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Bone-Morphogenetic-Proteine besitzen eine umfangreiche Funktion in der Embryo- und Organogenese sowie bei der Gewebsregeneration im adulten Organismus. BMP-7 ist an der Nephrogenese beteiligt und besitzt protektive und regenerative Fähigkeiten in der adulten Niere. Das eng verwandte BMP-5 ist ebenfalls an der Nephrogenese beteiligt, wurde aber bisher in der adulten humanen Niere nicht untersucht. BMP-2 ist in der Embryogenese unabdingbar. Es induziert die Differenzierung, Migration und Proliferation embryonaler Stammzellen und ist essentiell in der Knochenentwicklung. Die Rolle von BMP-2 in der adulten Niere ist unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression, Funktion und Regulation von BMP-2 und BMP-5 in der adulten humanen Niere, bei der hypertensiven Nephrosklerose und in verschiedenen renalen Zelllinien zu untersuchen.

A pesquisa realizou uma investigação das competências atualizadas nas práticas operadas pelos agentes comunitários de saúde para analisar como estes profissionais podem contribuir para consolidação da reforma psiquiátrica brasileira. O estudo teve como público um grupo de agentes comunitários de saúde (ACS) que atuam em 19 equipes da estratégia de saúde da família no município de Porto Alegre/RS. As ações territorializadas, pautadas por diretrizes de promoção de saúde e humanização da atenção e gestão, impõem-se como necessárias aos avanços do Sistema Único de Saúde e da reforma psiquiátrica. Diante de tal cenário, o objetivo geral da pesquisa foi investigar quais competências as práticas dos ACS atualizam e que podem produzir efeitos de desinstitucionalização da loucura. O levantamento das estratégias de cuidado em saúde mental desenvolvidas pelos agentes, investigação das competências nelas atualizadas, e da presença de efeitos de desinstitucionalização da loucura que possam decorrer da expressão destas competências e a experimentação de uma metodologia pedagógica capaz de potencializá-las, foram objetivos específicos que o estudo também desdobrou. Os aportes teóricos da esquizoanálise e análise institucional compõem o aparato metodológico da investigação desenvolvida em uma perspectiva de pesquisaintervenção e de inspiração cartográfica. Concluímos que a competência dos agentes da qual podem advir as maiores contribuições para o processo de reforma psiquiátrica é a transformação do capital social que possuem vínculos à serem usados na construção de projetos terapêuticos. Diante disso a pesquisa se propôs, a problematizar as relações afetivas entre os agentes de saúde e a população por eles atendida – usando, para isso a filosofia da Baruch Spinoza. Esta análise indicou que no desdobramento do capital social que possuem em vínculos, é mais provável que os bons encontros, e toda a dimensão de alegria que eles envolvem, frutifiquem em vínculos promotores de desinstitucionalização da loucura. Diante disso, argumenta-se a favor da criação de espaços de partilha e troca de experiência, a fim de que a dimensão da afetividade presente no trabalho desses importantes atores do SUS possa ser debatida e de modo a potencializar o exercício da função agente comunitário de saúde. / The research is about an investigation of current skills in the practices operated by community health workers to consider how this workers can contribute to the consolidation of Brazilian psychiatric reform.The study was came up with a group of community health agents (CHA) connected in 19 teams of family1s health strategy in the city of Porto Alegre / RS. Territorialized actions, guided by policies to promote health and humanization of care and management, are riquired to advance the Braziliam’s Health System (SUS) and the psychiatric reform. Seeing this scenario, the objective of this research was to investigate the practices of this works looking for the of skills updated by this practices that are able to promove effects of de-institutionalization of madness. The survey of care strategies developed for comunity healt agentes and the research about skills updated them – analying the presence of effects of de-institutionalization of madness that may result from the expression of these skills; the experimentation with a pedagogical method able to empower the comunity healt agents , were specific objectives study also develop. The theoretical framework of institutional-analysis and schizo-analysis is used to bild the methodological apparatus of this research. It was developed in a research-intervention way and inspirated in cartography.We conclude that the competence of agents which may produce the major contributions to the process of psychiatric reform is the transformation of social capital in bounds able to be used in the construction of therapeutic projects. So we were riquered to think about the relationships between health workers and the population they served to – using to it, the philosophy of Baruch Spinoza. This analysis indicated that the unfolding of the capital they hold in bonds, it is likely that good meetings, and the whole dimension of joy that they involve prosecutors bonds bear fruit in the deinstitutionalization of madness. Therefore, it is argued in favor of the creation of spaces for sharing and exchange of experience, so the dimension of affect present in the work of these important actors in the SUS may be discussed -in order to enhance the exercise of the of community health agents.

