O melasma é uma das desordens pigmentativas da pele adquiridas mais comuns que afetam a face da mulher adulta e pode causar comprometimento significativo da qualidade de vida psicossocial. Apesar da grande demanda terapêutica, o tratamento do melasma continua sendo desafiador com resultados inconsistentes, constantes recidivas e frequentes relatos de efeitos adversos. Assim, substâncias ativas alternativas para o controle do melasma são de grande interesse para a área clínica. Considerando que o extrato de oliva com concentração padronizada de hidroxitirosol apresenta propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e potencial ação despigmentante por inibição da tirosinase, a enzima central envolvida na melanogênese, o mesmo apresenta grande potencial para o controle do melasma. Técnicas não invasivas de biofísica e de análise de imagem da pele, como a microscopia confocal de reflectância, são ferramentas fundamentais para a avaliação objetiva da eficácia de tratamentos em estudos clínicos e caracterização do melasma. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia do uso oral e/ou tópico do extrato de oliva padronizado em hidroxitirosol no controle do melasma por técnicas de biofísica e análise de imagem da pele. Para isso, um estudo clínico randomizado, duplo-cego e placebo controle foi realizado a partir da inclusão de 56 participantes entre 30 e 50 anos, fototipo III ou IV e melasma na região malar. As participantes foram randomizadas em quatro grupos (n=14): controle, tópico, oral e tópico e oral e receberam o tratamento diário contendo o extrato de oliva ou o placebo/veículo por 90 dias. A caracterização das estruturas morfológicas do melasma foi realizada com o microscópio confocal de reflectância. A avaliação objetiva do melasma para verificar a eficácia dos tratamentos foi realizada mensalmente por técnicas de biofísica como as medidas de luminosidade, melanina e eritema, que foram complementadas pelo índice de severidade e área do melasma modificado (mMASI). Os resultados obtidos apresentaram grande variabilidade intrínseca. Ainda, apesar de observada maior redução da pigmentação do melasma no grupo que recebeu o tratamento oral, quando comparado aos outros grupos, incluindo o grupo controle, nenhuma diferença significativa nos seguimentos avaliados foi observada. Por fim, o extrato de oliva padronizado em hidroxitirosol não é eficaz para o controle do melasma nas concentrações usadas no estudo / Melasma is one of the most common hyperpigmentation disorder that affects the face of adult women and can cause significant psychosocial life quality impairment. Despite great therapeutical demand, melasma treatment remains challenging with unpredictable results, relapses and frequent adverse effects. Therefore, alternative active substances for melasma control is of great interest for clinical area. This way, olive extract containing standardized concentration of hydroxytyrosol presents antioxidant effect and potential depigmenting action by tyrosinase inhibition, the main enzyme involved in melanogenesis. Non-invasive biophysical techniques and image analysis, as confocal reflectance microscopy, are indispensable tools to evaluate the treatment efficacy in clinical trials and melasma characterization. This way, the objective of the present study was to evaluate the clinical efficacy of an oral and/or topical treatment based on an olive extract titrated in hydroxytyrosol for melasma control using biophysical and skin imaging techniques. For this, a randomized, double-blinded and placebocontrolled clinical trial was conducted by the inclusion 56 women aged 30-50 years, phototype III and IV and melasma. The participants were randomized in four groups (n=14): control, oral or topical - and received daily treatment containing hydroxytyrosol or placebo for 90 days. Efficacy evaluation were performed once a month by biophysical techniques for lightness, melanin and erythema quantification and complemented by the modified melasma area and severity index (mMASI). Results presented great intrinsic melasma variability. Furthermore, depite reduced pigmentation observed in melasma for the oral group compared to the other treatment groups, including the control group, no significant difference was observed at the evaluations. In conclusion, the oral use of olive extract containing hydroxytyrosol was not efficient for melasma control at the studied concentrations

