Schwere Infektionen und Abstoßungen sind die häufigsten Komplikationen nach Lebertransplantation. Hyaluronsäure (HA) als eine Komponente der extrazellulären Matrix wird aus dem Blutkreislauf praktisch nur durch die Endothelzellen der Lebersinusoide (SEC) entfernt. Somit ist die Konzentration von HA im Plasma abhängig vom HA-Einstrom in den Blutkreislauf (z.B. bei vermehrter HA-Produktion der Fibroblasten nach Zytokinstimulation) und der metabolischen Funktion der SEC. Es wird angenommen, daß die SEC zu den ersten Angriffspunkten einer Abstoßungsreaktion in der Leber gehören. Bei 81 Patienten mit 85 Lebertransplantationen wurde zusätzlich zu den Routineparametern die Plasma-HA bestimmt. 28 der 81 Patienten (34,6%) entwickelten eine akute Abstoßung. 14 Patienten konnten erfolgreich mit Methylprednisolon (steroid-sensible akute Abstoßung, AR) behandelt werden, während 14 Patienten eine zusätzliche Therapie mit FK506 oder OKT3 (steroid-resistente akute Abstoßung, SR) benötigten. 4 Patienten entwickelten innerhalb des ersten postoperativen Jahres eine frühe chronische Abstoßung (CR). Bei 10 Patienten wurde eine schwere postoperative Infektion beobachtet, 11 Patienten entwickelten eine milde oder asymptomatische Cholangitis, während 37 Patienten einen unauffälligen postoperativen Verlauf hatten. Mittlere HA Spiegel waren bei den Patienten mit AR gegenüber den Patienten mit unauffälligem Verlauf erhöht. Ein weiterer Anstieg von HA konnte bei den Patienten mit SR (p / Severe infections and rejections are the most frequent complications following liver transplantation. Hyaluronic acid (HA) as a component of the extracellular matrix is cleared from the circulation only by sinusoidal liver cells (SEC). So the concentration of plasma HA depends upon the flow of HA in the circulation (e.g. increased HA-production in fibroblasts after cytokine stimulation and release) and the metabolic function of the SEC. SECs are suspected to be the first targets in allograft liver rejection. 81 patients with 85 liver transplantations were monitored for routine parameters and plasma HA on a daily basis. Of 81 patients, 28 patients (34,6%) developed acute rejection. 14 patients were successfully treated with methylprednisolone (steroid-sensitive acute rejection, AR), while 14 patients required additional treatment with FK506 or OKT3 (steroid-resistant acute rejection, SR). 4 patients developed an early chronic rejection (CR) within the first postoperative year. 10 patients developed a severe postoperative infection, 11 patients had a mild or asymptomatic cholangitis, while 37 patients had an uneventful postoperative course. Mean HA levels were elevated in patients with AR compared with patients with an uneventful course. A further increase in HA was noticed in patients with SR (p

Ziel dieser Studie war es, Auswirkungen von subgingival applizierter Hyaluronsäure (Gengigel®) nach scaling and root planing (SRP) auf mikrobiologische Variablen bei Parodontitispatienten nachzuweisen. Dabei wurden die möglichen Zusammenhänge zwischen Ergebnissen der Bakterienspezies und zuvor ermittelten Ergebnissen klinischer Variablen untersucht. An der Untersuchung nahmen 20 Männer und 29 Frauen teil. Es erfolgte eine Randomisierung in zwei Gruppen, bestehend aus einer Testgruppe mit 23 und einer Kontrollgruppe mit 26 Probanden. Bei den Versuchteilnehmern wurde in zwei Sitzungen in einem 24-stündigen Abstand ein SRP mittels Hand- und Ultraschallinstrumenten durchgeführt. Am Ende des SRP wurde in der Testgruppe Gengigel prof® (mit 0,8% Hyaluronsäure) in die parodontalen Taschen eingebracht. Zusätzlich trugen die Probanden der Testgruppe während der folgenden 14 Tage zweimal täglich morgens und abends Gengigel® (0,2%) auf den Gingivarand auf. In der Kontrollgruppe erfolgte das übliche SRP ohne Verwendung von Gengigel®. Alle Probanden wurden zu Beginn der Untersuchung, nach drei und sechs Monaten aus parodontologischer Sicht untersucht. Des Weiteren wurden Proben der Sulkusflüssigkeit für eine spätere Analyse von zehn parodontopathogenen Keimen sowie der Peroxidase- und Granulozytenaktivität gewonnen. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Zunahme in der Kontrollgruppe (p=0,035) konnte beim Verlauf der Gesamtbakterienzahl für die Testgruppe keine Veränderung der Keimzahlen (p=0,737) beobachtet werden. In der Testgruppe wurde nach sechs Monaten für Campylobacter rectus, Treponema denticola und Aggregatibacter actinomycetemcomitans eine Reduktion der Keimbelastung festgestellt (p=0,05; p=0,043; p=0,066). Am Ende der Untersuchung waren in der Testgruppe keine Unterschiede in der bakteriellen Besiedlung unterschiedlich tiefer Taschen mehr nachweisbar (p=1). In der Testgruppe bestand eine stark signifikante Korrelation der Granulozytenaktivität mit der Zeit (r=0,443; p<0,0001) und mit der Gesamtbakterienzahl (r=0,336; p=0,009). Die Ergebnisse der Studie weisen auf einen wachstumshemmenden Effekt der Hyaluronsäure auf parodontopathogene Bakterien hin, welcher womöglich auf einer indirekten Interaktion mit dem Immunsystem basiert.