A pesquisa realizou uma investigação das competências atualizadas nas práticas operadas pelos agentes comunitários de saúde para analisar como estes profissionais podem contribuir para consolidação da reforma psiquiátrica brasileira. O estudo teve como público um grupo de agentes comunitários de saúde (ACS) que atuam em 19 equipes da estratégia de saúde da família no município de Porto Alegre/RS. As ações territorializadas, pautadas por diretrizes de promoção de saúde e humanização da atenção e gestão, impõem-se como necessárias aos avanços do Sistema Único de Saúde e da reforma psiquiátrica. Diante de tal cenário, o objetivo geral da pesquisa foi investigar quais competências as práticas dos ACS atualizam e que podem produzir efeitos de desinstitucionalização da loucura. O levantamento das estratégias de cuidado em saúde mental desenvolvidas pelos agentes, investigação das competências nelas atualizadas, e da presença de efeitos de desinstitucionalização da loucura que possam decorrer da expressão destas competências e a experimentação de uma metodologia pedagógica capaz de potencializá-las, foram objetivos específicos que o estudo também desdobrou. Os aportes teóricos da esquizoanálise e análise institucional compõem o aparato metodológico da investigação desenvolvida em uma perspectiva de pesquisaintervenção e de inspiração cartográfica. Concluímos que a competência dos agentes da qual podem advir as maiores contribuições para o processo de reforma psiquiátrica é a transformação do capital social que possuem vínculos à serem usados na construção de projetos terapêuticos. Diante disso a pesquisa se propôs, a problematizar as relações afetivas entre os agentes de saúde e a população por eles atendida – usando, para isso a filosofia da Baruch Spinoza. Esta análise indicou que no desdobramento do capital social que possuem em vínculos, é mais provável que os bons encontros, e toda a dimensão de alegria que eles envolvem, frutifiquem em vínculos promotores de desinstitucionalização da loucura. Diante disso, argumenta-se a favor da criação de espaços de partilha e troca de experiência, a fim de que a dimensão da afetividade presente no trabalho desses importantes atores do SUS possa ser debatida e de modo a potencializar o exercício da função agente comunitário de saúde. / The research is about an investigation of current skills in the practices operated by community health workers to consider how this workers can contribute to the consolidation of Brazilian psychiatric reform.The study was came up with a group of community health agents (CHA) connected in 19 teams of family1s health strategy in the city of Porto Alegre / RS. Territorialized actions, guided by policies to promote health and humanization of care and management, are riquired to advance the Braziliam’s Health System (SUS) and the psychiatric reform. Seeing this scenario, the objective of this research was to investigate the practices of this works looking for the of skills updated by this practices that are able to promove effects of de-institutionalization of madness. The survey of care strategies developed for comunity healt agentes and the research about skills updated them – analying the presence of effects of de-institutionalization of madness that may result from the expression of these skills; the experimentation with a pedagogical method able to empower the comunity healt agents , were specific objectives study also develop. The theoretical framework of institutional-analysis and schizo-analysis is used to bild the methodological apparatus of this research. It was developed in a research-intervention way and inspirated in cartography.We conclude that the competence of agents which may produce the major contributions to the process of psychiatric reform is the transformation of social capital in bounds able to be used in the construction of therapeutic projects. So we were riquered to think about the relationships between health workers and the population they served to – using to it, the philosophy of Baruch Spinoza. This analysis indicated that the unfolding of the capital they hold in bonds, it is likely that good meetings, and the whole dimension of joy that they involve prosecutors bonds bear fruit in the deinstitutionalization of madness. Therefore, it is argued in favor of the creation of spaces for sharing and exchange of experience, so the dimension of affect present in the work of these important actors in the SUS may be discussed -in order to enhance the exercise of the of community health agents.

