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Les projets présentés dans cet ouvrage ont été le fruit d'une collaboration universitéindustrie auquelle ont participé activement le laboratoire du Professeur Robert Chênevert du département de chimie de l'Université Laval ainsi que la compagnie OmegaChem Inc. Cette dernière se spécialise dans la synthèse et la distribution de produits de chimie fine dont les dérivés fluorés de la proline mais elle exploite également un volet de synthèse sur demande pour la recherche pharmaceutique actuelle. Les travaux réalisés se subdivisent en trois projets principaux dont: la synthèse énantiosélective de dérivés de l' a-méthylsérinol, la synthèse énantiosélective de pyrrolidines 2,5-disubstituées et de pipéridines 2,6-disubstituées ainsi que la synthèse énantiosélective d 'hydroxyprolines. Le premier projet consistait à développer des dérivés chiraux de l' a-méthylsérinol par voie de synthèse chimio-enzymatique. Les dérivés du N, O-isopropylidène-améthylsérinol chiraux sont des synthons qui peuvent faire partie d'une multitude de synthèses énantiosélectives due à leur polyfonctionnalisation. Ces intermédiaires de synthèse présentent donc un potentiel de commercialisation qui ne demande qu'à être exploré. Le second projet consistait à développer des pyrrolidines 2,5-disubstituées chirales ainsi que des pipéridines 2,6-disubstituées également par voie de synthèse chimioenzymatique. Ces hétérocycles azotés ont un potentiel commercial relié à leur utilité dans la synthèse de composés bioactifs pharmaceutiques. Dans le dernier projet, l'objectif était de développer des dérivés de la 3- hydroxyproline chiraux par voie biocatalytique grâce à l'utilisation combinée d'enzymes et de levures. La spécialisation de la compagnie OmegaChem Inc. dans le développement de dérivés de la proline justifiait l'exploration de voies de synthèses biocatalytiques des dérivées de la proline à des fins commerciales.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

1.Adult specimens of Ascaris lumbricoides of similar weights were incubated under nitrogen for 24 hours in a synthetic medium with 1 mM 2,2′-dipyridyl.2.Under these conditions, the viability of the parasites was not affected as evidenced by the amount of ATP in the whole sample and the mobility after mechanical stimulus.3.Incorporation of [14C]proline into non-collagenous proteins in the body wall and cuticle was reproducibly higher in 2,2′-dipyridyl-treated specimens than in untreated worms. Synthesis of collagenous hydroxyproline was inhibited in the cuticle and, to a greater extent, in the muscle layer.4.After transferring the specimens into a fresh medium enriched with 0·1 mM ferrous ions and incubated under 70% oxygen, the muscle collagen remained underhydroxylated. The synthesis of hydroxyproline, however, was almost completely normalized in the cuticle collagen.5.We interpret the data as further evidence of the existence of at least two different enzymes hydroxylating collagenous proline, one located in the subcuticle and the other in the muscle layer of Ascaris lumbricoides.

