos de 24 horas. Após, os ratos foram eutanasiados e realizou-se avaliação histológica e imunohistoquímica. Os dados obtidos foram tabulados e analisados estatisticamente. A PBM aumentou a viabilidade das células (P<0.001). No ensaio de scratch o grupo PBM acelerou o fechamento do ferida até 12 horas (P<0.001) e esta fechou em 18 horas, sendo mais rápido que o controle (P<0.05). A PBM aumentou a acetilação das histonas (P<0.001); Após 14 dias, a PBM intensificou a diferenciação nos três meios empregados e na atividade ALP, comparado com os controles (P<0.05). No estudo in vivo, o controle negativo apresentou infiltrado de neutrófilos maior do que os demais grupos (P<0.05). Os grupos Controle negativo, Dente hígido e Dente hígido+PBM apresentaram menos condensação fibrosa (P<0.05). Todos os grupos formaram mais tecido mineralizado que o controle negativo (P<0.05). PBM+MTA, +CS ou +hDPSC formaram mais tecido mineralizado que os grupos não irradiados (P<0.05). MTA+PBM induziu apicificação (P<0.05). A marcação para BSP confirmou os achados histológicos relacionados a formação de tecido mineralizado e as hDPSCs, com e sem PBM, exibiram maior porcentagem de células positivas para BSP. Conclui-se que a PBM desempenhou papel importante, in vitro, aumentando a diferenciação, viabilidade e migração celular que estão relacionados a acetilação das histonas. Além disso, a PBM pode ser uma alternativa de tratamento adjuvante para dentes permanentes com necrose pulpar e rizogênese incompleta favorecendo o reparo radicular. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the influence of photobiomodulation (PBM) on viability and migration, related to histone acetylation, and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs); and, in vivo, its influence on the root repair of rat molars with pulp necrosis and open apex. The hDPSCs were characterized and used in the experiments of three scientific papers. The PBM was applied using InGaAlP diode laser (100mW, 660nm, 3J / cm2, total energy per application 1J in 10s). In all in vitro experiments, the groups were divided according to the use of PBM, with 6-hour irradiation intervals. The viability of these cells was assessed by MTT assay and migration by scratch. The histone acetylationof hDPSCs was evaluated by immunofluorescence. To evaluate the potential for differentiation and deposition of mineralized tissue, adipogenic, chondrogenic and osteogenic mediums were used, complemented by the ALP activity assay in 3D model, in 0.3% agarose gel. In differentiation assays, the nutritional status was also evaluated (regular: 10% FBS; or deficit: 5% FBS). The MTT, scratch and histone acetylation results were obtained until 24 hours, and the differentiation assays were analyzed at 7 and 14 days. For the in vivo experiment, lower molars of Wistar rats were exposed to oral environment for 3 weeks and then treated with antibiotic paste for one week. Next the root canals were irrigated and divided into 6 groups (n=6): MTA; BC (blood clot); hDPSC; healthy tooth+PBM; MTA+PBM; BC+PBM; hDPSC+PBM. In hDSPC groups, 1% agarose gel scaffold was used for cell support. Two groups were not exposed to the oral environment: healthy tooth+PBM (n=6), healthy tooth (positive control, n=3); and one stayed exposed during the role experimental period: necrotic tooth (negative control, n=3). For 30 days the irradiations were done at 24-hour intervals. Thereafter, the rats were euthanized and histological and immunohistochemical evaluations were performed. Data were tabulated and statistically analyzed. PBM increased cell viability (P<0.001). In the scratch assay, the PBM group accelerated wound closure up to 12 hours (P<0.001) and closed at 18 hours, being faster than the control (P<0.05). PBM increased histone acetylation (P<0.001). After 14 days, PBM improved the differentiation in the three mediums employed and the ALP activity, compared to the controls (P<0.05). In the in vivo study, the negative control had greater neutrophil infiltrate than the other groups (P<0.05). Negative Control, Healthy tooth and Healthy tooth+PBM groups presented less fibrous condensation (P<0.05). All groups formed more mineralized tissue than the negative control (P<0.05). PBM+MTA, +BC or +hDPSC formed more mineralized tissue than non-irradiated groups (P<0.05). MTA+PBM induced inoculation (P<0.05). BSP labeling confirmed the histological findings related to mineralized tissue formation and hDPSCs, with and without PBM, exhibited a higher percentage of BSP-positive cells. It is concluded that PBM played an important role, in vitro, increasing differentiation, viability and cell migration that are related to histone acetylation. Moreover, the PBM may be an adjutant treatment alternative for permanent teeth with pulp necrosis and open apex, favoring root repair.