A pesquisa realizou uma investigação das competências atualizadas nas práticas operadas pelos agentes comunitários de saúde para analisar como estes profissionais podem contribuir para consolidação da reforma psiquiátrica brasileira. O estudo teve como público um grupo de agentes comunitários de saúde (ACS) que atuam em 19 equipes da estratégia de saúde da família no município de Porto Alegre/RS. As ações territorializadas, pautadas por diretrizes de promoção de saúde e humanização da atenção e gestão, impõem-se como necessárias aos avanços do Sistema Único de Saúde e da reforma psiquiátrica. Diante de tal cenário, o objetivo geral da pesquisa foi investigar quais competências as práticas dos ACS atualizam e que podem produzir efeitos de desinstitucionalização da loucura. O levantamento das estratégias de cuidado em saúde mental desenvolvidas pelos agentes, investigação das competências nelas atualizadas, e da presença de efeitos de desinstitucionalização da loucura que possam decorrer da expressão destas competências e a experimentação de uma metodologia pedagógica capaz de potencializá-las, foram objetivos específicos que o estudo também desdobrou. Os aportes teóricos da esquizoanálise e análise institucional compõem o aparato metodológico da investigação desenvolvida em uma perspectiva de pesquisaintervenção e de inspiração cartográfica. Concluímos que a competência dos agentes da qual podem advir as maiores contribuições para o processo de reforma psiquiátrica é a transformação do capital social que possuem vínculos à serem usados na construção de projetos terapêuticos. Diante disso a pesquisa se propôs, a problematizar as relações afetivas entre os agentes de saúde e a população por eles atendida – usando, para isso a filosofia da Baruch Spinoza. Esta análise indicou que no desdobramento do capital social que possuem em vínculos, é mais provável que os bons encontros, e toda a dimensão de alegria que eles envolvem, frutifiquem em vínculos promotores de desinstitucionalização da loucura. Diante disso, argumenta-se a favor da criação de espaços de partilha e troca de experiência, a fim de que a dimensão da afetividade presente no trabalho desses importantes atores do SUS possa ser debatida e de modo a potencializar o exercício da função agente comunitário de saúde. / The research is about an investigation of current skills in the practices operated by community health workers to consider how this workers can contribute to the consolidation of Brazilian psychiatric reform.The study was came up with a group of community health agents (CHA) connected in 19 teams of family1s health strategy in the city of Porto Alegre / RS. Territorialized actions, guided by policies to promote health and humanization of care and management, are riquired to advance the Braziliam’s Health System (SUS) and the psychiatric reform. Seeing this scenario, the objective of this research was to investigate the practices of this works looking for the of skills updated by this practices that are able to promove effects of de-institutionalization of madness. The survey of care strategies developed for comunity healt agentes and the research about skills updated them – analying the presence of effects of de-institutionalization of madness that may result from the expression of these skills; the experimentation with a pedagogical method able to empower the comunity healt agents , were specific objectives study also develop. The theoretical framework of institutional-analysis and schizo-analysis is used to bild the methodological apparatus of this research. It was developed in a research-intervention way and inspirated in cartography.We conclude that the competence of agents which may produce the major contributions to the process of psychiatric reform is the transformation of social capital in bounds able to be used in the construction of therapeutic projects. So we were riquered to think about the relationships between health workers and the population they served to – using to it, the philosophy of Baruch Spinoza. This analysis indicated that the unfolding of the capital they hold in bonds, it is likely that good meetings, and the whole dimension of joy that they involve prosecutors bonds bear fruit in the deinstitutionalization of madness. Therefore, it is argued in favor of the creation of spaces for sharing and exchange of experience, so the dimension of affect present in the work of these important actors in the SUS may be discussed -in order to enhance the exercise of the of community health agents.