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A degradação da interface adesiva em dentina pode acometer tanto a porção resinosa como a porção orgânica da camada híbrida. Evidências indicam que a degradação da porção orgânica pode ocorrer em parte devido a atividade enzimática de proteases da própria dentina. As metaloproteinases da matriz (MMPs) constituem a primeira classe de enzimas relacionada com a degradação da matriz orgânica. É possível que as MMPs, possam ser reativadas durante o procedimento adesivo em conseqüência da queda do pH do meio. Objetivo: Esta investigação teve como objetivos avaliar a influência de soluções desmineralizadoras com diferentes concentrações de ácido fosfórico (AF1%, AF10% e AF37%) na atividade proteolítica da dentina humana sadia, na degradação do colágeno exposto pela desmineralização, além de identificar imunologicamente as metaloproteinases. Material e Métodos: Vinte dentes molares permanentes foram triturados para obtenção de um pó de dentina. Alíquotas de 1g do pó foram acondicionadas em tubos plásticos para que a desmineralização do substrato pudesse ser realizada de acordo com as três diferentes concentrações de ácido fosfórico testadas. Após a neutralização do ácido com NaOH, as amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para mensuração espectrofotométrica do conteúdo de Cálcio (Ca) liberado pela desmineralização. O precipitado obtido foi incubado com tampão de extração de proteínas por 24h a 4°C sob agitação. Nova centrifugação foi realizada e o sobrenadante utilizado para avaliação da atividade da MMP-2 e MMP-9 por zimografia e para a identificação imunológica das metaloproteinases por western blot. O precipitado obtido pela centrifugação foi liofilizado e separado em alíquotas de 40mg (n=10) de pó de dentina para cada condição experimental. As alíquotas foram incubadas em saliva artificial por 24h a 37°C sob agitação e hidrolisadas em autoclave. Após incubação a 65°C por 40 min, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria para que a mensuração da concentração do aminoácido hidroxiprolina (HYP) liberado pela degradação do colágeno exposto pudesse ser obtida. Fatias de 0.3 mm da dentina coronária de outro dente foram obtidas e desmineralizadas, de acordo com as diferentes concentrações de ácido fosfórico para avaliação da atividade enzimática através do método da zimografia in situ. Os resultados foram submetidos à análise de variância de um fator sem vinculação ou teste de Kruskal-Wallis para identificação das diferenças existentes entre os grupos experimentais. Para contraste das médias foi realizado o teste de Student-Newman-Keuls com nível de significância de 5% (=0,05). Resultados: A atividade enzimática de MMP-2 foi estatisticamente maior quando a dentina foi desmineralizada com AF 1% ou 10%. O uso do ácido fosfórico 37% diminuiu consideravelmente a atividade desta enzima, em relação ao AF10% (<0,05). Em nenhuma das amostras desmineralizadas com AF foi detectada a atividade enzimática da MMP-9. A identidade da MMP-2 foi confirmada pelo immunoblotting da enzima com anticorpo específico. A MMP-9 não foi expressa nos extratos analisados. A expressão de MMP-2 foi maior quando utilizado AF 1% ou 10% e menor quando foi utilizado o AF 37%. A utilização do AF 37% liberou valores de Ca, em g/mL, estatisticamente superiores aos valores determinados para os demais grupos (<0,05). A maior concentração de HYP, em g/mL, foi encontrada nos extratos desmineralizados com AF 10%. Em seguida, aparecem os valores encontrados com o uso do AF1%. Os menores valores da concentração de HYP aparecem no grupo em que foi utilizado o AF 37% (<0,05). A concentração de HYP em função do peso de dentina utilizado (40mg) também foi calculada. A maior concentração de HYP por mg de dentina foi obtida com AF 10%, seguida pelos extratos desmineralizados com AF1%. Os menores valores foram detectados com AF 37% (<0,05). O uso do AF10% demonstrou ser responsável pela maior taxa de degradação de colágeno exposto (20,13%). Em seguida, aparecem valores intermediários (11,34%) obtidos com AF1%. Por último, surgem os menores valores (0,68%) com AF37%. A análise das imagens obtidas após a realização da zimografia in situ demonstrou maior atividade enzimática quando a dentina foi desmineralizada com AF10%. Conclusão: O uso do AF37% para o condicionamento da dentina durante a realização do procedimento adesivo pode minimizar os efeitos degradantes das proteases endógenas sobre o colágeno. Em contrapartida, estudos realizados com pó de dentina desmineralizado com AF1% ou 10% podem estar sobreestimando a atividade das MMPs, em relação à prática clínica. / The dentin adhesive interface degradation