No description available.

Conversion of <i>Campylobacter upsaliensis</i> to the nonculturable but viable coccoid form was characterized. Chloramphenicol did not prevent the conversion. Severe decreases in isocitrate dehydrogenase activity and oxygen uptake and extensive degradation of ribosomal RNA suggest that the coccoid form is a degenerative form rather than part of a life cycle. The autolysins of spiral and coccoid forms of <i>C. upsaliensis</i> were also studied. Autolytic activity in the soluble and sediment fractions of sonicates of the spiral and the coccoid form of <i>C. upsaliensis</i> could not be demonstrated by native (nondenaturing) PAGE. Autolysins were detected, however, by using denaturing SDS-PAGE gels containing either purified <i>E. coli </i> peptidoglycan or whole cells of <i>Micrococcus luteus</i> as the turbid substrate, with subsequent renaturation by treatment with Triton X-100 buffer. In renaturing gels that contained <i>E. coli</i> peptidoglycan, 14 autolytic bands were detected ranging from 200 kDa to 12 kDa. In similar gels containing whole cells of <i>M. luteus</i> , only a single band appeared having a molecular weight of 34 kDa. This band corresponded to one of the bands present in the gels containing <i>E. coli </i> peptidoglycan. This common autolysin was isolated by adsorbing it from <i>C. upsaliensis</i> lysates onto <i>M. luteus</i> cells and then subjecting these cells to renaturing SDS-PAGE in gels containing <i>E. coli</i> peptidoglycan. The 34 kDa autolysin differed from a single 51 kDa autolysin unique to the <i>M. luteus cells</i>. The 34 kDa autolysin was isolated from an SDS-PAGE gel and was pure when tested by isoelectric focusing. The N-terminal amino acid sequence analysis showed the first 15 amino acids of the 34 kDa autolysin to have 67% identity with a part of antigenic protein PEB4 of <i>Campylobacter jejuni</i>. The purified autolysin was used to immunize rabbits and the antibodies produced precipitated autolytic activity from cell lysates. The specificity of the antibodies was shown by Western blotting: only a single specific band occurred, with a molecular weight of 34 kDa, and thus it seems unlikely that the 34 kDa autolysin was derived from any of the other autolysins that were detected. / Ph. D.

L'étude de la ramification chez le pois, à partir des mutants hyper-ramifiés ramosus (rms) a permis de mettre en évidence l'existence d'une nouvelle famille d'hormones végétales : les strigolactones, inhibant la ramification des plantes à graines. La découverte de cette hormone végétale ouvre de nouvelles pistes de recherche sur la biosynthèse et la perception de cette nouvelle hormone. Nous avons montré le rôle du gène PsBRC1, codant un facteur de transcription de type TCP et homologue du gène TEOSINTE BRANCHED1 du maïs, dans la voie de signalisation des strigolactones. L’étude de ce gène nous a permis d'avoir une meilleure compréhension de l’interaction entre strigolactones et cytokinines dans le contrôle de la ramification, de la dynamique de la levée de dormance des bourgeons axillaires, et d'effectuer les premières études de relations structure-activité des strigolactones sur l’inhibition de la ramification chez le pois.Nous avons étudié et caractérisé d'autres éléments dans la voie de signalisation. Chez le pois, deux mutants, autres que Psbrc1, ne répondent pas à l’application de strigolactones, rms3 et rms4. Le gène RMS4 code pour une protéine à boîte F. Nous nous sommes focalisés ici sur le mutant hyper-ramifié rms3. Nous avons montré que RMS3 est l'homologue du gène D14 du riz, codant pour une protéine de la superfamille des α-β/hydrolases. Ces protéines peuvent avoir une activité enzymatique et ainsi pourraient modifier les strigolactones en un composé actif. Le récepteur des gibbérellines GID1 appartient aussi à cette famille, RMS3 est donc un bon candidat pour être le récepteur des strigolactones. Nous avons utilisé une strigolactone radiomarquée afin d’étudier