Die vorliegende Arbeit befasst sich dem Glykosaminoglykan (GAG) Hyaluronan (HA) und dessen Einfluss auf die Entwicklung des malignen Melanoms (MM). Das in der extrazellulären Matrix (ECM) reichlich vorkommende HA wird schon seit dem späten 20. Jahrhundert genauerer im Zusammenhang mit der Tumorentwicklung untersucht. Gegensätzliche Eigenschaften von HA, die zum einen Tumore fördern und zum anderen ihnen entgegenwirken, wurden seither veröffentlicht. Allgemeiner Konsens ist, dass das HA-Molekulargewicht über die verschiedenen Effekte von HA entscheidet. Momentan ist jedoch nicht ausreichend belegt, wie HA auf das Tumorwachstum einwirkt und welche HA-Größen dies speziell begünstigen. Diese Untersuchung basiert auf einem in vivo Knockout von der Hyaluronan Synthase 2 (Has2) in der Maus, der die Produktion von hoch-molekulargewichtigen HA (HMW-HA) weitestgehend einschränkte. Das Wachstum vom experimentellem MM wurde in Abwesenheit der meisten HMW-HA untersucht. Diese Arbeit versuchte den Beweis zu erbringen, dass das lokale Wachstum und die Metastasenbildung der MM-Zellen abhängig von der vorhandenen HMW-HA in der Nähe des Tumors ist. Der Has2-knockout in der Mauslinie C57BL6 wurde verifiziert und nach einem veränderten Phänotyp der Mäuse untersucht. Obwohl nahezu dreiviertel der absoluten HA Menge durch den Knockout fehlte, zeigten die Mäuse keinen offensichtlichen Veränderungen. Erst eine Messung der Haut-Permeabilität deutete auf eine womöglich verstärkte Ausbildung der Stratum corneum hin. Eine direkte Auswirkung vom fehlendem HA auf das Tumorwachstum und der Metastasierungsrate konnte nicht ausreichend belegt werden. Das verwendete Mausmodell sowie die Wahl des experimentellen Tumors werden in dieser Arbeit kritisch diskutiert. Parallel durchgeführte in vitro Versuche mit teilweise artifiziellen 3D Matrizen, die unterschiedliche Mengen von HA enthielten, zeigten einen stärkeren Einfluss von niedermolekulare HA (LMW-HA) auf die Proliferation und Invasion von MM Zellen. Diese Beobachtungen stimmen mit dem derzeitigen Konsens überein, dass LMW-HA aktivierende Signaltransduktion auslöst und HMW-HA eher homöostatisch wirkt.:TABLE OF CONTENT Zusammenfassung Summary Table of content List of figures List of tables Abbreviations 1 Introduction 1.1 Structures of the skin 1.2 The malignant melanoma 1.3 The tumor microenvironment (TME) 1.4 Hyaluronan 1.4.1 HA Structure 1.4.2 HA anabolism 1.4.3 HA catabolism 1.4.4 HA binding proteins 1.4.5 HA cell surface receptors 1.5 Hyaluronan in malignant melanoma 1.6 Aim of the thesis 2 Methods 2.1 Murine malignant melanoma cell lines 2.2 Inducible Has2-knockout mice 2.2.1 The Cre/loxP System 2.2.2 Genetical modification for the Has2-knockout 2.2.3 4-Hydroxytamoxifen induction of knockout 2.2.4 Experimental tumor model in mouse 2.2.5 Intravenous tumor injection 2.3 Primary Has2-knockout fibroblasts for in vitro experiments 2.3.1 Isolation of primary fibroblast from mouse skin tissue 2.3.2 Induction of Has2-ko fibroblasts 2.4 Molecular analysis 2.4.1 PCR analysis of genome DNA 2.4.2 Quantification of gene expression 2.4.3 Microarray analysis 2.4.4 Quantification of Has2 protein levels 2.4.5 Quantification of HA 2.4.6 HA size analysis by agarose gel electrophoresis 2.5 Physical analysis of the skin 2.5.1 Skin elasticity measurement 2.5.2 Skin permeability measurement 2.5.3 Skin hydration and TEWL measurement 2.6 Histological analysis 2.6.1 Cryo-fixed samples 2.6.2 Immunofluorescence staining 2.6.3 FFPE samples 2.6.4 HA staining 2.6.5 Histochemical images 2.7 Physiological analysis of MM cell proliferation with BrdU-Assay 2.8 Statistical analysis 3 Materials 3.1 Mouse lines 3.2 Cell lines 3.3 Buffer and solution recipes 3.4 Chemicals 3.5 Molecular-biological reagents and enzymes 3.6 Primers 3.7 Antibodies 3.8 Kits 3.9 Devices and tools 3.10 Disposables 3.11 Software 4 Results 4.1 The Has2-knockout mouse model 4.1.1 Has2-knockout characterization 4.1.2 Incomplete Has2 deletion 4.1.3 Effects of the HA knockdown 4.1.4 Has2-knockout efficiency in other organs 4.1.5 Effects of Has2-knockout on gene expression 4.2 In vitro Has2-knockout and effect on MM cells 4.2.1 In vitro Has2- and HA-knockdown 4.2.2 Has2-ko fibroblast conditioned media decreased MM proliferation 4.2.3 MM conditioned media influenced fibroblast’s HA secretion 4.2.4 The transition towards in vivo tumor experiments 4.3 In vivo Tumor experiments 4.3.1 HA threshold, correlation, and exclusions 4.3.2 Effects of HA knockdown on primary tumor volume and weight 4.3.3 Tumor histology and HA localization 4.3.4 HA fragments in tumors, healthy-, and tumor-related-skin samples 4.3.5 Metastasis formation 5 Discussion 5.1 HA knockdown 5.2 HA knockdown phenotype 5.2.1 Skin stiffness 5.2.2 Skin water homeostasis 5.3 Paracrine interactions between MM and fibroblasts 5.4 HA thresholding 5.5 Tumor readouts 5.6 In vitro ECM models 5.7 Metastasis 5.8 Alternative tumor models with stronger stromal interaction 5.9 The presented results considering current HA-Tumor research 6 Conclusion 7 Literature Danksagung Lebenslauf Akademischer Werdegang Stipendium und Auszeichnung Publikation und Posterpräsentation Publikationen Vorträge und Posterpräsentationen Eigenständigkeitserklärung / The present work addresses the glycosaminoglycan (GAG) hyaluronan (HA) and its influence on the development of malignant melanoma (MM). HA, which is abundant in the extracellular matrix (ECM), has been studied closely in relation to tumor development since the late 20th century. Opposing properties of HA, on the one hand promoting tumors and the other hand counteracting them, have since been published. The general consensus is that HA molecular weight determines the various effects of HA. However, there is insufficient evidence on how HA affects tumor growth and which HA sizes specifically promote it. This study is based on an in vivo knockout of hyaluronan synthase 2 (Has2) in mice, which largely restricted the production of high molecular weight HA (HMW-HA). Growth from experimental MM was examined in the absence of most HMW-HA. This work sought to provide evidence that local growth and metastasis of MM cells is dependent on the presence of HMW-HA in the vicinity of the tumor. Has2 knockout in the mouse line C57BL6 was verified and examined for an altered phenotype of the mice. Although nearly three-quarters of the absolute HA amount was absent due to the knockout, the mice showed no obvious change. Only a measurement of skin permeability indicated a possible increased barrier function of the stratum corneum. A direct effect of the lack of HA on tumor growth and metastasis rate could not be sufficiently demonstrated. The applied mouse model and the choice of experimental tumor are critically discussed in this work. Parallel in vitro experiments with partially artificial 3D matrices containing different amounts of HA showed a stronger influence of low molecular weight HA (LMW-HA) on proliferation and invasion of MM cells. These observations are consistent with the emerging consensus that LMW-HA triggers activating signal transduction and HMW-HA is more homeostatic.:TABLE OF CONTENT Zusammenfassung Summary Table of content List of figures List of tables Abbreviations 1 Introduction 1.1 Structures of the skin 1.2 The malignant melanoma 1.3 The tumor microenvironment (TME) 1.4 Hyaluronan 1.4.1 HA Structure 1.4.2 HA anabolism 1.4.3 HA catabolism 1.4.4 HA binding proteins 1.4.5 HA cell surface receptors 1.5 Hyaluronan in malignant melanoma 1.6 Aim of the thesis 2 Methods 2.1 Murine malignant melanoma cell lines 2.2 Inducible Has2-knockout