can occur in resin and in organic portion of the hybrid layer. Evidence indicates that the degradation of organic matrix may partially occur due to the enzymatic activity of proteases own dentin. The matrix metalloproteinases (MMPs) have been described as the first class of enzymes associated with degradation of the organic matrix. It is possible that MMPs may be reactivated during the adhesive procedure as a result of the fall of pH. Purpose: The objectives of the present investigation are to evaluate the influence of different demineralizing phosphoric acid solutions (PA1%, PA10% and PA37%) on the proteolytic activity of human sound dentin, on the collagen degradation that was exposed after demineralization, as well as to identify the metaloproteases immunologically. Material and Methods: Dentin powder was obtained from twenty human molars. One gram aliquots were placed in polyestyrene tubes and the dentin demineralization was performed using the three different phosphoric acid concentrations tested in this study. After neutralization with NaOH, the samples were centrifuged. The supernatant was used for the spectrophotometrically quantification of calcium (Ca) released by the demineralization while the precipitate was re-suspended and incubated with a protein extraction buffer for 24h at 4ºC under agitation. The sample was centrifuged and the supernatant was used for the identification of MMP-2 and MMP-9 by western blot and for the evaluation of gelatinolytic activity by zymography. The pellet was lyophilized and 40 mg aliquots of the dentin powder (n=10) were incubated in artificial saliva for 24h at 37°C under agitation and hydrolysed in autoclave after incubation at 65°C for 40 min. The samples were analyzed spectrophotometrically to measure the hydroxyproline (HYP) released after collagen degradation. Slices of 0.3 mm of the dentine crown of the another tooth were obtained and demineralized in accordance with the concentrations of phosphoric acid used in this study for evaluating the enzymatic activity by the method of in situ zymography.The data were analyzed by ANOVA one-way or Kruskal-Wallis test for the identification of differences between the experimental groups. The means were analyzed by Student-Newmans-Keulss test (=0,05). Results: The MMP-2 enzymatic activity was statistically higher when the dentin was demineralized with 1% or 10% PA. The 37% phosphoric acid decreased the activity of such enzyme relative to PA 10% (<0,05). MMP-9 activity was not detected in any demineralization condition (1%, 10% or 37% PA). MMP-2 identification was confirmed by immunoblotting while MMP-9 was not observed in any condition. MMP-2 identification was higher when 1% or 10% PA were used while 37% PA showed lower MMP-2 identification. The use of 37% PA resulted in higher release of Ca, which was significantly higher when compared to other PA concentrations (<0,05). The highest HYP concentration was observed when 10% PA was used, followed by 1% PA. The lowest values were observed for 37% PA (<0,05). The HYP concentration according to the dentin weight used (40 mg) was also calculated. Highest concentrations of HYP per mg of dentin were observed for 10% and 1% PA, while 37% PA resulted in the lowest HYP concentration (<0,05). The use of 10% PA showed to be responsible for the highest exposed collagen degradation after demineralization (20,13%) when compared to 1% PA (11,34%) and 37% PA (0,68%). The analysis of images obtained after the realization of in situ zymography showed greater enzyme activity when the dentin was demineralized in PA10%. Conclusion: The use of 37% PA for dentin etching during the restorative procedure might minimize collagen degradation by host-derived proteases. On the other hand, studies that have been using 1% or 10% PA might have overestimated MMPs activity when compared to the clinical situation.

Orientador: José Guilherme Minossi / Banca: Luis Eduardo Naresse / Banca: Lidia Raquel de Carvalho / Banca: Roberto Saad Junior / Banca: Luis Roberto Montolar Verderese / Resumo: O consumo abusivo de álcool é considerado um grave problema de saúde pública mundial. O uso excessivo e indiscriminado de bebidas alcoólicas é responsável por mais de 60 agravos a saúde, como câncer de esôfago, estômago e fígado, doenças cardiovasculares, cirrose hepática, pancreatite crônica, úlcera péptica e em muitas dessas patologias pode-se necessitar de intervenções no trato digestivo. Na problemática exposta sobre o alcoolismo há uma série de alterações que podem repercutir nas anastomoses do trato gastrointestinal, como: desnutrição, lesões hepáticas, além do efeito tóxico direto do etanol sobre a mucosa gastrointestinal. Estudar