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As histonas de Trypanosoma cruzi sao bastante divergentes quando comparadas aos demais eucariotos, principalmente na porcao N-terminal, onde ocorrem modificacoes pos traducionais, que sao reconhecidamente essenciais para o controle da expressao genica e da arquitetura da cromatina. Entre estas modificacoes estao as acetilacoes das lisinas 4, 10 e 14 da histona H4 (H4K4ac, H4K10ac e H4K14ac). Nesta tese mostramos que a H4K4ac, que e a modificacao mais abundante, esta enriquecida em areas de cromatina densamente compactada, enquanto H4K10ac e H4K14ac localizam-se em regioes de cromatina menos densa, preferencialmente na interface entre a eucromatina e a heterocromatina. H4K4ac diminui nas formas nao replicativas e H4K14ac H4K14ac aumenta durante G2 e mitose do ciclo de divisao celular das formas replicativas. H4K10ac e H4K14ac aumentam e H4K4ac diminui no reparo de quebras de dupla fita do DNA. Ao mesmo tempo a superexpressao da proteina TcRad51, essencial para o processo de reparo de DNA por recombinacao homologa causa aumento de H4K10ac e H4K14ac. Quando as lisinas 4, 10 e 14 sao substituidas separadamente por argininas (H4K4R, H4K10R e H4K14R) para evitar a acetilacao sao expressas, elas sao incorporadas na cromatina e diminuem os niveis de cada modificacao. A expressao de H4K4R tem uma distribuicao diferente das histonas endogenas e H4K14R causa diminuicao de crescimento, com celulas acumulando na fase de mitose. Os mutantes de H4K10 e H4K14 ainda apresentam maior mortalidade quando submetidos a radiacao ƒ× que causa quebra de dupla fita de DNA. Tambem mostramos que a proteina TcBDF2, uma proteina que contem bromodomineo, reconhece preferencialmente H4K10ac. A funcao da TcBD2 e desconhecida, mas verificamos que ela aumenta apos exposicao dos parasitas a luz UV, sugerindo que esteja participando no reparo de DNA. Esses dados juntos fornecem evidencias de que cada uma das acetilacoes da histona H4 tem um papel distinto no T. cruzi. A acetilacao em K4 estaria envolvida na montagem da xiii cromatina na fase de replicacao. Ja as modificacoes em K10 e K14 estariam envolvidas com processos especificos de remodelagem da cromatina durante os eventos de reparo e eventualmente transcricao do DNA. / The Trypanosoma cruzi histones are very distinct from other eukaryotes, mainly in the N-terminus, where post translational modifications occur, which are essential for gene expression regulation and chromatin architecture. Among these modifications we found that lysines 4, 10 and 14 of H4 histone are acetylated (H4K4ac, and H4K10ac H4K14ac). In this thesis we show that the H4K4ac, which is the most abundant modification, is enriched in densely packed chromatin, while H4K10ac and H4K14ac are located in less dense chromatin, preferentially at the interface between euchromatin and heterochromatin. H4K4ac decreases in trypomastigote, which is the infective and non-dividing form of the parasite whileH4K14ac increases during G2 and mitosis of the cell cycle in replicative forms. H4K10ac and H4K14ac increases during DNA repair of double stranded breaks while H4K4ac decreases after DNA damage. TcRad51, an essential protein in the homologous recombination pathway, when overexpressed, increases the H4K10ac and H4K14ac levels. When the lysines 4, 10 and 14 are individually replaced by arginine (H4K4R, H4K10R and H4K14R) to prevent the acetylation, they are still incorporated into chromatin and decrease the specific modification level. The H4K4R location is different from the endogenous H4K4ac and the H4K14R expression causes growth reduction, with cells accumulating in mitosis. Mutants H4K10R and H4K14R also have high mortality rates after ƒ× irradiation that causes DNA double-stranded breaks. We also showed that TcBDF2 protein contains a bromodomain that recognizes preferentially H4K10ac. Although the TcBD2 function is unknown, it is increased after UV light exposure, suggesting its involvement in DNA repair. These data together provide evidence that each H4 acetylation has a distinct role in T. cruzi. Probably K4 is involved in chromatin assembly during replication while K10 and K14 acetylation appears to be involved in chromatin remodelling during DNA repair and maybe DNA transcription. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