Eukaryotic gene expression is a complex process that can be controlled at the level of transcription, post-transcription, translation, or post-translation. In recent years there has been growing interest in understanding the role of the 3'-untranslated region (UTR) in post-transcriptional regulation. The 3'-UTR contains many regulatory sequences, including microRNA (miR) target sites and AU-rich elements (AREs). Although a relatively recent discovery, miRs have been shown to downregulate target gene expression and have important roles in regulating many cellular processes, including cellular growth. Cellular growth consists of two distinct states, proliferation and quiescence. The proliferative state consists of G1, S, G2, and M phases while quiescence is the G0 phase. In response to mitogenic stimuli, quiescent cells enter the proliferative cycle and may transit back to the quiescent state. Reentry into quiescence is essential to prevent aberrant proliferation as well as to protect the cellular life span. Cells that remain in quiescence for an extended period of time lose their ability to proliferate. It has been shown that the redox status of the cells may regulate quiescence and proliferative capacity since overexpression of SOD2 protects the proliferative capacity of quiescent cells. We hypothesized that the redox environment regulates proliferative capacity through miR expression and regulation of miR targets. Early results showed treatment with hydroxytyrosol (HT), an olive-derived catechol, was able to protect the proliferative capacity of quiescent normal human fibroblasts. HT was shown to use hydrogen peroxide and produce superoxide in a catechol-semiquinone-quinone redox cycle. Interestingly, HT also induced SOD2 expression. Further results from microRNA PCR arrays and Taqman PCR assays showed a significant decrease (4-fold) in miR-302 levels during quiescence compared to proliferating normal human fibroblasts, suggesting that miR-302 could regulate cellular growth states. Results from a Q-RT-PCR and dual luciferase-3'-UTR reporter assays identified ARID4a (AT-Rich Interacting Domain 4a, also known as RBP1) and CCL5 (C-C motif Ligand 1) as targets for miR-302. Ionizing radiation, that is well known to induce oxidative stress and delay cell cycle progression, decreased miR-302 levels, which was associated with an increase in its target mRNA levels, ARID4a and CCL5. Such an inverse correlation was also observed in cells treated with hydrogen peroxide, SOD2 overexpressing cells, and HT treated cells. Overexpression of miR-302 suppresses ARID4a and CCL5 mRNA levels, and increased the percentage of S-phase cells. These results identified miR-302 as a redox-sensitive regulator of ARID4a and CCL5 mRNAs as well as demonstrate a regulatory role of miR-302 during quiescence and proliferation.

Hydroxytyrosol, 3,4-dihydroxyphenolethanol, a naturally occurring polyphenol most common in olive tree (Olea europaea), is one of the most effective member of the polyphenols family, because of its remarkable antioxidant activity, its ability to inhibit oxidation of low density lipids (LDL), and its protection against DNA oxidative damage. Hydroxytyrosol, which is widely used in cosmetics and food supplements industries, can be purchased as an olive oil extract that contains low concentration of hydroxytyrosol besides other polyphenols. The price and low natural abundance of hydroxytyrosol make alternative synthetic sources very attractive. In this research, a novel method for the synthesis of pure hydroxytyrosol from a commercially inexpensive precursor catechol was developed; this can satisfy the increasing market demand and provide a more economical alternative source for this valuable polyphenol.

Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει εμβόλιο για καμιά μορφή των λεϊσμανιάσεων και τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται δεν είναι ασφαλή, αποτελεσματικά και οικονομικά προσιτά. Υπάρχει άφθονη επιστημονική πληροφορία για τα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα που χρησιμοποιούνται με αναγνωρισμένα μειονεκτήματα όπως η τοξικότητα, η ανάπτυξη αντοχής, η υποχρεωτική παραμονή στο νοσοκομείο και το υψηλό κόστος. Επιπλέον η συλλοίμωξη με τον ιό του AIDS (HIV/VL) έχει σοβαρές επιπτώσεις στην επιδημιολογία, τη διάγνωση και την πρόγνωση της νόσου. Είναι προφανές ότι η εκδήλωση της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης είναι “ευκαιριακή” όπως αποδεικνύεται από τα στοιχεία του Π.Ο.Υ., σύμφωνα με τα οποία οι ασθενείς με AIDS έχουν 3.000 φορές υψηλότερη συχνότητα VL σε σύγκριση με τον γενικό πληθυσμό. Για τα διάφορα είδη του γένους Leishmania υπάρχουν αξιόλογα ευρήματα από παρασιτολογικές, βιοχημικές, μοριακές και ανοσολογικές μελέτες, όμως τα θεραπευτικά πρωτόκολλα ενάντια των διαφορετικών κλινικών μορφών δεν είναι ικανοποιητικά. Γεγονός αποτελεί η αδήριτη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων κατά των λεϊσμανιάσεων που μαστίζουν έως και 1,7 εκατομμύρια ανθρώπους σε όλη την γη. Σήμερα το ενδιαφέρον για φυσικά προϊόντα βρίσκεται σε επικαιρότητα κυρίως με την αναζήτηση νέων χημικών ενώσεων αλλά και την επανεξέταση παλαιοτέρων σε σύγχρονα πλέον πειραματικά πρωτόκολλα. Μεταξύ αυτών των προϊόντων η ελαιοευρωπεΐνη, που προέρχεται από το δένδρο της ελιάς (Olea europaea), χαρακτηρίζεται από αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή και αντιφλεγμονώδη δράση. Η βιοφαινόλη αυτή φαίνεται να συμβάλλει επίσης στην μακροζωία αλλά και όταν χορηγείται σε πειραματόζωα με καρκινικούς όγκους είναι ικανή στο να τους συρρικνώνει ή ακόμη και να τους εξαφανίζει. Ο σκοπός αυτής της διατριβής είναι η διερεύνηση φυσικών προϊόντων προερχόμενων από τα φύλλα και τους καρπούς του δέντρου της ελιάς αλλά και από πάρα-προϊόντα του όπως τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου. Επίσης εξετάσθηκαν δύο αδρά εκχυλίσματα από τον ερυθρό οίνο ποικιλίας ξινόμαυρο. Αμφότερες οι πηγές των εκχυλισμάτων αποτελούν θεμελιώδεις λίθους της Μεσογειακής διατροφής και οι βιβλιογραφικές αναφορές τα καθιστούν ως υποσχόμενους αντιλεϊσμανιακούς παράγοντες. Τα αποτελέσματά έδειξαν ότι τα δύο καθαρά φυσικά προϊόντα που εξετάσθηκαν, η υδροξυτυροσόλη και η ελαιοευρωπεΐνη επέδειξαν επιλεκτική και σημαντική αντιλεϊσμανιακή δραστικότητα εναντίον τριών ειδών πρωτοζώων του γένους Leishmania και συγκεκριμένα των L. infantum, L. donovani και L. major. Η διατριβή εστιάστηκε στη ελαιοευρωπεΐνη και αναδείχθηκε η ικανότητά της να προκαλεί ρυθμιζόμενο κυτταρικό θάνατο αποδεικνυόμενο από μορφολογικές αλλαγές σε προμαστιγότες L. donovani, λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης, με τη χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας. Η στρογγυλοποίηση των προμαστιγοτών, η συμπύκνωση της χρωματίνης καθώς και η έκθεση της φωσφατιδυλοσερίνης στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταροπλασματικής μεμβράνης με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής είναι φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της επαγωγής ρυθμιζόμενου παρασιτικού θανάτου που αποδείχθηκε ότι ο μηχανισμός πρόκλησής του είναι ανεξάρτητος της παραγωγής ROS. Επιπλέον η ελαιοευρωπεΐνη προκάλεσε μια καθυστέρηση στο φυσιολογικό