Bilingualism characterizes not only people, but homes, schools, and communities across the United States. While some bilingual people are forced to suppress their bilingualism, others are encouraged to develop their skill set to a level of becoming biliterate. Bilingualism and biliteracy are key features in dual language bilingual education (DLBE) programs where students are provided daily opportunities to develop two languages simultaneously, along with grade-level academic content. Research in DLBE suggest closure of the achievement gap (Valentino & Reardon, 2015). Traditionally, DLBE programs were designed to keep the two target languages (for example, Spanish and English) separate as designated by time, space, teacher, and academic content area. Teachers who work under these strict guidelines often find that policing language use is both restrictive and unnatural, thus interfering with the flow of bilingual language development. This qualitative case study included 10 teacher participants from one rural school district in the Midwest. The study investigated how teachers perceive and respond to the constraints of language separation during instructional activities. Data were gathered from teacher interviews, classroom observations, and written informal interviews. Findings from this study indicate that under the strict separation of language program model, DLBE teachers brought their unique personal bilingual experiences to their practice by creating opportunities for dynamic and flexible bilingual language use during instructional time. The following strategies contributed to their students’ dynamic bilingualism: (a) the student as teacher, (b) active learning, student engagement, and group work, (c) the use of cognates, (d) strengthening bridges between languages and metalinguistic transfer, (d) reading the word and the world or learning literacy with culturally and contextually relevant literature, and (e) code-switching and translanguaging as a means of addressing the subtractive nature of language learning within an additive bilingual model. On the basis of the findings, the researcher recommends that DLBE program models open spaces for practicing dynamic and flexible bilingualism. Strategizing spaces for the use of two languages during instructional time fosters growth and development for students to become functionally bilingual and biliterate.

The purpose of this study is to examine the cultural relevance of the Peacebuilders model. The study shows that programs such as Peacebuilders need to address concepts of culture that will enhance the diversity of program participants. Many schools and school districts are utilizing these programs to head off student violence, resolve student conflicts and premote school wide harmony.

Etwa 15% aller Paare bleiben ungewollt kinderlos. Männliche Faktoren sind in circa einem Drittel der Fälle als ursächlich anzusehen. Jedoch sind die Erfolgsraten der Therapie männlicher Infertilität durch assistierte Reproduktion auch nach über 30 Jahren seit deren Einführung unbefriedigend. Bestehende Spermienaufbereitungsmethoden wie einfaches Waschen, swim up oder die Dichtegradientenzentrifugation basieren auf makroskopisch-funktionellen Parametern wie Motilität und Morphologie. Spezifische Eigenschaften wie etwa eine aktivierte Apoptosesignalkaskade der Spermien werden dabei nicht berücksichtigt. Die wesentlichen Elemente verschiedener Signalwege der aus somatischen Zellen bekannten Apoptose konnten auch am humanen ejakulierten Spermatozoon nachgewiesen werden. Über die (negativen) Auswirkungen der Apoptose auf die männliche Fruchtbarkeit gibt es einen Konsens. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Selektionsmethoden zu entwickeln, welche auf subzellulärer Ebene intakte Spermien mit dem größtmöglichen Fertilisationspotential aus dem Ejakulat extrahieren. In einem ersten Versuchskomplex konnte gezeigt werden, dass durch die Kombination von Dichtegradientenzentrifugation und swim-up (Standardmethoden in Reproduktionskliniken und andrologischen Laboren) zur Aufbereitung der Spermien von subfertilen Patienten eine akzeptable Reduktion der Spermien mit aktivierter Apoptosesignalkaskade erreicht werden kann. Jedoch gaben die großen interindividuellen Unterschiede im Separationseffekt Anlass zur Entwicklung innovativer Untersuchungs- und Separationsmethoden. So wurden unter anderem fluoreszenzbasierte Tests zur Evaluation von Spermiendefekten, wie beispielsweise einer gestörten Integrität des mitochondrialen Membranpotentials, eingeführt. In den Untersuchungen wurde die Praktikabilität dieser neuen Analyseverfahren im Routineeinsatz unter Standardbedingungen getestet und bestätigt. Die innovative Selektionsmethode der Annexin V-MACS Separation basiert auf der Bindung von Annexin V-MicroBeads an apoptotische Spermien, womit eine Subpopulation reifer, motiler und vitaler Spermien mit inaktivierter Apoptosesignalkaskade gezielt angereichert wird. Das Konzept wurde zudem erfolgreich auf ein (Glaswoll-) Festphasen-Filtersystem ohne frei schwimmende Microbeads übertragen. Dadurch gelang die Minimierung eines potentiellen Transmissionsrisikos der Microbeads bei der Anwendung im Rahmen der künstlichen Befruchtung. Den hohen Stellenwert dieser Verfahren belegen die Ergebnisse zweier in-vitro Modelle, an denen erstmalig gezeigt werden konnte, dass durch die Selektion von Spermien mit inaktivierter Apoptose-Signalkaskade höhere Fertilisationsraten erreichbar sind.