le métabolisme de l'hormone. Nous avons découvert que la strigolactone synthétique, 3H-GR24 est clivée en un composé inconnu au contact des racines, indépendamment de l'activité de la protéine RMS3. Ce composé de structure inconnue se retrouve aussi dans la sève du xylème alors que 3H-GR24 y est absent.Outre un phénotype hyperbranché les mutants rms présentent une diminution de la taille de leurs entre-nœuds, qui n'est pas due à l’augmentation de la ramification. Nous avons étudié l'origine du nanisme des mutants déficients en strigolactones et affectés dans la réponse à l’hormone. Des approches génétiques et moléculaires ont été utilisées pour tester une interaction possible entre les strigolactones et les gibbérellines. Nous avons montré que les strigolactones régulaient l’élongation des entre-nœuds indépendamment des gibbérellines.Le pois est un excellent modèle en génétique et en physiologie. Avec le développement de nouvelles techniques à l'INRA (TILLING; UNIGENE : ensemble de plus de 40000 séquences exprimées de pois), nous avons pu identifier de nouveaux gènes de biosynthèse des strigolactones chez le pois et obtenir plusieurs nouveaux mutants de pois. Ces mutants seront essentiels pour les futures études du laboratoire et pourront permettre d'identifier de nouveaux intermédiaires dans la biosynthèse et le métabolisme des strigolactones. / The study of shoot branching in pea, using the high branching ramosus (rms) mutants has highlighted the existence of a new family of plant hormones: the strigolactones, inhibiting shoot branching in seed plants. The discovery of this novel plant hormone opens novel research areas in the deciphering of strigolactone biosynthesis and strigolactone perception. We have shown the role of the pea TCP transcription factor, PsBRC1, the homolog of the maize TEOSINTE BRANCHED (TB1) in strigolactone signaling. The PsBRC1 gene was shown to have a role in integrating strigolactone and cytokinin pathways, and allowed to have a better understanding of the dynamics of bud outgrowth, and to perform the first strigolactone Structure-Activity Relationship studies for branching inhibition in pea. We investigated and characterized other elements in the signaling pathway, including the strigolactone receptor. In pea, two mutants, other than Psbrc1, do not respond to the application of strigolactones, rms3 and rms4. The RMS4 gene encodes an F-BOX protein and here we focused on the high branching rms3 pea mutant. We have shown that RMS3 is the homolog of the rice D14 gene encoding a protein of the α-β/hydrolase superfamily. Consequently RMS3 may have an enzymatic activity to modify strigolactone into an active compound. The gibberellin receptor GID1 also belongs to this family, therefore RMS3 is also a good candidate for the strigolactone receptor. We used a radiolabeled synthetic strigolactone, 3H-GR24, to investigate the metabolism of the hormone. We discovered that the synthetic strigolactone, 3H-GR24 is cleaved in an unknown compound in the root media independently of RMS3 activity, compound which is also found in the xylem sap in contrast to 3H-GR24. The rms mutants exhibit not only a high branching phenotype but also a reduced height which is not due to this high branching. We investigated the origin of the dwarfism of strigolactone-deficient and response mutants in pea. Genetic and molecular approaches have been used to test a possible interaction between strigolactones and gibberellins. We have shown that strigolactones regulate stem elongation independently of gibberellin. Pea is a powerful model plant for genetics and physiology. With the development of new facilities at INRA (TILLING; UNIGENE set of more than 40000 expressed sequences), we were able to identify new biosynthesis genes in pea and to obtain several novel pea mutants. These mutants will be essential for future studies of the laboratory in particular to identify new intermediates in strigolactone biosynthesis and metabolism.