o efeito do alcoolismo no processo de cicatrização intestinal e a evolução no pós-operatório de ratos submetidos à ingestão de etanol. Método: Foram utilizados 160 ratos da linhagem Wistar. Esses animais foram divididos em dois grupos, controle e tratado, sendo que o controle recebeu água e ração em livre demanda e o tratado solução etílica a 30% e ração livre demanda. Após 180 dias foi realizada colotomia cinco centímetros acima da deflexão peritoneal e anastomose em todos os animais. Após o procedimento os grupos foram divididos em quatro subgrupos de 20 ratos para estudo nos seguintes momentos: 40, 70, 140 e 210 pós-operatórios. Os parâmetros analisados foram: força de ruptura longitudinal, dosagem de hidroxiprolina tecidual, complicações pós-operatórias e estudo histopatológico. Resultados: O ganho de peso foi superior no grupo controle quando comparado com o grupo tratado (p<0,05). Agrupados todos os subgrupos, a força de ruptura foi significativamente maior no grupo controle que no grupo tratado (p<0,05). A dosagem de hidroxiprolina não apresentou diferença entre os grupos em cada momento estudado. A análise histopatológica não demonstrou alterações significativas entre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Alcohol abuse is considered to be a serious public-health problem worldwide. The excessive and indiscriminate use of alcoholic beverages is responsible for more than 60 health medical problems, such as esophageal, stomach and liver cancer, cardiovascular diseases, hepatic cirrhosis, chronic pancreatitis and peptic ulcers. Many of these pathologies may require interventions in the digestive tract. The problems stemming from alcoholism include a number of alterations that may lead to anastomosis of the gastrointestinal tract, such as malnutrition and hepatic lesions, in addition to the direct toxic effect of ethanol on the gastrointestinal mucosa. Objective: To study the effect of alcoholism on the process of intestinal healing and the post-operative development of rats submitted to ethanol ingestion. Method: One hundred and sixty Wistar rats were used. These animals were divided into two groups, namely control and treated. The control group received water and animal feed ad libitum, and the treated group was given 30% ethyl alcohol solution and feed ad libitum. One hundred and eighty days later, colotomy 5 cm above peritoneal deflection and anastomosis were performed in all animals. After the procedure, the groups were divided into 4 sub-groups of 20 rats for study at the following post-operative moments: 4th, 7th, 14th and 21st days. The parameters analyzed were rupture strength, tissue hydroxyproline dosage, post-operative complications and histopathology. Results: Weight gain was greater in the control group as compared to that in the treated group (p<0.05). By grouping all the sub-groups, it was observed that rupture strength was significantly greater in the control group than in the treated group (p<0,05). Hydroxyproline dosage did not show any differences between the groups at each studied moment. Histopathological analysis did not show significant alterations between the groups... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A degradação da interface adesiva em dentina pode acometer tanto a porção resinosa como a porção orgânica da camada híbrida. Evidências indicam que a degradação da porção orgânica pode ocorrer em parte devido a atividade enzimática de proteases da própria dentina. As metaloproteinases da matriz (MMPs) constituem a primeira classe de enzimas relacionada com a degradação da matriz orgânica. É possível que as MMPs, possam ser reativadas durante o procedimento adesivo em conseqüência da queda do pH do meio. Objetivo: Esta investigação teve como objetivos avaliar a influência de soluções desmineralizadoras com diferentes concentrações de ácido fosfórico (AF1%, AF10% e AF37%) na atividade proteolítica da dentina humana sadia, na degradação do colágeno exposto pela desmineralização, além de identificar imunologicamente as metaloproteinases. Material e Métodos: Vinte dentes molares permanentes foram triturados para obtenção de um pó de dentina. Alíquotas de 1g do pó foram acondicionadas em tubos plásticos para que a desmineralização do substrato pudesse ser realizada de acordo com as três diferentes concentrações de ácido fosfórico testadas. Após a neutralização do ácido com NaOH, as amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para mensuração espectrofotométrica do conteúdo de Cálcio (Ca) liberado pela desmineralização. O precipitado obtido foi incubado com tampão de extração de proteínas por 24h a 4°C sob agitação. Nova centrifugação foi realizada e o sobrenadante