OLIVEIRA, Rodrigo Vasconcelos de. Proteínas espermáticas e dinâmica da cromatina em ruminantes: relação com a fertilidade em touros e com o uso de castanha de caju na dieta de ovinos. 2013. 119 f. Tese (doutorado em zootecnia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-04-22T19:42:24Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_rvoliveira.pdf: 1755876 bytes, checksum: 938cdae211bb3c2ecc1a2c8db23536a9 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-27T17:54:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_rvoliveira.pdf: 1755876 bytes, checksum: 938cdae211bb3c2ecc1a2c8db23536a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T17:54:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_rvoliveira.pdf: 1755876 bytes, checksum: 938cdae211bb3c2ecc1a2c8db23536a9 (MD5) Previous issue date: 2013 / The ruminant fertility is influenced by intrinsic sperm factors, like chromatin or proteins. Considering that the reproductive efficiency is dependent on a balanced and feasible nutrition, the cashew nut meal (CNM) is a low cost byproduct that must be analyzed for possible effects on sperm chromatin and proteins.Study 1:. The objectives of study 1 were to determine failures of chromatin condensation, expression levels and cellular localizations of histones; H3.3, H2B and H4, respectively in spermatozoa from low (LF) vs. high fertility (HF) bulls. The data were analyzed by t test and Pearson correlation (P < 0.05). We demonstrated that aniline blue staining was different within LF (1.73 (0.55, 0.19)) and HF Groups (0.67 (0.17, 0.06) (P < 0.0001), which was also negatively correlated with in vivo bull fertility (r = -0.90; P < 0.0001). Although those histones were consistently immune-detectable and specifically localized in bull sperm, this was not different between the two groups. Except H2B variants, H3.3 and H4 showed 100% identity and conserved among bovine, mouse and human. The H2B variants were more conserved between bovine and human than those of mouse. In conclusion, we showed that H2B, H3.3 and H4 were detectable in bull spermatozoa and that sperm chromatin condensation status, changed by histone retention, is related with bull fertility. Study 2: The objectives of study 2 were evaluate the effects of 13% of CNM inclusion in the diet of Morada Nova rams on the semen parameters, chromatin integrity and sperm proteins. Twenty rams were distributed in two equal groups: cashew nut group (CNG) and control group (COG) that received 13% and 0% of CNM in the diet for 90 days, respectively. The groups were compared for live weight, scrotal circumference, seminal parameters, chromatin integrity and sperm protein profile at 0, 45 and 90 days of the experiment. The data were evaluated by GLM for repeated measures (P < 0.05). At 90 days, CNG (69.00% (7.38; 2.33)) presented percentage of motile sperm superior than control group (60,00% (9,43; 2,98)) (P<0.05). There was not effect from the diet with CNM on chromatin integrity. But, the percentages of protein expression from ODF1 and H2B were larger in the CNG (P<0.05). The proteins: ODF1, GPX4, FTL and H2B were negatively correlated with sperm chromatin quality. In conclusion, the cashew nut meal did not affect negatively the semen quality. / A fertilidade em ruminantes é influenciada por fatores intrínsecos espermáticos como a cromatina e as proteínas. Considerando que a eficiência reprodutiva do macho depende de uma nutrição balanceada e viável, o farelo de castanha de caju (FCC) é um subproduto de baixo custo que deve ser analisado quanto a possíveis efeitos na integridade cromatínica e proteica dos espermatozoides. Estudo 1: O estudo 1 teve como objetivos determinar: falhas na condensação da cromatina, níveis de expressão e localização celular das histonas: H3.3, H2b e H4B, respectivamente, em espermatozoides de touros de baixa (BF) e alta fertilidade (AF). Os dados foram avaliados pelo teste t e correlação de