Giardia duodenalis est le protozoaire responsable de la giardiose, la parasitose intestinale la plus répandue dans le monde. Cette infection se caractérise par une malabsorption intestinale, des diarrhées, une perte de poids et des douleurs abdominales intenses chez l’Homme et de nombreux mammifères. Par ailleurs, cette maladie dont l’impact en santé publique et vétérinaire est reconnu, peut entraîner d’importantes déficiences nutritionnelles en particulier chez les sujets jeunes. L’infection est causée par l’ingestion de kystes de Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) présents dans les aliments ou l’eau contaminée. Infectieux à très faibles doses, ces kystes survivent pendant plusieurs semaines dans l’environnement et sont résistants aux différents désinfectants. Suite au dékystement, la forme végétative de Giardia, le trophozoïte, adhère à l’épithélium intestinal au niveau des parties supérieures de l’intestin grêle et se multiplie, causant les symptômes. Cette phase se termine par un nouvel enkystement et l’excrétion de kystes par les fèces. Le nombre croissant d’infections liées à la contamination de l’eau potable, à l’émergence de souches résistantes aux médicaments disponibles, à la fréquence des échecs thérapeutiques et à l’importance des effets secondaires associés aux traitements font de cette maladie un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Il est désormais bien établi que le microbiote et/ou certaines souches de bactéries probiotiques ont un impact bénéfique dans la giardiose. En particulier, la bactérie probiotique Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) a un rôle protecteur contre la croissance de Giardia in vitro et in vivo. Nous avons cherché dans ce travail de Thèse à décrypter les mécanismes moléculaires associés à l’effet inhibiteur des facteurs sécrétés par LjLa1. Nous avons montré qu’in vitro, LjLa1 agissait en libérant des enzymes de type Bile Salt Hydrolases (BSH) qui modifient alors des composants de la bile non-toxiques pour le parasite (sels biliaires conjugués) en des composants toxiques (sels biliaires déconjugués). Les 3 gènes BSH codés dans le génome de LjLa1 ont été clonés chez Escherichia coli et les protéines taguées histidine purifiées pour étudier leurs propriétés biochimiques et biologiques. Obtenues sous forme active, nous avons pu en définir les spécificités de substrats et montrer qu’elles sont capables d’inhiber significativement la croissance de G. duodenalis in vitro et in vivo, dans un modèle murin de la giardiose (souriceaux OF1 non sevrés). En parallèle, nous avons identifié, à l’issue d’un large criblage de souches de lactobacilles selon leur activité anti-Giardia in vitro, une souche probiotique aux effets inhibiteurs comparables à ceux de LjLa1 : Lactobacillus gasseri CNCM-4884. Administrée in vivo dans le modèle murin de la giardiose, cette souche a réduit de 93% la charge parasitaire dans l'intestin grêle des nouveaux nés et a également réduit de façon significative le nombre de kystes libérés dans l’environnement, permettant ainsi de réduire la transmission de Giardia. Des travaux parallèles ont été réalisés au cours de ce projet de Thèse, notamment le développement d’outils de moléculaire pour l’expression hétérologue de molécules d’intérêt en santé animale chez divers lactobacilles. Le développement de ces « vecteurs mucosaux » permettra à terme de proposer une stratégie de surexpression de BSH par les lactobacilles afin d’accroitre l’activité BSH in vivo, et renforcer ainsi l’élimination du parasite. Ces résultats permettent de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques originales contre les giardioses humaines et animales, basées sur l’utilisation de lactobacilles probiotiques ou sur les activités BSH qui en sont dérivées. Ces traitements offrent alors une alternative sérieuse aux antibiotiques et permettront de pallier aux actuels fréquents échecs thérapeutiques. / Giardia duodenalis is a protozoan parasite responsible for giardiasis, the most common intestinal parasitic disease worldwide. This infection is characterized by intestinal malabsorption, diarrhea, weight loss and abdominal pain in humans and various mammalian species. Besides, this disease has a high veterinary and public health impact, leading to important nutritional deficiencies in young subjects. The infection is caused by the ingestion of food or water contaminated with infectious cysts of the parasite. Giardia cysts can survive for several weeks in the environment and are highly resistant to disinfectants. Giardia excysts in the intestinal tracts of its host and replicates under the trophozoite stage causing the symptoms. Trophozoites adhere to the intestinal epithelium of the small intestine and multiply, causing the symptoms. The cycle ends by a new encystment and infectious cysts are released in environments with feces. The increasing number of giardiasis cases, mainly due to water contaminations, the emergence of parasite strains resistant to drugs and therapeutic failures, make research on alternative therapeutic strategies and treatments highly needed. Nowadays, it is well known that the microbiota and probiotics play an important role in protection against this parasite. For instance, the probiotic strain Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) prevents the establishment of Giardia in vitro and in vivo. In this thesis, we have tried to point out the molecular mechanism(s) involved in this inhibitory effect(s). We showed in vitro that LjLa1 was releasing "Bile Salt Hydrolases" (BSH) – like activities that modify some components of bile (conjugated bile salts) into toxic compounds (deconjugated bile salts) for Giardia. We have cloned and expressed each of the three bsh genes present in the genome of LjLa1 in Escherichia coli in order to study their enzymatic and biological properties. Two BSH were obtained as recombinant active enzymes and biochemical tests showed that they have distinct substrate specificities despite similar predicted 3D structures. Moreover, these two BSHs of LjLa1 exhibited anti-giardial effects in vitro and in vivo in a murine model of the giardiasis (OF1suckling mice), comforting the hypothesis of the biological role of active BSH, derived from probiotics, against Giardia. A wide collection of diverse lactobacilli strains was screened to assess their effectiveness to also display both anti-giardial and BSH activities. This screening allowed the identification of several strains exhibiting strong anti-giardial effects such as Lactobacillus gasseri CNCM I-4884. In a murine model of giardiasis, this strain dramatically reduced the parasite burden in the small intestine of treated animals and significantly reduced the number of cysts in the colon, which could contribute to blockage of parasite transmission in environments. Additional studies were realized in parallel in order to explore the potency of lactobacilli to exert beneficial effects on health. For this, molecular tools were successfully developed in various lactobacilli strains to express and deliver therapeutic molecules at mucosal surfaces. The development of these tools will further allow the overexpression of BSH by lactobacilli to increase their in vivo BSH-activity and strengthen the elimination of the parasite. Altogether, this thesis work proposes new original therapeutic strategies against human and animal giardiasis, based on the use of BSH-positive lactobacilli strains or recombinant BSH- derived from probiotic strains, to counteract the frequent therapeutic failures, offering a serious alternative to antibiotics.