Glioblastoma multiforme (GBM) ist der nach WHO am gefährlichsten eingestufte Hirntumor astrozytären Ursprungs. Patienten versterben ohne Behandlung etwa drei bis sechs Monaten nach Diagnose, die derzeitig modernste Behandlung mit Chemo-Radiotherapie verlängert das mediane Überleben auf 12-15 Monate. Trotz intensiver Forschung gibt es zurzeit keine realistische Heilungschance. Bislang erfolgt der Großteil der Forschung an Zellkulturen oder mit Hilfe von Tiermodellen, bei denen ein Tumor künstlich erzeugt wird. Dabei ergeben sich Probleme für die Übertragung der Ergebnisse auf den Menschen. Zellkulturen werden z.B. als sogenannte Monolayer-Kulturen gehalten, was bedeutet, dass ihnen der natürliche Gewebeverband und die für Signalling-Wege wichtige extrazelluläre Matrix fehlen. Außerdem werden solche Langzeitkulturen häufig subkultiviert und mutieren dadurch in Richtung einer klonalen Linie, was zwar Ergebnisse leichter reproduzierbar macht, aber nicht die Situation im Patienten widerspiegelt. Tierversuche implizieren zwar den Gewebeverband im Körper, jedoch müssen die dafür verwendeten Nager immunsupprimiert sein, so dass sie den induzierten Tumor nicht abstoßen. Dies erzeugt wiederum ein künstliches Umfeld. In diesem Projekt wird untersucht, ob sich humane GBM-Gewebe als sogenannte Slice-Kultur halten lassen und als Testsysteme zur Untersuchung der Wirkung von Chemotherapeutika sowie Bestrahlung geeignet sind. Bei dieser Kultivierungsmethode wird das Gewebe in Scheiben (Slices) geschnitten, wobei alle Zellen im Verband sowie die 3D-Struktur erhalten bleiben. Wegen des humanen Ursprungs entfällt das Problem des Speziesunterschiedes. Das Gewebe wird direkt aus dem Operationssaal ins Labor transferiert und weiterverarbeitet. Wir konnten bislang zeigen, dass Slice-Kulturen von humanem GBM über mindestens zwei Wochen in Kultur vital bleiben und ihre ursprüngliche charakteristische Morphologie beibehalten. Etablierte Behandlungsmethoden wie die Gabe von Temozolomid oder Röntgenbestrahlung zeigen auch in kultivierten Slices bekannte Effekte wie Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen, Reduktion von Proliferation und Aktivierung des Apoptose-Enzyms Caspase 3. Eine neue Therapieoption besteht seit einigen Jahren in der Bestrahlung mit Kohlenstoffionen (12C), die an der GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung in Darmstadt entwickelt und getestet wurde. Derzeit wird diese Therapie sehr erfolgreich an soliden Tumoren im Kopf- und Halsbereich angewendet und soll nun auf weitere Tumorarten ausgedehnt werden. Eine Kooperation mit der dortigen Biophysik-Gruppe wurde initiiert, um humane GBM-Slices mit 12C zu bestrahlen. Bislang wurde das entsprechende Setup etabliert und erste Experimente durchgeführt. Die ersten Ergebnisse wurden kürzlich publiziert. Weiterhin soll nun geprüft werden, ob das Ansprechen der GBM Slice-Kulturen mit dem Überleben der Patienten korreliert bzw. ob resistente Kulturen aus Patienten stammten, die schlecht auf die Therapie reagierten. Außerdem sollen überlebende Zellen in den Slices nach Behandlung auf ihre molekularen Eigenschaften geprüft werden, um Hinweise auf die Mechanismen der Tumorresistenz zu erhalten. Langfristig könnten diese Slice-Kulturen genutzt werden, um neuartige Wirkstoffe in der Vorklinik zu prüfen oder eine optimierte, personalisierte Therapie für Patienten zu ermitteln.

Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate. Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich. Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.:Inhaltsverzeichnis Bibliografische Darstellung V Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis IX Tabellenverzeichnis X Formelverzeichnis XII 1 Einleitung 1 1.1 West-Nil-Virus: Relevanz und epidemiologische Aspekte 1 1.2 Virale Struktur und Replikation 3 1.3 West-Nil-Virus-Erkrankung: Prädiktion, Pathogenese und Krankheitsbild 7 1.4 Diagnostik von West-Nil-Virus-Infektionen 9 1.5 Zielstellung 12 2 Materialien 13 2.1 Versuchstiere, Bakterien-, Hefe- und Virusstämme 13 2.2 Vektoren und Oligonukleotide 13 2.3 Reagenzsysteme, Standards und Enzyme 15 2.4 Antikörper 16 2.5 Feinchemikalien und Reagenzien 16 2.6 Puffer und Lösungen 19 2.7 Nährmedien 20 2.8 Verbrauchsmaterialien und Technische Ausstattung 21 3 Methoden 25 3.1 Molekularbiologische Methoden 25 3.1.1 Reverse Transkription 25 3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 25 3.1.3 DNA-Sequenzierung 28 3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese 28 3.1.5 DNA-Reinigung 29 3.1.6 Bestimmung der DNA-Konzentration 29 3.1.7 Restriktionsverdau 29 3.1.8 Ligation 30 3.2 Arbeiten mit E. coli 31 3.2.1 Kultivierung und Lagerung 31 3.2.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 31 3.2.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E. coli-Zellen 31 3.2.4 Plasmidpräparation aus E. coli 31 3.2.5 Expression rekombinanter Proteine in E. coli 32 3.3 Arbeiten mit P. pastoris 32 3.3.1 Kultivierung und Lagerung 32 3.3.2 Herstellung kompetenter P. pastoris-Zellen 32 3.3.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente P. pastoris-Zellen 33 3.3.4 Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris 33 3.4 Biochemische Methoden 34 3.4.1 Proteinextraktion aus Bakterienzellen 34 3.4.2 Proteinextraktion aus Hefezellen 35 3.4.3 Proteinfällung mittels Trichloressigsäure (TCA) 35 3.4.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 35 3.4.5 Silberfärbung 37 3.4.6 Western Blot 37 3.4.7 Reinigung der rekombinanten Polypeptide aus Proteingemischen 38 3.4.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 40 3.4.9 Spaltung von MBP-Fusionsproteinen 40 3.4.10 Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) 41 3.4.11 Immunisierung der Balb/c-Mäuse 42 3.4.12 Indirekter ELISA 43 3.4.13 Bestimmung des murinen Antikörpertiters 44 3.4.14 Nachweis humaner Antikörper im Testserum 45 4 Ergebnisse 46 4.1 Definition der ausgewählten Strukturproteinsequenzen 46 4.2 Expression der rekombinanten Polypeptide prM, Cnat und Cme in P. pastoris 47 4.2.1 Klonierung der Expressionsplasmide 47 4.2.2 Transformation von Pichia pastoris 49 4.2.3 Expression der Zielpeptide in P. pastoris 51 4.3 Expression von Cnat und Cme in E. coli 56 4.3.1 Klonierung der Expressionsplasmide 56 4.3.2 Transformation von E. coli 58 4.3.3 Expression der WNV-Sequenzen Cnat und Cme als Fusionsproteine 59 4.3.4 Spaltung der Fusionsproteine mittels Faktor Xa 62 4.3.5 Isolierung der Zielpeptide Cnat und Cme 63 4.4 Untersuchung der Immunogenität der rekombinanten WNV-Polypeptide 66 4.4.1 Immunisierung von Versuchstieren mit rekombinanten WNV-Polypeptiden 66 4.4.2 Analyse der murinen Seren mittels ELISA 66 4.4.3 Erweiterte Analyse des rekombinanten prM-Polypeptids mit Humanseren 67 4.4.4 Erweiterte Analyse der murinen prM-Seren im IFT 69 4.5 Prüfung der rekombinanten Peptidantigene auf ihre Verwendbarkeit in einem WNV-spezifischen Testsystem 69 4.5.1 Untersuchung der humanen Seren S2-S42 mittels ELISA 69 4.5.2 Einsatz von Cnat und MBP-Cme als Antigene zur Untersuchung der humanen Seren S2-S42 im ELISA 70 5 Diskussion 72 5.1 Expression von prM, Cnat und Cme in P. pastoris 73 5.2 Expression von Cnat und Cme in E. coli 77 5.3 Analyse der Immunogenität von prM, Cnat und MBP-Cme 79 5.4 Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA für die Detektion WNV-spezifischer Antikörper in humanen Serumproben 84 6 Zusammenfassung 90 7 Literaturverzeichnis 94 8 Anhang 104 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XIV Danksagung XV Lebenslauf XVI