mice 2.2.1 The Cre/loxP System 2.2.2 Genetical modification for the Has2-knockout 2.2.3 4-Hydroxytamoxifen induction of knockout 2.2.4 Experimental tumor model in mouse 2.2.5 Intravenous tumor injection 2.3 Primary Has2-knockout fibroblasts for in vitro experiments 2.3.1 Isolation of primary fibroblast from mouse skin tissue 2.3.2 Induction of Has2-ko fibroblasts 2.4 Molecular analysis 2.4.1 PCR analysis of genome DNA 2.4.2 Quantification of gene expression 2.4.3 Microarray analysis 2.4.4 Quantification of Has2 protein levels 2.4.5 Quantification of HA 2.4.6 HA size analysis by agarose gel electrophoresis 2.5 Physical analysis of the skin 2.5.1 Skin elasticity measurement 2.5.2 Skin permeability measurement 2.5.3 Skin hydration and TEWL measurement 2.6 Histological analysis 2.6.1 Cryo-fixed samples 2.6.2 Immunofluorescence staining 2.6.3 FFPE samples 2.6.4 HA staining 2.6.5 Histochemical images 2.7 Physiological analysis of MM cell proliferation with BrdU-Assay 2.8 Statistical analysis 3 Materials 3.1 Mouse lines 3.2 Cell lines 3.3 Buffer and solution recipes 3.4 Chemicals 3.5 Molecular-biological reagents and enzymes 3.6 Primers 3.7 Antibodies 3.8 Kits 3.9 Devices and tools 3.10 Disposables 3.11 Software 4 Results 4.1 The Has2-knockout mouse model 4.1.1 Has2-knockout characterization 4.1.2 Incomplete Has2 deletion 4.1.3 Effects of the HA knockdown 4.1.4 Has2-knockout efficiency in other organs 4.1.5 Effects of Has2-knockout on gene expression 4.2 In vitro Has2-knockout and effect on MM cells 4.2.1 In vitro Has2- and HA-knockdown 4.2.2 Has2-ko fibroblast conditioned media decreased MM proliferation 4.2.3 MM conditioned media influenced fibroblast’s HA secretion 4.2.4 The transition towards in vivo tumor experiments 4.3 In vivo Tumor experiments 4.3.1 HA threshold, correlation, and exclusions 4.3.2 Effects of HA knockdown on primary tumor volume and weight 4.3.3 Tumor histology and HA localization 4.3.4 HA fragments in tumors, healthy-, and tumor-related-skin samples 4.3.5 Metastasis formation 5 Discussion 5.1 HA knockdown 5.2 HA knockdown phenotype 5.2.1 Skin stiffness 5.2.2 Skin water homeostasis 5.3 Paracrine interactions between MM and fibroblasts 5.4 HA thresholding 5.5 Tumor readouts 5.6 In vitro ECM models 5.7 Metastasis 5.8 Alternative tumor models with stronger stromal interaction 5.9 The presented results considering current HA-Tumor research 6 Conclusion 7 Literature Danksagung Lebenslauf Akademischer Werdegang Stipendium und Auszeichnung Publikation und Posterpräsentation Publikationen Vorträge und Posterpräsentationen Eigenständigkeitserklärung

Das Basalzellkarzinom (BZK) der Haut gilt als einer der häufigsten semimalignen Tumoren. Trotz der niedrigen Metastasierungsrate von < 0,1 % können BZK schwerwiegende Infiltrationen und Destruktionen knorpeliger sowie knöcherner Strukturen verursachen. Für die Tumorentstehung ist vor allem die kumulative UVB-Dosis in Kindheit und Adoleszenz bedeutsam. Aber auch die Embryonalentwicklung scheint eine Rolle in der Pathogenese von Tumoren zu spielen. Die so genannte embryonale Fusionszone (eFZ) entsteht zwischen der 5-10 Entwicklungswoche durch die Verschmelzung der fünf Gesichtswülste. Es konnte gezeigt werden, dass BZK innerhalb dieses Kompartiments nicht nur gehäuft auftreten sondern auch durch ein ausgeprägtes Tiefenwachstum charakterisiert sind. Als mögliche Ursache für das verstärkt invasive Wachstum von BZK innerhalb der eFZ wurden Änderungen im Hyaluronsäure (HA)-Stoffwechsel der Stromazellen angenommen. Neben der Bedeutung in der Embryonalentwicklung und bei der Geweberegeneration zeigten verschiedene Studien zudem die essentielle Rolle von HA im Rahmen von malignen Zelltransformationen. Vermehrte HA-Ablagerungen in der Tumorumgebung oder erhöhte HA-Serumkonzentrationen wurden bei einer Vielzahl von Tumoren als Zeichen einer fortschreitenden Tumorprogression beschrieben. Um den HA-Stoffwechsel von Stromafibroblasten um BZK gezielt zu untersuchen, wurden der HA-Gehalt, die HA-Größe und die exprimierten Enzyme des HA-Stoffwechsels in Abhängigkeit von ihrer Lokalisationen miteinander verglichen. Dabei zeigte sich, dass sowohl innerhalb als auch außerhalb der eFZ vergleichbare Mengen und Polymergrößen von HA sezerniert werden. Molekularbiologische Untersuchungen an expandierten Fibroblasten aus Biopsien verschiedener Lokalisationen zeigten ebenfalls keine Unterschiede in der Expression von mRNA der HA Stoffwechselenzyme nach Herkunft der Fibroblasten. Somit wird geschlussfolgert, dass HA zwar auch im Stroma von BZK gebildet wird, der HA-Stoffwechsel von Stromafibroblasten jedoch kein Merkmal ist, das mit dem vermehrten Auftreten und invasiven Wachstum von BZK im Bereich der embryonalen Fusionszone des Mittelgesichts korreliert.

Die aufgrund des demografischen Wandels steigende Zahl an Patienten mit Knochendefekten, chronischen Wunden und einhergehender Multimorbidität stellt ein großes klinisches und sozioökonomisches Problem dar. Derzeitige etablierte Verfahren zur Behandlung von Knochen- und Hautdefekten weisen zahlreiche Nachteile auf, weshalb die Erforschung innovativer Methoden notwendig ist. Ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Wundheilungskapazität ist die Funktionalisierung von Biomaterialien mit Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), die eine Rolle bei der Geweberegeneration spielen. Glykosaminoglykane (GAGs) sind wichtige ECM-Komponenten, von denen bekannt ist, dass sie mit Mediatorproteinen interagieren, wodurch sie deren biologische Aktivität und damit zelluläre Prozesse beeinflussen. Native GAGs, wie Heparansulfat, sind jedoch aufgrund ihrer eingeschränkten Verfügbarkeit, Charge-zu-Charge-Variabilität und ihrer quellenabhängigen biologischen Aktivität nur begrenzt für biomedizinische Anwendungen geeignet. Daher sind chemisch modifizierte Hyaluronsäure (HA)- und Chondroitinsulfat (CS)-Derivate mit definierten Eigenschaften bezüglich des Kohlenhydratrückgrats, sowie des Sulfatierungsgrades und -musters besonders geeignet, um ihre Struktur-Eigenschaftsbeziehung in der Interaktion mit heilungsrelevanten Mediatorproteinen und Zellen zu untersuchen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, mit denen GAGs zelluläre Prozesse direkt oder indirekt durch Bindung von Wachstumsfaktoren beeinflussen. Hierbei sollte vor allem gezeigt werden, wie Kohlenhydratrückgrat, Sulfatierungsgrad und -muster der GAG-Derivate die Interaktion und damit die biologische Aktivität des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF)-β1, sowie der angiogenen Mediatoren vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)165 und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) beeinflussen. In vorangegangen Studien wurde gezeigt, dass sulfatierte HA- (sHA) und CS-Derivate stark mit Wachstumsfaktoren, wie den knochenmorphogenetischen Proteinen (BMP)-2/-4 und TGF-β1 wechselwirken. Letzterer wies eine beeinträchtigte Bioaktivität in Gegenwart von hochsulfatierter HA (sHA3) auf. Der zugrundeliegende Mechanismus wurde bisher nicht vollständig aufgeklärt und daher in dieser Arbeit untersucht. Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Untersuchungen mit allen Komponenten des TGF-β1:Rezeptor-Komplexes in Anwesenheit von GAGs zeigten, dass die Vorinkubation von TGF-β1 mit sHA-Derivaten die Bindung von TGF-β1, insbesondere an TGF-β Rezeptor (TβR)-I, aber auch an TβR-II, blockierte. In sequentiellen SPR-Experimenten, welche die in vivo-TGF-β1:Rezeptor-Komplexbildung genauer nachahmen, war jedoch die Rekrutierung von TβR-I zum TβR-II/TGF-β1-Komplex signifikant stärker, wenn der Komplex sHA3 enthielt. GAGs üben somit einen dualen Blockierungsmechanismus auf die TGF-β1:Rezeptor-Komplexbildung aus, wobei die Effekte stark von der Reihenfolge der Bindungsereignisse abhängen. Die hier erstmals untersuchte Bioaktivität von TGF-β1 in Verbindung mit sHA auf Rezeptorebene zeigte eine Abnahme der Phosphorylierung für TβR-I und das TβR-I-regulierte Effektorprotein Smad2 in Gegenwart von sHA3, was auf die Bildung eines inaktiven Signalkomplexes hindeutet. Ebenfalls analysiert wurde die Struktur-Eigenschaftsbeziehung von HA- und CS-Derivaten in ihrer Wechselwirkung mit den wichtigsten angiogenen Wachstumsfaktoren: VEGF165 und bFGF. Ziel war es strukturelle Eigenschaften zu identifizieren, die zu einer Interaktion beitragen und die biologischen Konsequenzen von Wachstumsfaktor/GAG-Interaktion zu ermitteln. Beide Wachstumsfaktoren zeigten eine sulfatierungsabhängige Wechselwirkung mit GAG-Derivaten in der SPR-Bindungsanalyse. Anders als bFGF zeigte VEGF165 außerdem eine klare Präferenz für sHA im Vergleich zu CS-Derivaten, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung mit diesem Wachstumsfaktor nicht nur vom Sulfatierungsgrad, sondern auch vom Kohlenhydrat-Rückgrat des GAGs beeinflusst wird. sHA-Tetramere waren ausreichend, um mit VEGF165 und bFGF in SPR-Messungen zu interagieren und zeigten, dass die Position der Sulfatierung eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit beiden angiogenen Wachstumsfaktoren zu spielen scheint, da die Bindungsstärke des sHA-Tetrasaccharids ohne C6-Sulfatierung des N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Vergleich zu einem ausschließlich an der C6-Position sulfatiertem Derivat geringer war. Interessanterweise war die Bindung von tetramerer persulfatierter HA (psHA) im Vergleich zu einem psHA-Hexamer stärker, was darauf hinweist, dass das Tetrasaccharid in der Lage ist, mit zusätzlichen GAG-Bindungsstellen von VEGF165 und bFGF zu interagieren. Die Bindung von VEGF165 und bFGF an ihre jeweiligen Rezeptoren VEGF Rezeptor (VEGFR)-2 und FGF Rezeptor (FGFR) 1 war vermindert, wenn die Wachstumsfaktoren in SPR-Studien mit sulfatierten GAGs vorinkubiert wurden. Auch hier wurde für VEGF165 ein Einfluss des Kohlenhydratrückgrats nachgewiesen, da die Bindung des Wachstumsfaktors an VEGFR-2 durch sHA-Derivate stärker gehemmt wurde als durch CS-Derivate mit vergleichbarem Sulfatierungsgrad. Auch auf die bFGF/FGFR1IIIc-Interaktion hatte die Sulfatierung der C6-Position des GlcNAc von sHA1 einen stärkeren Einfluss als die C4-Sulfatierung des GlcNAc von CS. Im Gegensatz dazu war die Blockierungskapazität von sCS3 und sHA3 jedoch ähnlich. Dies deutet auf einen geringen Einfluss des Kohlenhydratrückgrats, jedoch auf einen großen Einfluss des gesamten Sulfatierungsgrades der GAG-Derivate auf die bFGF-Wechselwirkung mit FGFR1IIIc hin. Tetramere GAGs waren ebenfalls ausreichend, um die VEGF165- und bFGF-Rezeptorbindung zu stören. Mit zunehmendem Sulfatierungsgrad und Länge des Derivats wurde der Blockierungseffekt verstärkt. Die Interaktion von VEGF165 mit sHA3 und die anschließende Blockierung der VEGFR-2-Bindung führte zu einer verminderten Phosphorylierung von VEGFR-2. In einem 3D in vitro-Angiogenese-Assay zeigte sich darüber hinaus eine verminderte VEGF165- bzw. bFGF-vermittelte Sprossung von Endothelzell-Sphäroiden durch hochsulfatierte GAGs. Die Angiogenese wurde jedoch nicht vollständig inhibiert. Interessanterweise induzierten GAG-Derivate unabhängig von den untersuchten angiogenen Wachstumsfaktoren die Sprossung von Endothelzell-Sphäroiden. Es konnte gezeigt werden, dass VEGFR-2 nicht an der proangiogenen Wirkung von sulfatierten GAGs beteiligt ist, während die Blockierung von FGFR1 die proangiogene Wirkung von sCS3 und sHA3 hemmt. GAG-Derivate könnten FGFR1 direkt aktivieren, da in SPR-Experimenten gezeigt wurde, dass sie an den Rezeptor binden. Andererseits könnte der beobachtete Effekt auch auf eine erleichterte Rezeptordimerisierung mit einer anschließenden verstärkten Ligandenbindung oder die Wechselwirkung mit intrazellulären Targets nach GAG-Internalisierung zurückzuführen sein. Dies muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Die Ergebnisse weisen auf die Wichtigkeit der Reihenfolge der Bindungsereignisse hin, da die Bindung von GAG-Derivaten an Wachstumsfaktoren, Rezeptoren oder beide Komponenten zu unterschiedlichen zellulären Konsequenzen hinsichtlich der Signalgebung führt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass GAG-Derivate unterschiedliche molekulare Mechanismen nutzen, um zelluläre Prozesse direkt oder indirekt über die Bindung von Wachstumsfaktoren zu modulieren und tragen zu einem tieferen Verständnis ihrer Wirkungsweise bei. Dies könnte wiederum eine Abstimmung der Biomaterial-zusammensetzung auf patientenspezifische Bedürfnisse ermöglichen. GAG-haltige Bio-materialien sind vielversprechend für eine Verminderung TGF-β1-gesteuerter lokaler Hautfibrose, da sie die Bioaktivität von TGF-β1 reduzieren. In Bezug auf die inhibitorischen Effekte auf die VEGF165- und bFGF-Signaltransduktion könnten GAGs mit übermäßiger Angiogenese, die bei rheumatoider Arthritis und diabetischer Retinopathie auftritt, interferieren. Ob diese in vitro-Ergebnisse zur Steuerung der biologischen Aktivität von TGF-β1, VEGF165 und bFGF oder zur direkten Stimulation der Angiogenese unabhängig von Wachstumsfaktoren genutzt werden können, muss in vivo validiert werden. / Age-related pathologies, like chronic wounds and impaired fracture healing are a consequence of a longer life expectancy in our aging population and are associated with considerable clinical and socioeconomic burdens. To improve the wound healing capacity of patients, the development of new adaptive biomaterials to selectively control and promote bone and skin regeneration is essential. A promising approach for the design of such biomaterials incorporates elements of the extracellular matrix (ECM) that play a role in tissue regeneration. Glycosaminoglycans (GAGs) are major ECM components known to interact with important mediator proteins, thereby influencing their biological activity and subsequently cellular processes. However, native GAGs like heparan sulfate have a limited utility for biomedical applications due to their restricted availability, batch-to-batch variability and source-dependent biological activity. For this reason, chemically modified hyaluronan (HA) and chondroitin sulfate (CS) derivatives with defined properties regarding the carbohydrate backbone, the degree of sulfation and the sulfation pattern are preferable for studying their structure-function relationship in the interaction with mediator proteins and cells relevant to healing processes. The aim of the present study was to investigate how GAGs influence cellular processes - directly or indirectly by binding growth factors – and particularly how the sugar backbone as well as the sulfation degree and pattern of GAG derivatives influence the interaction and thus the biological activity of transforming growth factor (TGF)-β1, and the angiogenic mediators vascular endothelial growth factor (VEGF)165 and basic fibroblast growth factor (bFGF). Sulfated HA (sHA) and CS derivatives were reported to strongly interact with growth factors like bone morphogenetic proteins (BMP)-2/-4 and transforming growth factor (TGF)-β1. The bioactivity of the latter was impaired in the presence of highly sulfated HA (sHA3), the underlying mechanism of which is so far not fully elucidated. In the present thesis the interaction of all components of the TGF-β1:receptor complex with sHA was examined