utilizado para avaliação da atividade da MMP-2 e MMP-9 por zimografia e para a identificação imunológica das metaloproteinases por western blot. O precipitado obtido pela centrifugação foi liofilizado e separado em alíquotas de 40mg (n=10) de pó de dentina para cada condição experimental. As alíquotas foram incubadas em saliva artificial por 24h a 37°C sob agitação e hidrolisadas em autoclave. Após incubação a 65°C por 40 min, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria para que a mensuração da concentração do aminoácido hidroxiprolina (HYP) liberado pela degradação do colágeno exposto pudesse ser obtida. Fatias de 0.3 mm da dentina coronária de outro dente foram obtidas e desmineralizadas, de acordo com as diferentes concentrações de ácido fosfórico para avaliação da atividade enzimática através do método da zimografia in situ. Os resultados foram submetidos à análise de variância de um fator sem vinculação ou teste de Kruskal-Wallis para identificação das diferenças existentes entre os grupos experimentais. Para contraste das médias foi realizado o teste de Student-Newman-Keuls com nível de significância de 5% (=0,05). Resultados: A atividade enzimática de MMP-2 foi estatisticamente maior quando a dentina foi desmineralizada com AF 1% ou 10%. O uso do ácido fosfórico 37% diminuiu consideravelmente a atividade desta enzima, em relação ao AF10% (<0,05). Em nenhuma das amostras desmineralizadas com AF foi detectada a atividade enzimática da MMP-9. A identidade da MMP-2 foi confirmada pelo immunoblotting da enzima com anticorpo específico. A MMP-9 não foi expressa nos extratos analisados. A expressão de MMP-2 foi maior quando utilizado AF 1% ou 10% e menor quando foi utilizado o AF 37%. A utilização do AF 37% liberou valores de Ca, em g/mL, estatisticamente superiores aos valores determinados para os demais grupos (<0,05). A maior concentração de HYP, em g/mL, foi encontrada nos extratos desmineralizados com AF 10%. Em seguida, aparecem os valores encontrados com o uso do AF1%. Os menores valores da concentração de HYP aparecem no grupo em que foi utilizado o AF 37% (<0,05). A concentração de HYP em função do peso de dentina utilizado (40mg) também foi calculada. A maior concentração de HYP por mg de dentina foi obtida com AF 10%, seguida pelos extratos desmineralizados com AF1%. Os menores valores foram detectados com AF 37% (<0,05). O uso do AF10% demonstrou ser responsável pela maior taxa de degradação de colágeno exposto (20,13%). Em seguida, aparecem valores intermediários (11,34%) obtidos com AF1%. Por último, surgem os menores valores (0,68%) com AF37%. A análise das imagens obtidas após a realização da zimografia in situ demonstrou maior atividade enzimática quando a dentina foi desmineralizada com AF10%. Conclusão: O uso do AF37% para o condicionamento da dentina durante a realização do procedimento adesivo pode minimizar os efeitos degradantes das proteases endógenas sobre o colágeno. Em contrapartida, estudos realizados com pó de dentina desmineralizado com AF1% ou 10% podem estar sobreestimando a atividade das MMPs, em relação à prática clínica. / The dentin adhesive interface degradation can occur in resin and in organic portion of the hybrid layer. Evidence indicates that the degradation of organic matrix may partially occur due to the enzymatic activity of proteases own dentin. The matrix metalloproteinases (MMPs) have been described as the first class of enzymes associated with degradation of the organic matrix. It is possible that MMPs may be reactivated during the adhesive procedure as a result of the fall of pH. Purpose: The objectives of the present investigation are to evaluate the influence of different demineralizing phosphoric acid solutions (PA1%, PA10% and PA37%) on the proteolytic activity of human sound dentin, on the collagen degradation that was exposed after demineralization, as well as to identify the metaloproteases immunologically. Material and Methods: Dentin powder was obtained from twenty human molars. One gram aliquots were placed in polyestyrene tubes and the dentin demineralization was performed using the three different phosphoric acid concentrations tested in this study. After neutralization with NaOH, the samples were centrifuged. The supernatant was used for the spectrophotometrically quantification of calcium (Ca) released by the demineralization while the precipitate was re-suspended and incubated with a protein extraction buffer for 24h at 4ºC under agitation. The sample was centrifuged and the supernatant was used for the identification of MMP-2 and MMP-9 by western blot and for the evaluation of gelatinolytic activity by zymography. The pellet was lyophilized and 