Pearson (P < 0,05). Os resultados do teste do azul de anilina foram diferentes entre os grupos BF (1.73 (0.55, 0.19)) e AF (0,67 (0,17, 0,06) (P < 0,0001), os quais também foram negativamente correlacionados com a fertilidade in vivo de touros (r = -0,90; P < 0,0001). Apesar das histonas terem sido consistentemente imunodetectadas e localizadas nos espermatozoides, estas não apresentaram diferenças entre os grupos. As proteínas H3.3 e H4 apresentaram 100% de identidade e foram conservadas entre bovinos, murinos e seres humanos. Entretanto, as variantes H2B foram mais conservadas entre touros e humanos do que entre humanos e camundongos. Em conclusão, as proteínas H2B, H3.3 e H4 foram detectáveis em espermatozoides de touros e a condensação da cromatina espermática, alterada pela retenção de histonas, é relacionada com a fertilidade de touros. Estudo 2: O estudo 2 objetivou avaliar os efeitos da inclusão de 13% de FCC na dieta de carneiros Morada Nova sobre as características seminais, integridade de cromatina e perfil das proteínas espermáticas. Vinte carneiros foram divididos em dois grupos: castanha (GCA) e controle (GCO).que receberam na dieta 13% e 0% de FCC durante 90 dias, respectivamente. Os grupos foram comparados quanto ao peso vivo, circunferência escrotal, parâmetros seminais, integridade de cromatina e perfil das proteínas espermáticas aos 0, 45 e 90 dias de experimento. Os dados foram analisados pelo método GLM para medidas repetidas (P < 0,05). Aos 90 dias o GCA (69,00% (7,38; 2,33) apresentou porcentagem de espermatozoides móveis superior ao GCO (60,00% (9,43; 2,98)) (P<0.05). Não houve efeito da dieta contendo FCC sobre a integridade da cromatina. Porém, os percentuais das proteínas ODF1 e H2B foram mais elevados nos carneiros do GCA (P < 0,05). As proteínas: ODF1, GPX4, FTL e H2B foram negativamente correlacionadas com a qualidade da cromatina espermática. Em conclusão, a inclusão de FCC na dieta de carneiros não afetou negativamente a qualidade seminal.

O objetivo do estudo foi avaliar, in vitro, a influência da fotobiomodulação (PBM) na, viabilidade e migração, relacionados à acetilação das histonas, e na diferenciação de células-tronco da polpa de dentes permanentes humanos (hDPSCs); e, in vivo, sua influência no reparo radicular de molares de ratos com necrose pulpar e rizogênese incompleta. hDPSCs foram caracterizadas e utilizadas nos experimentos de três artigos científicos. A PBM foi empregada utilizando-se laser diodo InGaAlP (100mW, 660nm, 3J/cm2, energia total por aplicação 1J em 10s). Em todos os experimentos in vitro os grupos foram divididos de acordo com o uso da PBM e os intervalos de irradiação foram de 6 horas. A viabilidade destas células foi avaliada pelo ensaio de MTT e a migração pelo scratch. A acetilação das histonas das hDPSCs foi avaliada por imunofluorescência. Para avaliar o potencial de diferenciação e a deposição de tecido mineralizado, foram utilizados os meios adipogênico, condrogênico e osteogênico, complementado pelo ensaio de atividade ALP, em modelo 3D, em gel de agarose 0,3%. Nos ensaios de diferenciação também foi avaliada a condição nutricional (regular: 10% SFB; ou déficit: 5%SFB). Os resultados do MTT, scratch e da acetilação das histonas foram obtidos em até 24 horas e nos ensaios de diferenciação foram analisados em 7 e 14 dias. Para o experimento in vivo, molares inferiores de ratos Wistar foram expostos ao meio bucal por 3 semanas e, após, tratados com pasta antibiótica por uma semana. A seguir, os canais foram irrigados e divididos em 6 grupos (n=6): MTA; coágulo sanguíneo (CS); hDPSC; MTA+PBM; CS+PBM; hDPSC+PBM. Dois grupos não foram expostos ao meio bucal: Dente hígido+PBM (n=6), Dente hígido (controle positivo, n=3); e um grupo foi mantido exposto durante todo o período experimental: Dente necrótico (controle negativo, n=3). Durante 30 dias as irradiações foram feitas com intervalos de 24 horas. Após, os ratos foram eutanasiados e realizou-se avaliação histológica e imunohistoquímica. Os dados obtidos foram tabulados e analisados estatisticamente. A PBM aumentou a viabilidade das células (P<0.001). No ensaio de scratch o grupo PBM acelerou o fechamento do ferida até 12 horas (P<0.001) e esta fechou em 18 horas, sendo mais rápido que o controle (P<0.05). A PBM aumentou a acetilação das histonas (P<0.001); Após 14 dias, a PBM intensificou