by surface plasmon resonance (SPR), showing that pre-incubation of TGF-β1 with sHA derivatives blocked the binding of TGF-β1 in particular to TGF-β receptor (TβR)-I, but also to TβR-II. In sequential SPR experiments that mimicked the in vivo TGF-β1:receptor complex formation more closely, however, recruitment of TβR-I to the TβR-II/TGF-β1 complex was significantly stronger if the complex contained sHA3. GAGs thus exert a dual blocking effect on TGF-β1:receptor complex formation, with the effects strongly depending on the order of binding events. The bioactivity of TGF-β1 in conjunction with sHA at the receptor level, which was investigated here for the first time, showed a decrease of phosphorylation for TβR-I and the TβR-I-regulated effector protein Smad2 in the presence of sHA3, indicating of the formation of an inactive signaling complex. Also analyzed was the structure-function relationship of HA and CS derivatives in their interaction with the most important angiogenic growth factors, namely vascular endothelial growth factor (VEGF)165 and basic fibroblast growth factor (bFGF). The aim was both to identify structural properties that contribute to an interaction and to determine the biological consequences of growth factor/GAG interaction. Both growth factors showed a sulfation-dependent interaction with GAG derivatives in SPR binding analysis. Unlike bFGF, VEGF165 also showed a clear preference for sHA compared to CS derivatives, indicating that the interaction with this growth factor is not only impacted by the degree of sulfation but also by the carbohydrate backbone of the GAG. sHA tetramers were sufficient to interact with VEGF165 and bFGF in SPR measurements. The position of sulfation appears to play an important role in the interaction with both angiogenic growth factors, as the binding strength of the sHA tetrasaccharide with no C6-sulfation of the N-acetylglucosamine (GlcNAc) was lower compared to a derivative exclusively sulfated at the C6 position. Interestingly, binding of tetrameric persulfated HA (psHA) was stronger compared to hexameric psHA, indicating that the tetrasaccharide is able to bind to additional regions of VEGF165 and bFGF. Binding of VEGF165 and bFGF to their respective receptors VEGF receptor (VEGFR)-2 and FGF receptor (FGFR) 1 decreased if the growth factors were pre-incubated with sulfated GAGs in SPR studies. For VEGF165, an influence of the carbohydrate backbone was visible again, since the inhibition of growth factor binding to VEGFR-2 by sHA derivatives was stronger than for CS derivatives with comparable degree of sulfation. For bFGF/FGFR1IIIc interaction, sulfation of the C6 position in GlcNAc of low-sulfated sHA had a stronger impact compared to the C4 sulfation in GlcNAc of CS, while blocking capacity of sCS3 and sHA3 was similar. This suggests a minor influence of the carbohydrate backbone on bFGF interaction with FGFR1IIIc in the presence of GAG derivatives, but a major influence of the overall degree of sulfation. Tetrameric GAGs were already sufficient to interfere with VEGF165 and bFGF receptor binding, but the blocking effect was enhanced with increasing sulfation and chain length of the derivative. The interaction of VEGF165 with sHA3 and the subsequent blocking of VEGFR-2 binding led to an impaired phosphorylation of VEGFR-2. Furthermore, the induction of endothelial cell spheroid sprouting mediated via VEGF165 or bFGF was diminished by high sulfated GAGs as displayed in a 3D in vitro angiogenesis assay. However, angiogenesis was not completely abolished. Interestingly, GAG derivatives induced the sprouting of endothelial cell spheroids independent of the studied angiogenic growth factors. It could be shown that VEGFR-2 is not involved in the pro-angiogenic action of sulfated GAGs, while FGFR1 appears to play a role as blocking it inhibited the pro-angiogenic effect of sCS3 and sHA3. GAG derivatives might directly activate FGFR1 as they bound to the receptor in SPR experiments, but the observed effect might also be due to facilitated receptor dimerization with a subsequent enhanced ligand binding, or to an interaction with intracellular targets after GAG internalization; this needs to be clarified in further experiments. Findings point to the importance of the order of binding events, as binding of GAG derivatives to growth factors, receptors or both leads to different cellular outcomes regarding signaling. Results of the present thesis show that GAG derivatives employ different molecular mechanisms to modulate cellular processes – both directly or indirectly via growth factor binding - and contribute to a deeper understanding of their mode of action, which might allow to tune the biomaterial composition to patient-specific needs. GAG-containing biomaterials are promising candidates to interfere with TGF-β1-driven local skin fibrosis, as they reduce the bioactivity of TGF-β1. Concerning the inhibitory effects on VEGF165 and bFGF signaling, an application of GAGs to interfere with the excessive angiogenesis, occurring in rheumatoid arthritis and diabetic retinopathy could be of interest. Whether these in vitro findings can be used to control the biological activity of TGF-β1, VEGF165 and bFGF or to directly stimulate angiogenesis independent of growth factors needs to be validated in vivo.

Ziel dieser Studie war es, Auswirkungen von subgingival applizierter Hyaluronsäure (Gengigel®) nach scaling and root planing (SRP) auf mikrobiologische Variablen bei Parodontitispatienten nachzuweisen. Dabei wurden die möglichen Zusammenhänge zwischen Ergebnissen der Bakterienspezies und zuvor ermittelten Ergebnissen klinischer Variablen untersucht. An der Untersuchung nahmen 20 Männer und 29 Frauen teil. Es erfolgte eine Randomisierung in zwei Gruppen, bestehend aus einer Testgruppe mit 23 und einer Kontrollgruppe mit 26 Probanden. Bei den Versuchteilnehmern wurde in zwei Sitzungen in einem 24-stündigen Abstand ein SRP mittels Hand- und Ultraschallinstrumenten durchgeführt. Am Ende des SRP wurde in der Testgruppe Gengigel prof® (mit 0,8% Hyaluronsäure) in die parodontalen Taschen eingebracht. Zusätzlich trugen die Probanden der Testgruppe während der folgenden 14 Tage zweimal täglich morgens und abends Gengigel® (0,2%) auf den Gingivarand auf. In der Kontrollgruppe erfolgte das übliche SRP ohne Verwendung von Gengigel®. Alle Probanden wurden zu Beginn der Untersuchung, nach drei und sechs Monaten aus parodontologischer Sicht untersucht. Des Weiteren wurden Proben der Sulkusflüssigkeit für eine spätere Analyse von zehn parodontopathogenen Keimen sowie der Peroxidase- und Granulozytenaktivität gewonnen. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Zunahme in der Kontrollgruppe (p=0,035) konnte beim Verlauf der Gesamtbakterienzahl für die Testgruppe keine Veränderung der Keimzahlen (p=0,737) beobachtet werden. In der Testgruppe wurde nach sechs Monaten für Campylobacter rectus, Treponema denticola und Aggregatibacter actinomycetemcomitans eine Reduktion der Keimbelastung festgestellt (p=0,05; p=0,043; p=0,066). Am Ende der Untersuchung waren in der Testgruppe keine Unterschiede in der bakteriellen Besiedlung unterschiedlich tiefer Taschen mehr nachweisbar (p=1). In der Testgruppe bestand eine stark signifikante Korrelation der Granulozytenaktivität mit der Zeit (r=0,443; p<0,0001) und mit der Gesamtbakterienzahl (r=0,336; p=0,009). Die Ergebnisse der Studie weisen auf einen wachstumshemmenden Effekt der Hyaluronsäure auf parodontopathogene Bakterien hin, welcher womöglich auf einer indirekten Interaktion mit dem Immunsystem basiert.