Thermomonospora curvata is a thermophilic actinomycete hylogenetically related to Thermobifida fusca that produces extracellular hydrolases capable of degrading synthetic polyesters. Analysis of the genome of T. curvata DSM43183 revealed two genes coding for putative polyester hydrolases Tcur1278 and Tcur0390 sharing 61% sequence identity with the T. fusca enzymes. Mature proteins of Tcur1278 and Tcur0390 were cloned and expressed in Escherichia coli TOP10. Tcur1278 and Tcur0390 exhibited an optimal reaction temperature against p-nitrophenyl butyrate at 60°C and 55°C, respectively. The optimal pH for both enzymes was determined at pH 8.5. Tcur1278 retained more than 80% and Tcur0390 less than 10% of their initial activity following incubation for 60 min at 55°C. Tcur0390 showed a higher hydrolytic activity against poly(ε-caprolactone) and polyethylene terephthalate (PET) nanoparticles compared to Tcur1278 at reaction temperatures up to 50°C. At 55°C and 60°C, hydrolytic activity against PET nanoparticles was only detected with Tcur1278. In silico modeling of the polyester hydrolases and docking with a model substrate composed of two repeating units of PET revealed the typical fold of α/β serine hydrolases with an exposed catalytic triad. Molecular dynamics simulations confirmed the superior thermal stability of Tcur1278 considered as the main reason for its higher hydrolytic activity on PET.

Peu d’enzymes de synthèse de composés odorants sont connues chez le genre Rosa. Ce travail de thèse a permis l’identification de quelques-unes de ces protéines grâce à la technologie des puces à ADN, à l’analyse de l’expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel (qPCR) et à l’analyse des parfums par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Une puce confrontant les ADNc d’une rose parfumée à ceux d’une rose non parfumée a permis de corréler l’expression d’un gène, codant pour une Nudix hydrolase, très fortement exprimé dans la rose parfumée, avec la présence des monoterpènes dans le parfum de nombreux cultivars de rosiers. La caractérisation d’un rosier dont l’expression de ce gène est fortement réduite par ARN interférants, a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans la synthèse des monoterpènes. La phénylacétaldéhyde synthase (PAAS) est une autre enzyme participant à la synthèse du parfum. Trois allèles de cette protéine ont précédemment été mis en évidence. Les résultats de qPCR et de CPG dans une population hybride ont permis de montrer que l’allèle a1 est le seul à pouvoir induire la synthèse et l’émission de 2-phényléthanol. Les activités respectives des différentes isoformes ont été testées in vitro chez la levure et in planta dans des feuilles de tabac et des cals de rosier : ces expériences montrent que les trois isoformes ont des activités comparables. L’absence de synthèse de 2-phényméthanol chez les plantes présentant les isoformes a2 et a3 réside donc dans la très faible expression de leurs allèles, induisant probablement une faible concentration de l’isoforme dans les cellules / Very few enzymes responsible for the biosynthesis of scent compounds in the genus Rosa are known so far. This PhD thesis aims to identify some of these proteins with DNA microarray technology, gene expression analysis by real-time quantitative PCR (qPCR) and scent analysis by gas chromatography (GC). An array comparing cDNA from a scented rose to those of a non-scented one, showed a correlation between expression of a yet-unknown gene, encoding a Nudix hydrolase, highly expressed in the scented rose, and the presence of monoterpenes in the scent of many rose cultivars. Characterization of a rose cultivar, in which expression of this gene has been decreased by RNA interference, confirmed its role in monoterpene synthesis. The phenylacetaldehyde synthase (PAAS) is another enzyme implicated in scent biosynthesis. Three alleles of this protein had been previously described. qPCR and GC experiments in a hybrid population showed that the a1 allele is the only one able to induce 2-phenylethanol biosynthesis. The respective activities of the different isoforms were tested in vitro in yeast, and in planta in tobacco leaves and rose calli: these experiments showed that the three isoforms have comparable activities. The lack of 2-phenylethanol production in plants having a2 and a3 isoforms is thus due to the very low expression of their respective alleles, probably inducing very low isoform concentration in cells