40 mg aliquots of the dentin powder (n=10) were incubated in artificial saliva for 24h at 37°C under agitation and hydrolysed in autoclave after incubation at 65°C for 40 min. The samples were analyzed spectrophotometrically to measure the hydroxyproline (HYP) released after collagen degradation. Slices of 0.3 mm of the dentine crown of the another tooth were obtained and demineralized in accordance with the concentrations of phosphoric acid used in this study for evaluating the enzymatic activity by the method of in situ zymography.The data were analyzed by ANOVA one-way or Kruskal-Wallis test for the identification of differences between the experimental groups. The means were analyzed by Student-Newmans-Keulss test (=0,05). Results: The MMP-2 enzymatic activity was statistically higher when the dentin was demineralized with 1% or 10% PA. The 37% phosphoric acid decreased the activity of such enzyme relative to PA 10% (<0,05). MMP-9 activity was not detected in any demineralization condition (1%, 10% or 37% PA). MMP-2 identification was confirmed by immunoblotting while MMP-9 was not observed in any condition. MMP-2 identification was higher when 1% or 10% PA were used while 37% PA showed lower MMP-2 identification. The use of 37% PA resulted in higher release of Ca, which was significantly higher when compared to other PA concentrations (<0,05). The highest HYP concentration was observed when 10% PA was used, followed by 1% PA. The lowest values were observed for 37% PA (<0,05). The HYP concentration according to the dentin weight used (40 mg) was also calculated. Highest concentrations of HYP per mg of dentin were observed for 10% and 1% PA, while 37% PA resulted in the lowest HYP concentration (<0,05). The use of 10% PA showed to be responsible for the highest exposed collagen degradation after demineralization (20,13%) when compared to 1% PA (11,34%) and 37% PA (0,68%). The analysis of images obtained after the realization of in situ zymography showed greater enzyme activity when the dentin was demineralized in PA10%. Conclusion: The use of 37% PA for dentin etching during the restorative procedure might minimize collagen degradation by host-derived proteases. On the other hand, studies that have been using 1% or 10% PA might have overestimated MMPs activity when compared to the clinical situation.

Nous nous sommes attachés à trouver de nouvelles applications de la réaction de transfert O-N acylique pour la synthèse de peptides et de polypeptides. Nous avons mis au point une nouvelle voie pour la synthèse de peptide alcool sur support solide. Cette méthodologie a permis de préparer 3 peptides alcool modèles comme l'Octréotide avec de bons rendements et d'excellentes puretés. Nous avons développé une nouvelle stratégie pour la synthèse de polyamide à partir de polyester via une réaction de multi-transfert O-N acylique. Pour cela, nous avons isolé trois générations de polymères : les polyesters Z-protégés après polymérisation, les polyesters hydrosolubles après le clivage des groupements Z et les polyamides après multi-transfert O-N acylique dans des conditions basiques organiques et à pH physiologique. Cette stratégie a été appliquée à la synthèse de polyamide de sérine et de sérine gamma-homologuée. Maintenant, nous développons une nouvelle stratégie de polymérisation de séquence peptidique contenant une sérine N-protégée en position N-terminale. Comme décrit précédemment pour les polysérines, les objectifs de cette étude sont de synthétiser in fine des polypeptides à partir des polypeptides/esters correspondants. / We founded some news applications of the O-N acyl transfer, notably for the synthesis of peptides and polypeptides. We optimized a new general voice for the preparation of peptides alcohol on solid support. This methodology permits to synthesize 3 peptides alcohol with yield and purity, notably Octreotide. We developed a new strategy for the synthesis of polyamide from polyester using an O-N acyl multi-transfer reaction. We have isolated 3 generations of polymers: the Z-protected polyesters after polymerization (polycondensation and ROP), the unprotected water-soluble polyesters after the cleavage of the protection Z and the polyamides after the O-N acyl multi-transfer in basic organic condition or in phosphate buffer. This methodology was applied to the synthesis of the polyamide serine and gamma-homologated serine. Currently, we are developing a new methodology for the polymerization peptide sequence containing an N-protected serine in N-terminal position. As previously described on polyserine, the objectives of this polymerization are to generate polypeptides from the corresponding polypeptides/esters.