Bone fractures and pathologic conditions like chronic wounds significantly reduce the quality of life for the patients, which is especially dramatic in an elderly population with considerable multi-morbidity and lead to substantial socio-economic costs. To improve the wound healing capacity of these patients, new strategies for the design of novel multi-functional biomaterials are required: they should be able to decrease extensive pathologic tissue degradation and specifically control angiogenesis in damaged vascularized tissues like bone and skin. Glycosaminoglycans (GAGs) like hyaluronan (HA) and chondroitin sulfate (CS) as important extracellular matrix (ECM) components are involved in several biological processes such as matrix remodeling and growth factor signaling, either by directly influencing the cellular response or by interacting with mediator proteins. This could be useful in functionalizing biomaterials, but native sulfated GAGs (sGAGs) show a high batch-to-batch variability and are limited in their availability. Chemically modified HA and CS derivatives with much more defined characteristics regarding their carbohydrate backbone, sulfate group distribution and sulfation degree are favorable to study the structure-function relationship of GAGs in their interaction with mediator proteins and/or cells and this might be used to precisely modulate activity profiles to stimulate wound healing. By combining collagen type I as the main structural protein of the bone and skin ECM with these GAG derivatives, 2.5-dimensional (2.5D) and 3D artificial ECM (aECM) coatings and hydrogels were developed. These biomaterials as well as the respective GAG derivatives alone were compared to native GAGs and used to analyze how the sulfation degree, pattern and carbohydrate backbone of GAGs influence: i) the activity of tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (TIMP-3) and vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) as main regulators of ECM remodeling and angiogenesis, ii) the composition and characteristics of the developed 2.5D and 3D aECMs, iii) the enzymatic degradation of collagen-based aECMs and HA/collagen-based hydrogels, iv) the proliferation and functional morphology of endothelial cells. Surface plasmon resonance (SPR) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) binding studies revealed that sulfated HA (sHA) derivatives interact with TIMP-3 and VEGF-A in a sulfation-dependent manner. sHA showed an enhanced interplay with these proteins compared to native GAGs like heparin (HEP) or CS, suggesting a further impact of the carbohydrate backbone and sulfation pattern. sGAGs alone were weak modulators of the matrix metalloproteinase-1 and -2 (MMP-1 and -2) activity and did not interfere with the inhibitory potential of TIMP-3 against these proteinases during enzyme kinetic analyses. However, the formation of TIMP 3/GAG complexes reduced the binding of TIMP-3 to cluster II and IV of its endocytic receptor low-density lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP-1, mediates the up-take and degradation of TIMP-3 from the extracellular environment) in a sulfation- and GAG type-dependent manner. It is of note that the determined complex stabilities of TIMP-3 with cluster II and IV were almost identical indicating for the first time that both clusters contribute to the TIMP-3 binding. Competitive SPR experiments demonstrated that GAG polysaccharides interfere stronger with the TIMP 3/LRP-1 interplay than GAG oligosaccharides. The importance of the position of sulfation is highlighted by the finding that a sHA tetrasaccharide exclusively sulfated at the C6 position of the N-acetylglucosamine residues significantly blocked the receptor binding, while CS and HEP hexasaccharides had no detectable effects. Thus, sHA derivatives as part of biomaterials could be used to sequester and accumulate TIMP 3 in aECMs in a defined manner where sHA-bound TIMP-3 could decrease the matrix breakdown by potentially restoring the MMP/TIMP balance. GAG binding might extend the beneficial presence of TIMP-3 into wounds characterized by excessive pathologic tissue degradation (e.g. chronic wounds, osteoarthritis). Mediator protein interaction studies with sHA coated surfaces showed the simultaneous binding of TIMP-3 and VEGF-A, even though the sHA/VEGF-A interplay was preferred. Moreover, kinetic analysis revealed almost comparable affinities of both proteins for VEGF receptor-2 (VEGFR-2), explaining their competition that mainly regulates the activation of endothelial cells. Additional SPR measurements demonstrated that the binding of sGAGs to TIMP-3 or VEGF-A decreases the binding of the respective mediator protein to VEGFR-2. Likewise, a sulfation-dependent reduction of the binding signal was observed after pre-incubation of a mixture of TIMP-3 and VEGF-A with sGAG poly- and oligosaccharides. The biological consequences of GAGs interfering with VEGF-A/VEGFR-2 and TIMP-3/VEGFR 2 were assessed in vitro using porcine aortic endothelial cells stably transfected with VEGFR 2 (PAE/KDR cells). The presence of sHA both decreased VEGF-A activity and the activity of TIMP-3 to inhibit the VEGF-A-induced VEGFR-2 phosphorylation. The same decreased activities could be observed for the migration of endothelial cells. However, if sHA, TIMP-3 and VEGF-A were present simultaneously, sHA partially restored the TIMP-3-mediated blocking of VEGF-A activity. These findings provide novel insights into the regulatory potential of sHA during endothelial cell activation as an important aspect of angiogenesis, which could be translated into the design of biomaterials to treat abnormal angiogenesis. These sHA-containing materials might control the angiogenic response by modulating the activity of TIMP 3 and VEGF-A. The in vitro fibrillogenesis of collagen type I in the presence of sHA derivatives led to 2.5D collagen-based aECM coatings with stable collagen contents and GAG contents that resemble the organic part of the bone ECM. A burst release of GAGs was observed during the first hour of incubation in buffer with the GAG content remaining almost constant afterwards, implying that the number of GAG-binding sites of collagen restricts the amounts of associated GAGs. Moreover, two differently sulfated HA derivatives could for the first time be incorporated into one multi-GAG aECM as verified via agarose gel electrophoresis and fluorescence measurements. This illustrates the multiple options to modify the aECM composition and thereby potentially their functionality. Atomic force microscopy showed that the presence of sHA derivatives during fibrillogenesis significantly reduced the resulting fibril diameter in a concentration- and sulfation-dependent manner, indicating an interference of the GAGs with the self-assembly of collagen monomers. In line with enzyme kinetic results, none of the GAGs as part of aECMs altered the enzymatic collagen degradation via a bacterial collagenase. Thus aECMs were proven to be biodegradable independent from their composition, which is favorable concerning a potential biomedical usage of the aECMs e.g. as implant coatings. HA/collagen-based hydrogels containing fibrillar collagen embedded into a network of crosslinked HA and sGAGs were developed as 3D aECMs. Scanning electron microscopy demonstrated a porous structure of the gels after lyophilization, which could favor the cultivation of cells. The presence of collagen markedly enhanced the stability of the gels against the enzymatic degradation via hyaluronidase, something beneficial to clinical use as this is often limited by the generally fast breakdown of HA. Binding and release experiments with lysozyme, as positively charged model protein for e.g. pro-inflammatory cytokines, and VEGF A revealed that the sulfation of GAGs increased the protein binding capacity for pure GAG coatings and retarded the protein release from hydrogels compared to hydrogels without sGAGs. Moreover, the additional acrylation of sHA was shown to strongly reduce the interaction with both proteins when the primary hydroxyl groups were targets of acrylation. This stresses the influence of the substitution