L’époxyde hydrolase soluble (sEH) est une enzyme ubiquitaire, bifonctionnelle, codée par le gène EPHX2. La partie hydrolase (sEH-H) est responsable de la dégradation de facteurs endothéliaux vasodilatateurs, les acides époxyeicosatriénoïques (EETs), alors que la partie phosphatase (sEH-P) est impliquée dans le métabolisme des acides lysophosphatidiques (LPAs).L’objectif de ce travail a été de développer des outils méthodologiques permettant d'évaluer le rôle de la sEH dans la physiopathologie des maladies cardiovasculaires.Nous avons développé une méthode de quantification par CLHP-MS² des EETs et de leurs métabolites, les acides dihydroxyeicosatrienoic acids (DHETs). L'application de cette méthode montre que la dysfonction endothéliale des patients atteints d’hypertension artérielle et de diabète de type 2 est associée à une diminution de la libération locale des EETs lors de l'augmentation du débit sanguin, notamment liée à une augmentation d’activité de la sEH-H. L’inhibition pharmacologique de la sEH-H a permis de diminuer l’inflammation et l’atteinte glomérulaire dans un modèle murin d’insulino-résistance. De plus, l’étude des polymorphismes génétiques du gène EPHX2, codant la sEH, a permis de démontrer que la fonction sEH-H joue probablement un rôle important dans le contrôle de la fonction rénale et vasculaire des patients transplantés rénaux. Enfin, les résultats expérimentaux obtenus dans un modèle d’inactivation génétique de la sEH-P et l'étude des polymorphismes génétiques d'EPHX2 chez les patients insuffisants cardiaques suggèrent un rôle important de cette partie dans la régulation du métabolisme des lipides ainsi que dans le contrôle de l’homéostasie cardiovasculaire.Ainsi, les résultats obtenus au cours de ce travail soutiennent l’intérêt de développer des inhibiteurs pharmacologiques de la sEH-H pour traiter les maladies cardiovasculaires, rénales et métaboliques chez l’homme et suggèrent que la modulation de la sEH-P pourrait également constituer une nouvelle cible d'intérêt dans la prise en charge de ces pathologies. / Soluble epoxide hydrolase (sEH) is an ubiquitous bifunctional enzyme that is encoded by the EPHX2 gene. The hydrolase activity (sEH-H) is responsible for the conversion of the endothelial vasodilator epoxyeicosatrienoic acids whereas the phosphatase activity (sEH-P) is involved in the metabolism of lysophosphatidic acids (LPAs).The aim of this work was to develop chromatographic methods and molecular biology techniques to evaluate sEH activities in cardiovascular diseases.We developed a LC-MS/MS method to quantify EETs and their metabolites, the dihydroxyeicosatrienoic acids (DHETs). Using this method, we showed that the endothelial dysfunction of hypertensive and type 2 diabetic patients is associated with a decrease in the local production of EETs during flow increase notably due to increased sEH-H activity. In a murine model of insulin resistance, pharmacological inhibition of sEH-H improved renal function by decreasing inflammation, oxidative stress and glomerular lesions. Moreover, genetic investigations of EPHX2 revealed that sEH-H may play a substantial role in the control of renal and vascular function in kidney recipients. Finally, experimental results obtained in knock-in sEH-P deficient rats and genetics findings in patients with heart failure strongly suggest that sEH-P is involved in lipid metabolism and cardiovascular homeostasis.Taken together, these results strengthen the interest of developing pharmacological inhibitors of sEH-H to be tested in patients with cardiovascular, renal or metabolic diseases and suggest that the modulation of sEH-P represents a new therapeutic target to treat these pathologies.