a diferenciação nos três meios empregados e na atividade ALP, comparado com os controles (P<0.05). No estudo in vivo, o controle negativo apresentou infiltrado de neutrófilos maior do que os demais grupos (P<0.05). Os grupos Controle negativo, Dente hígido e Dente hígido+PBM apresentaram menos condensação fibrosa (P<0.05). Todos os grupos formaram mais tecido mineralizado que o controle negativo (P<0.05). PBM+MTA, +CS ou +hDPSC formaram mais tecido mineralizado que os grupos não irradiados (P<0.05). MTA+PBM induziu apicificação (P<0.05). A marcação para BSP confirmou os achados histológicos relacionados a formação de tecido mineralizado e as hDPSCs, com e sem PBM, exibiram maior porcentagem de células positivas para BSP. Conclui-se que a PBM desempenhou papel importante, in vitro, aumentando a diferenciação, viabilidade e migração celular que estão relacionados a acetilação das histonas. Além disso, a PBM pode ser uma alternativa de tratamento adjuvante para dentes permanentes com necrose pulpar e rizogênese incompleta favorecendo o reparo radicular. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the influence of photobiomodulation (PBM) on viability and migration, related to histone acetylation, and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs); and, in vivo, its influence on the root repair of rat molars with pulp necrosis and open apex. The hDPSCs were characterized and used in the experiments of three scientific papers. The PBM was applied using InGaAlP diode laser (100mW, 660nm, 3J / cm2, total energy per application 1J in 10s). In all in vitro experiments, the groups were divided according to the use of PBM, with 6-hour irradiation intervals. The viability of these cells was assessed by MTT assay and migration by scratch. The histone acetylationof hDPSCs was evaluated by immunofluorescence. To evaluate the potential for differentiation and deposition of mineralized tissue, adipogenic, chondrogenic and osteogenic mediums were used, complemented by the ALP activity assay in 3D model, in 0.3% agarose gel. In differentiation assays, the nutritional status was also evaluated (regular: 10% FBS; or deficit: 5% FBS). The MTT, scratch and histone acetylation results were obtained until 24 hours, and the differentiation assays were analyzed at 7 and 14 days. For the in vivo experiment, lower molars of Wistar rats were exposed to oral environment for 3 weeks and then treated with antibiotic paste for one week. Next the root canals were irrigated and divided into 6 groups (n=6): MTA; BC (blood clot); hDPSC; healthy tooth+PBM; MTA+PBM; BC+PBM; hDPSC+PBM. In hDSPC groups, 1% agarose gel scaffold was used for cell support. Two groups were not exposed to the oral environment: healthy tooth+PBM (n=6), healthy tooth (positive control, n=3); and one stayed exposed during the role experimental period: necrotic tooth (negative control, n=3). For 30 days the irradiations were done at 24-hour intervals. Thereafter, the rats were euthanized and histological and immunohistochemical evaluations were performed. Data were tabulated and statistically analyzed. PBM increased cell viability (P<0.001). In the scratch assay, the PBM group accelerated wound closure up to 12 hours (P<0.001) and closed at 18 hours, being faster than the control (P<0.05). PBM increased histone acetylation (P<0.001). After 14 days, PBM improved the differentiation in the three mediums employed and the ALP activity, compared to the controls (P<0.05). In the in vivo study, the negative control had greater neutrophil infiltrate than the other groups (P<0.05). Negative Control, Healthy tooth and Healthy tooth+PBM groups presented less fibrous condensation (P<0.05). All groups formed more mineralized tissue than the negative control (P<0.05). PBM+MTA, +BC or +hDPSC formed more mineralized tissue than non-irradiated groups (P<0.05). MTA+PBM induced inoculation (P<0.05). BSP labeling confirmed the histological findings related to mineralized tissue formation and hDPSCs, with and without PBM, exhibited a higher percentage of BSP-positive cells. It is concluded that PBM played an important role, in vitro, increasing differentiation, viability and cell migration that are related to histone acetylation. Moreover, the PBM may be an adjutant treatment alternative for permanent teeth with pulp necrosis and open apex, favoring root repair.