pattern on the protein binding properties of the GAG derivatives. However, hydrogel characteristics like the elastic modulus remained unaffected. The different interaction profiles of lysozyme and VEGF-A with GAGs demonstrated a protein-specific preference of different monosaccharide compositions, suggesting that the mediator protein binding could be simultaneously adjusted for several proteins by combining different GAG derivatives. This might allow the scavenging of pro-inflammatory cytokines and at the same time a binding and release of wound healing stimulating growth factors. Since there is a growing demand for biomaterials to regenerate injured vascularized tissues like bone and skin, endothelial cells were used to examine the direct effects of solute GAGs and hydrogels containing these GAGs in vitro. In both cases, sHA strongly enhanced the proliferation of PAE/KDR cells. A VEGFR-2-mediated effect of GAGs on endothelial cells as underlying mechanism is unlikely since GAGs alone did not bind to VEGFR-2 and had no influence on VEGFR-2 phosphorylation. Other factors like GAG-induced alterations of cell-matrix interactions and cell signaling could be responsible. In accordance with SPR results, a decreased endothelial cell proliferation stimulating activity of VEGF-A was observed in the presence of solute GAGs or after binding to hydrogels compared to the respective treatment without VEGF-A. However, tube formation could be observed in the presence of solute VEGF A and GAGs and within hydrogels with sGAGs that released sufficient VEGF-A amounts over time. Overall the presence of GAGs and VEGF-A strongly promoted the endothelial cell proliferation compared to the treatment with GAGs or VEGF-A alone. Thus, HA/collagen-based hydrogels functionalized with sHA derivatives offer a promising option for the design of “intelligent” biomaterials that direct and regulate the cellular behavior instead of simply acting as inert filling material. They could be used for the controlled delivery and/or scavenging of multiple mediator proteins, thus enhancing the local availability or reducing the activity of these GAG-interacting mediator proteins, or by directly influencing the cellular response. This might be applied to a range of pathological conditions by tuning the biomaterial compositions to patient-specific needs. However, extensive in vivo validation is required to show whether these in vitro findings could be used to control the biological activity of for instance TIMP-3 and VEGF-A, especially under the pathological conditions of extended matrix degradation and dysregulated angiogenesis.

Bone fractures and pathologic conditions like chronic wounds significantly reduce the quality of life for the patients, which is especially dramatic in an elderly population with considerable multi-morbidity and lead to substantial socio-economic costs. To improve the wound healing capacity of these patients, new strategies for the design of novel multi-functional biomaterials are required: they should be able to decrease extensive pathologic tissue degradation and specifically control angiogenesis in damaged vascularized tissues like bone and skin. Glycosaminoglycans (GAGs) like hyaluronan (HA) and chondroitin sulfate (CS) as important extracellular matrix (ECM) components are involved in several biological processes such as matrix remodeling and growth factor signaling, either by directly influencing the cellular response or by interacting with mediator proteins. This could be useful in functionalizing biomaterials, but native sulfated GAGs (sGAGs) show a high batch-to-batch variability and are limited in their availability. Chemically modified HA and CS derivatives with much more defined characteristics regarding their carbohydrate backbone, sulfate group distribution and sulfation degree are favorable to study the structure-function relationship of GAGs in their interaction with mediator proteins and/or cells and this might be used to precisely modulate activity profiles to stimulate wound healing. By combining collagen type I as the main structural protein of the bone and skin ECM with these GAG derivatives, 2.5-dimensional (2.5D) and 3D artificial ECM (aECM) coatings and hydrogels were developed. These biomaterials as well as the respective GAG derivatives alone were compared to native GAGs and used to analyze how the sulfation degree, pattern and carbohydrate backbone of GAGs influence: i) the activity of tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (TIMP-3) and vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) as main regulators of ECM remodeling and angiogenesis, ii) the composition and characteristics of the developed 2.5D and 3D aECMs, iii) the enzymatic degradation of collagen-based aECMs and HA/collagen-based hydrogels, iv) the proliferation and functional morphology of endothelial cells. Surface plasmon resonance (SPR) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) binding studies revealed that sulfated HA (sHA) derivatives interact with TIMP-3 and VEGF-A in a sulfation-dependent manner. sHA showed an enhanced interplay with these proteins compared to native GAGs like heparin (HEP) or CS, suggesting a further impact of the carbohydrate backbone and sulfation pattern. sGAGs alone were weak modulators of the matrix metalloproteinase-1 and -2 (MMP-1 and -2) activity and did not interfere with the inhibitory potential of TIMP-3 against these proteinases during enzyme kinetic analyses. However, the formation of TIMP 3/GAG complexes reduced the binding of TIMP-3 to cluster II and IV of its endocytic receptor low-density lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP-1, mediates the up-take and degradation of TIMP-3 from the extracellular environment) in a sulfation- and GAG type-dependent manner. It is of note that the determined complex stabilities of TIMP-3 with cluster II and IV were almost identical indicating for the first time that both clusters contribute to the TIMP-3 binding. Competitive SPR experiments demonstrated that GAG polysaccharides interfere stronger with the TIMP 3/LRP-1 interplay than GAG oligosaccharides. The importance of the position of sulfation is highlighted by the finding that a sHA tetrasaccharide exclusively sulfated at the C6 position of the N-acetylglucosamine residues significantly blocked the receptor binding, while CS and HEP hexasaccharides had no detectable effects. Thus, sHA derivatives as part of biomaterials could be used to sequester and accumulate TIMP 3 in aECMs in a defined manner where sHA-bound TIMP-3 could decrease the matrix breakdown by potentially restoring the MMP/TIMP balance. GAG binding might extend the beneficial presence of TIMP-3 into wounds characterized by excessive pathologic tissue degradation (e.g. chronic wounds, osteoarthritis). Mediator protein interaction studies with sHA coated surfaces showed the simultaneous binding of TIMP-3 and VEGF-A, even though the sHA/VEGF-A interplay was preferred. Moreover, kinetic analysis revealed almost comparable affinities of both proteins for VEGF receptor-2 (VEGFR-2), explaining their competition that mainly regulates the activation of endothelial cells. Additional SPR measurements demonstrated that the binding of sGAGs to TIMP-3 or VEGF-A decreases the binding of the respective mediator protein to VEGFR-2. Likewise, a sulfation-dependent reduction of the binding signal was observed after pre-incubation of a mixture of TIMP-3 and VEGF-A with sGAG poly- and oligosaccharides. The biological consequences of GAGs interfering with VEGF-A/VEGFR-2 and TIMP-3/VEGFR 2 were assessed in vitro using porcine aortic endothelial cells stably transfected with VEGFR 2 (PAE/KDR cells). The presence of sHA both decreased VEGF-A activity and the activity of TIMP-3 to inhibit the VEGF-A-induced VEGFR-2 phosphorylation. The same decreased activities could be observed for the migration of endothelial cells. However, if sHA, TIMP-3 and VEGF-A were present simultaneously, sHA partially restored the TIMP-3-mediated blocking of VEGF-A activity. These findings provide novel insights into the regulatory potential of sHA during endothelial cell activation