κυτταρικό κύκλο του παρασίτου οδηγώντας στον κατακερματισμό του DNA. Η αντιλεϊσμανιακή δράση της ελαιοευρωπεΐνης αποδείχτηκε και εναντίον των αμαστιγωτικών μορφών του είδους L. donovani που είχαν in vitro παρασιτήσει σε μακροφάγα της κυτταρικής σειράς J774Α.1. Αυτή η δράση συνοδεύτηκε από μία ενδομακροφαγική αύξηση ROS ενώ η in vitro χορήγηση ελαιοευρωπεΐνης σε μυελοειδή DCs αύξησε τον πληθυσμό που παράγει IL-12 δίχως να προκαλεί παράλληλη ωρίμανσή τους. Τα ανωτέρω οδήγησαν στη μελέτη της δράσης της ελαιοευρωπεΐνης σε in vivo πειραματικό μοντέλο σπλαχνικής λεϊσμανίασης. Σε L. donovani μολυσμένα BALB/c ποντίκια χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς ελαιοευρωπεΐνη κάθε δεύτερη ημέρα για 28 συνεχόμενες ημέρες σε τρεις διαφορετικές δόσεις (45, 15 και 5mg/kg σωματικού βάρους). Βρέθηκε ότι και οι τρεις δόσεις περιόρισαν το παρασιτικό φορτίο του σπλήνα και του ήπατος στις 3 ημέρες και στις 6 εβδομάδες μετά το πέρας της χορήγησης της ελαιοευρωπεΐνης. Διαπιστώθηκε ότι τα πειραματόζωα που έλαβαν ελαιοευρωπεΐνη και περιόρισαν την ενδοκυτταρική εξάπλωση του παρασίτου στο σπλήνα και στο ήπαρ ανέπτυξαν μια ενισχυμένη ΤΗ1 τύπου ανοσολογική απόκριση με χαρακτηριστικό ισοτυπικό προφίλ αντισωμάτων IgG2α/IgG1 και μεταγραφικών παραγόντων Tbx21/GATA-3. Η υπερ-έκφραση των IL-12p40, IFNγ, TNFα και iNOS επιβεβαιώνει την πόλωση προς τον ΤΗ1 υποτύπο ανοσολογικής απόκρισης, ενώ η έκφραση των κυτταροκινών ρυθμιστές της TΗ2 ανοσολογικής απάντησης δεν είχαν καμία αυξητική τάση. Αυτό το φαινόμενο που προέρχεται αρχικώς από την ικανότητα της ελαιοευρωπεΐνης να διατηρεί χαμηλά τα επίπεδα της προφλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-1β, επιτρέπει τον ανοσολογικό μηχανισμό του ξενιστή να ενεργοποιηθεί (μεταγραφή του Tbx21) αποτρέποντας την είσοδο του ξενιστή σε κατάσταση χρόνιας φλεγμονικής διεργασίας που ευνοεί τον παρασιτικό πολλαπλασιασμό. Απεναντίας ενεργοποιούνται μηχανισμοί παραγωγής των μικροβιοκτόνων μορίων ROS και NO• στο σπλήνα και στο ήπαρ. Η παραγωγή των ROS σε σπληνοκύτταρα ποντικών μολυσμένων με L. donovani ήταν δοσοεξαρτώμενη ενώ αντιθέτως η παραγωγή των ΝΟ• ήταν μη-δοσοεξαρτώμενη τόσο σε κύτταρα του σπλήνα όσο και του ήπατος. Αυτή η παραγωγή των ΝΟ• φαίνεται να επιδρά στην επιβίωση των παρασίτων χωρίς να αλλοιώνει τη φυσιολογική λειτουργία των σπληνοκυττάρων και των ηπατοκυττάρων εφ’ όσον τα μόρια γλουταθειόνης στα κύτταρα του ξενιστή ήταν επαρκή για να συντηρούν τη συνεχή επιβίωση του κυττάρου ξενιστή όπως παρατηρήθηκε με την μη-ενεργοποίηση του NF-kB. Επίσης η ελαιοευρωπεΐνη επιλεκτικά ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση των ενζύμων που σχηματίζουν τη γλουταθειόνη και την τρυπανοθειόνη εις βάρος των αντιοξειδωτικών αμυντικών μηχανισμών του παρασίτου. Συμπερασματικά, το σύνολο των αποτελεσμάτων που περιεγράφηκαν στη διδακτορική αυτή διατριβή, προτείνουν ότι η ελαιοευρωπεΐνη δρα ως ένα αντιλεϊσμανιακό φάρμακο με ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες. Η διερεύνηση της συνδυαστικής δράσης κλασσικών αντιλεϊσμανιακών φαρμάκων με ασφαλή, μη-τοξικά και “φθηνά” φυσικά προϊόντα όπως η ελαιοευρωπεΐνη, παραμένει μια υποσχόμενη μελλοντική προοπτική. Επιπροσθέτως, ενδιαφέρουσα θα ήταν η διερεύνηση της δράσης της ελαιοευρωπεΐνης στην έκφραση έτερων γονιδίων που κωδικοποιούν αντιοξειδωτικά ένζυμα καθώς και στους κυτταρικούς πληθυσμούς που εμπλέκονται επίσης σε in vivo πειραματικό μοντέλο σπλαχνικής λεϊσμανίασης όπως τα δενδριτικά κύτταρα, τα κύτταρα