O diagnóstico pré-operatório de nódulos tireoidianos permanece, em alguns casos, um desafio. Atualmente, a punção biópsia por agulha fina, seguida da citologia, é o procedimento de escolha, mas sua aplicação mostra limitações. Por isso, é extremamente instigante e motivadora a ideia de identificar alterações moleculares que possam distinguir nódulos tireoidianos benignos dos malignos. Alterações epigenéticas, em especial as modificações pós-traducionais de histonas, desempenham um papel importante no controle da expressão gênica, e as células cancerosas exibem mudanças nos padrões dessas modificações. Poucas informações estão disponíveis sobre as modificações de histonas presentes nas neoplasias da tireóide e sobre a relação entre tais modificações e a agressividade do tumor. Este estudo avalia o padrão de expressão e relevância biológica das modificações de histonas H4K12ac e H3K36me3, em tecidos de neoplasias tireoidianas e tireóide normal, através da imuno-histoquímica. Nele evidencia-se que, reatividade para H4K12ac é um evento observado em todas as amostras de tireóide normal, adenomas e carcinomas de tireoide, não sendo possível sua utilização como um marcador para essas neoplasias. A H3K36me3 mostra maior marcação no tecido normal em comparação às neoplasias, fato que aponta para um possível papel dessa marca de histona na tumorigênese tireoidiana. Diferente dos outros tecidos, que mostram marcação nuclear, o carcinoma oncocítico apresenta marcação citoplasmática, para ambas as moléculas, além de marcação mais intensa para H3K36me3. A associação dessas histonas à membrana mitocondrial pode ser o evento que determina tais diferenças. / The preoperative diagnosis of thyroid nodules remains, in some cases, a challenge. At present, fine needle aspiration biopsy, followed by cytology, is the gold standard, but its application is limited. It is therefore extremely motivating the idea to identify molecular changes that can distinguish malignant from benign thyroid nodules. Epigenetic alterations, particularly histone modifications, play an important role in control of gene expression, and cancer cells exhibit alterations in these modifications patterns. Little information about histone modifications in thyroid neoplasms and relationship between such modifications and the tumor aggressiveness is at present available. This study evaluates the expression pattern and biological relevance of histone modifications H4K12ac and H3K36me3, in thyroid tumors and normal thyroid tissues, by immunohistochemistry. Here it is evidenced that, reactivity to H4K12ac is an event observed in all samples of normal thyroid, thyroid carcinomas and adenomas, so it is not possible use this modification as a marker for these neoplasms. The H3K36me3 shows level of staining higher in normal tissue as compared to neoplasms, a fact that suggests a possible role of this histone mark on thyroid tumorigenesis. Unlike other tissues, that show nuclear staining, carcinoma oncocytic exhibits cytoplasmic staining, to both molecules, as well as a higher level for H3K36me3. Association between histones and mitochondrial membrane could be an event that determines such differences. / Dissertação (Mestrado)