De par leur diversité de mécanismes de déterminisme du sexe et de chromosomes sexuels, les poissons téléostéens représentent d’excellents modèles pour mieux comprendre les bases moléculaires et évolutives du contrôle du développement sexuel chez les vertébrés. Grâce à l’analyse de chromosomes artificiels bactériens couvrant les chromosomes sexuels du platy Xiphophorus maculatus, trois copies d’un nouveau gène nommé teximY ont été découvertes dans la région de déterminisme du sexe du chromosome Y mais pas du chromosome X. Un gène texim1 très apparenté à teximY ainsi que trois gènes plus divergents ont été identifiés sur les autosomes. Les gènes teximY sont préférentiellement exprimés dans les testicules, au niveau des cellules germinales lors des étapes tardives de la spermatogénèse, alors que texim1 est également transcrit dans les gonades femelles. Des gènes texim ont été détectés chez d'autres poissons téléostéens mais pas chez le poisson-zèbre, ainsi que chez des céphalocordés, des urocordés et des échinodermes mais pas chez les tétrapodes. Les gènes texim codent pour des estérases putatives à domaine SGNH apparentées à des protéines cellulaires procaryotes et eucaryotes ou codées par des retrotransposons animaux. Les gènes texim sont associés à des transposons Helitron chez les poissons mais pas chez les autres animaux, suggérant capture et mobilisation du gène ancestral texim par un transposon à la base de la radiation des téléostéens. TeximY pourrait jouer un rôle dans la transposition du transposon Helitron dans la lignée germinale mâle, ou correspondre à un gène de spermatogenèse mobilisé par le transposon Helitron sur les nouveaux chromosomes sexuels de poissons. / The molecular and evolutionary basis of sex determination in vertebrates needs to be unveiled via comparison of different systems. Fish exhibit hypervariability of sex determination mechanisms. Thanks to the analysis of the Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library covering the sex chromosomes of the platyfish Xiphophorus maculatus (Rio Jamapa population, XX /XY), three copies of a new gene have been identified in the sex-determining region of the Y but not the X chromosome, and named teximY. Four autosomal counterparts of teximY have been also detected in the genome of the platyfish with one of them, texim1 presenting 95% of cDNA sequence identity with the Y-linked copies. RT-qPCR expression analyses have been performed for each copy in male and female tissues. Two Y-linked teximY copies were preferentially expressed in testis, whereas the autosomal copy texim1 showed preferential expression in male and female gonads. In situ hybridizations with a teximY/1 probe revealed expression in late spermatids and spermatozeugmata. Texim sequences were detected in several fish species, but not in zebrafish, as well as in cephalochordates, urochordates and sea echinoderms but not in tetrapods. Predicted Texim proteins are related to proteins from different origins. Interestingly, texim genes are associated with a Helitron transposon in fish but neither in cephalochordates nor in echinoderms, suggesting capture and mobilization of an ancestral texim gene at the base of the bony fish lineage. TeximY proteins may play a role in Helitron transposition in the male germ line in fish, or texim genes are spermatogenesis genes mobilized and spread by transposable elements in fish genomes.

The enzymatic degradation of polyethylene terephthalate (PET) occurs at mild reaction conditions and may find applications in environmentally friendly plastic waste recycling processes. The hydrolytic activity of the homologous polyester hydrolases LC cutinase (LCC) from a compost metagenome and TfCut2 from Thermobifida fusca KW3 against PET films was strongly influenced by the reaction medium buffers tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris), 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS), and sodium phosphate. LCC showed the highest initial hydrolysis rate of PET films in 0.2 M Tris, while the rate of TfCut2 was 2.1-fold lower at this buffer concentration. At a Tris concentration of 1 M, the hydrolysis rate of LCC decreased by more than 90% and of TfCut2 by about 80%. In 0.2 M MOPS or sodium phosphate buffer, no significant differences in the maximum initial hydrolysis rates of PET films by both enzymes were detected. When the concentration of MOPS was increased to 1 M, the hydrolysis rate of LCC decreased by about 90%. The activity of TfCut2 remained low compared to the increasing hydrolysis rates observed at higher concentrations of sodium phosphate buffer. In contrast, the activity of LCC did not change at different concentrations of this buffer. An inhibition study suggested a competitive inhibition of TfCut2 and LCC by Tris and MOPS. Molecular docking showed that Tris and MOPS interfered with the binding of the polymeric substrate in a groove located at the protein surface. A comparison of the Ki values and the average binding energies indicated MOPS as the stronger inhibitor of the both enzymes.