as an important aspect of angiogenesis, which could be translated into the design of biomaterials to treat abnormal angiogenesis. These sHA-containing materials might control the angiogenic response by modulating the activity of TIMP 3 and VEGF-A. The in vitro fibrillogenesis of collagen type I in the presence of sHA derivatives led to 2.5D collagen-based aECM coatings with stable collagen contents and GAG contents that resemble the organic part of the bone ECM. A burst release of GAGs was observed during the first hour of incubation in buffer with the GAG content remaining almost constant afterwards, implying that the number of GAG-binding sites of collagen restricts the amounts of associated GAGs. Moreover, two differently sulfated HA derivatives could for the first time be incorporated into one multi-GAG aECM as verified via agarose gel electrophoresis and fluorescence measurements. This illustrates the multiple options to modify the aECM composition and thereby potentially their functionality. Atomic force microscopy showed that the presence of sHA derivatives during fibrillogenesis significantly reduced the resulting fibril diameter in a concentration- and sulfation-dependent manner, indicating an interference of the GAGs with the self-assembly of collagen monomers. In line with enzyme kinetic results, none of the GAGs as part of aECMs altered the enzymatic collagen degradation via a bacterial collagenase. Thus aECMs were proven to be biodegradable independent from their composition, which is favorable concerning a potential biomedical usage of the aECMs e.g. as implant coatings. HA/collagen-based hydrogels containing fibrillar collagen embedded into a network of crosslinked HA and sGAGs were developed as 3D aECMs. Scanning electron microscopy demonstrated a porous structure of the gels after lyophilization, which could favor the cultivation of cells. The presence of collagen markedly enhanced the stability of the gels against the enzymatic degradation via hyaluronidase, something beneficial to clinical use as this is often limited by the generally fast breakdown of HA. Binding and release experiments with lysozyme, as positively charged model protein for e.g. pro-inflammatory cytokines, and VEGF A revealed that the sulfation of GAGs increased the protein binding capacity for pure GAG coatings and retarded the protein release from hydrogels compared to hydrogels without sGAGs. Moreover, the additional acrylation of sHA was shown to strongly reduce the interaction with both proteins when the primary hydroxyl groups were targets of acrylation. This stresses the influence of the substitution pattern on the protein binding properties of the GAG derivatives. However, hydrogel characteristics like the elastic modulus remained unaffected. The different interaction profiles of lysozyme and VEGF-A with GAGs demonstrated a protein-specific preference of different monosaccharide compositions, suggesting that the mediator protein binding could be simultaneously adjusted for several proteins by combining different GAG derivatives. This might allow the scavenging of pro-inflammatory cytokines and at the same time a binding and release of wound healing stimulating growth factors. Since there is a growing demand for biomaterials to regenerate injured vascularized tissues like bone and skin, endothelial cells were used to examine the direct effects of solute GAGs and hydrogels containing these GAGs in vitro. In both cases, sHA strongly enhanced the proliferation of PAE/KDR cells. A VEGFR-2-mediated effect of GAGs on endothelial cells as underlying mechanism is unlikely since GAGs alone did not bind to VEGFR-2 and had no influence on VEGFR-2 phosphorylation. Other factors like GAG-induced alterations of cell-matrix interactions and cell signaling could be responsible. In accordance with SPR results, a decreased endothelial cell proliferation stimulating activity of VEGF-A was observed in the presence of solute GAGs or after binding to hydrogels compared to the respective treatment without VEGF-A. However, tube formation could be observed in the presence of solute VEGF A and GAGs and within hydrogels with sGAGs that released sufficient VEGF-A amounts over time. Overall the presence of GAGs and VEGF-A strongly promoted the endothelial cell proliferation compared to the treatment with GAGs or VEGF-A alone. Thus, HA/collagen-based hydrogels functionalized with sHA derivatives offer a promising option for the design of “intelligent” biomaterials that direct and regulate the cellular behavior instead of simply acting as inert filling material. They could be used for the controlled delivery and/or scavenging of multiple mediator proteins, thus enhancing the local availability or reducing the activity of these GAG-interacting mediator proteins, or by directly influencing the cellular response. This might be applied to a range of pathological conditions by tuning the biomaterial compositions to patient-specific needs. However, extensive in vivo validation is required to show whether these in vitro findings could be used to control the biological activity of for instance TIMP-3 and VEGF-A, especially under the pathological conditions of extended matrix degradation and dysregulated angiogenesis.

Establishing highly sophisticated polymer films for delivery systems in a biological environment and bioanalytical tasks, the formation, thickness, swelling behavior, and (physiological) stability of highly biocompatible polyelectrolyte multilayers (PEMs) are described. These PEMs are composed of the very weak polycation maltose-modified hyperbranched poly(ethyleneimine) (PEI-Mal), strongly polyanion heparin sodium salt (HE − Na +) or weakly charged polyanion hyaluronic acid sodium salt (HA-Na+) deposited on Si wafer substrates. Two different glyco architectures for PEI-Mal are used, characterized by two different degrees of maltose decoration on a PEI scaffold. Using three pH-dependent deposition approaches for optimizing the (physiological) PEM stability and swelling, PEMs are characterized by (in situ) ellipsometry, atomic force microscopy (AFM), and (in situ) attenuated total reflection-Fouriertransform infrared (ATR-FTIR). Thus, PEMs reveal significantly different thicknesses, growth mechanisms (linear versus exponential), and swelling behavior in dependence of both the polycation architectures and the deposition protocol. These PEMs will allow the study of their complexation and release properties as preswollen PEMs against anionic drug molecules, adenosine triphosphate sodium salt (ATP), especially under physiological conditions for future drug delivery coatings.

Beim Tissue Engineering ist die Vaskularisierung von größeren Zell-Matrix-Konstrukten nach Implantation bis heute ein großes Problem. Durch das initiale Fehlen eines mikrovaskulären Netzwerkes kommt es zu einem raschen Zellsterben im Scaffold. Aufgrund dessen war das Ziel dieser Arbeit, im Sinne des in situ-Tissue Engineering ein Scaffold auf Basis von mineralisiertem Kollagen zu entwickeln, welches mit dem angiogenen Wachstumsfaktor VEGF funktionalisiert wird, um den Prozess der Vaskularisierung – die Einsprossung von Blutgefäßen – zu fördern und gleichzeitig durch Chemoattraktion in vivo Zellen aus dem umliegenden Knochengewebe in das Innere des Scaffolds migrieren zu lassen, so dass eine beschleunigte Defektheilung erzielt wird. Poröse Scaffolds aus mineralisiertem Kollagen wurden durch zwei unterschiedliche Strategien funktionalisiert und durch in vitro-Testungen charakterisiert. Die erste Strategie umfasste die Heparin-Modifizierung der gesamten Scaffolds, während die zweite Strategie die Injizierung eines zentralen VEGF-haltiges Depots in das Scaffoldinnere darstellte. Neben der Charakterisierung der Scaffolds wurde die Freisetzungskinetik des Modellwachstumsfaktors VEGF aus den modifizierten Scaffolds untersucht und die biologische Aktivität des freigesetzten Faktors auf Endothelzellen getestet. Zusätzlich wurde bei der 2. Strategie, der Injizierung eines Wirkstoffdepots, die Ausbildung eines Wirkstoffgradienten und die zielgerichtete Migration von Endothelzellen in Richtung des Wirkstoffdepots analysiert.