Comprendre comment les mutations impactent l’activité d’une protéine reste un défi dans le domaine des sciences protéiques. Les méthodes biochimiques traditionnellement utilisées pour résoudre ce type de questionnement sont très puissantes mais sont laborieuses à mettre en œuvre. Des approches bioinformatiques ont été développées à cet égard pour surmonter ces contraintes. Dans cette thèse, nous explorons l'utilisation d'approches bioinformatiques pour comprendre le lien entre mutations et changements d'activité. Notre modèle d'étude est une enzyme bactérienne, la sucrose phosphorylase de Bifidobacterium adolescentis (BaSP). Cette glycosyl-hydrolase de la famille 13 (GH13) suscite l’intérêt de l'industrie en raison de sa capacité à synthétiser des disaccharides et des glycoconjugués originaux. Son activité consiste à transférer un glucose d'un donneur, le saccharose, à un accepteur qui peut être un monosaccharide ou un aglycone hydroxylé. La réaction enzymatique se déroule selon un mécanisme dit « double déplacement avec rétention de configuration », ce qui nécessite la formation d'un intermédiaire covalent dit glucosyl-enzyme. Cependant, la possibilité de contrôler la régiosélectivité de ce transfert pour qu'il soit applicable au niveau industriel est un enjeumajeur. Cette thèse vise d’une part, à fournir une explication rationnelle quant aux modifications de la régiosélectivité de BaSP apportées par des mutations et d’autre part à proposer un canevas pour le contrôle de la régiosélectivité de couplage en vue de la synthèse de disaccharides pré-biotiques rares comme le kojibiose et le nigerose. Dans notre approche, nous avons émis l'hypothèse que les orientations préférées de l'accepteur dans le site catalytique après formation du glycosyl-enzyme déterminent la régiosélectivité de l'enzyme. Nous avons utilisé des approches computationnelles pour étudier l'impact des mutations sur la liaison de l'accepteur à l'intermédiaire covalent, le glucosylenzyme. À cette fin, nous avons construit des modèles à l’échelle atomique du glucosyl-enzyme pour un ensemble de variants de la BaSP pour lesquels des données expérimentales étaient disponibles. Pour y parvenir, nous avons paramétré le glucosyl-aspartyle en tant que nouveau résidu et les avons intégré dans des outils de modélisation tels que Modeller et Gromacs. Nous avons évalué la pertinence de ces paramètres et les avons ensuite appliqués à la vérification de notre hypothèse de travail par le biais d’expériences d'ancrage moléculaire. La méthodologie utilisée dans ce travail ouvre la perspective de l'utilisation d'approches bioinformatiques pour l'ingénierie de la régiosélectivité de la sucrose phosphorylase et plus généralement des glycosylhydrolases possédant un mécanisme similaire. À cet égard, un pipeline de modélisation moléculaire et d'amarrage de molécules accepteurs sur des intermédiaires covalents des enzymes de cette famille (ENZO pour Optimisation d’ENZyme) a été développé au cours de cette thèse. Son application à l’ingénierie d’autres variants de BaSP est en cours. / In this thesis, we explore the usage of computational approaches for understanding the link between mutations and changes in protein activity. Our study model is a bacterial sucrose phosphorylase enzyme from Bifidobacterium adolescentis (BaSP). This glycosyl hydrolase from family 13 (GH13) has been a focus in the industry due to its ability to synthesize original disaccharides and glycoconjugates. In fact, its activity is to transfer a glucose moiety from a donor sucrose to an acceptor which can be a monosaccharide or a hydroxylated aglycone. The enzymatic reaction proceeds by a double displacement with retention of configuration mechanism whereby a covalent glucosyl-enzyme intermediate is formed. However, it is at stake to control the regioselectivity of this transfer for it to be applicable at industrial level. This thesis aimed at providing a rational explanation for the observed impact of mutations on the regioselectivity of BaSP in view of controlling the synthesis of rare pre-biotic disaccharides like kojibiose and nigerose. We hypothesized that the preferred orientations of the acceptor determines the regioselectivity of the enzyme. In that respect, we used computational approaches to investigate the impact of mutations on the binding of the acceptor to the glucosyl-enzyme intermediate. The methodology used in this work opens the perspective of using computational approaches for engineering the regioselectivity of of glycosyl hydrolases with similar mechanism.