φυσικοί φονιάδες και τα CD8+. Τέλος η ελαιοευρωπεΐνη μπορεί να δοκιμασθεί σε HIV/L. donovani πειραματικό πρωτόκολλο αφού η ελαιοευρωπεΐνη είναι ικανή στο να σταματάει τον πολλαπλασιασμό του ιού HIV. / Up to now there has been neither a vaccine against any form of leishmaniasis found nor drugs that are safe, effective and inexpensive. Plethora of recent data has showed that the existing antileishmanial drugs have numerous disadvantages such as toxicity, development of resistance, long hospitalization and high cost. In addition, HIV/VL coinfection has important epidemiological, clinical, diagnostic and prognostic implications. The two diseases are mutually reinforcing. Clearly the opportunistic manifestation of VL is demonstrated by the WHO records showing that 50-75% new VL cases in South Europe concern HIV patients that bring the incidences of VL 3,000 times more frequent than in the general population. Despite the advances in the parasitological, biochemical, molecular and immunological research using various Leishmania species, the treatment protocols applied against the different forms of the disease are not satisfactory. There is an unconquerable need for the development of new therapeutic treatments to combat leishmaniasis. Nowadays, the interest concerning plant natural products is certainly undergoing a renaissance. The remarkable chemical diversity present in natural products and the accumulated research data produced so far, demonstrate their significant effectiveness against parasitic diseases suggesting the hypothesis to be tested also against leishmaniasis. This was particularly evident in the case of natural products of the olive tree (Olea europaea). Among them oleuropein has most of olive oil’s antioxidant, anti-inflammatory, and disease-fighting characteristics and it is the biophenol that provides life extending benefits. In addition to its antimicrobial and antioxidant activity, when oleuropein was given to animals with tumors, the tumors completely regressed or in some cases even disappeared. The aim of this thesis is to investigate natural products obtained from the olive tree leaves, products and their by-products (olive mill waste waters) and red wine (xinomavro variety), major cornerstones of the Mediterranean diet, as natural sources for promising antileishmanial drugs in accordance with the considerations outlined above. Our results showed that both pure constituents, hydroxytyrosol and oleuropein, exhibited the highest and the most selectively significant leishmanicidal activity against parasites of three Leishmania species, L. infantum, L. donovani and L. major, among the natural products tested. We focused on oleuropein and we discovered that it was capable of causing substantial morphological alterations upon L. donovani logarithmic promastigotes depicted with confocal microscopy namely, cell rounding up, cellular volume reduction and chromatin condensation that were accompanied with phosphatidylserine exposure to the outer leaflet of the plasma membrane. Moreover, oleuropein was found responsible for a delay on normal L. donovani cell cycle progression which was extended up to DNA fragmentation. This regulated parasitic cell death induced by oleuropein appeared to be ROS-independent. Oleuropein’s leishmanicidal capacity was also evident against the amastigote form of the parasite using an in vitro experimental model based on J774.A1 macrophages infected with L. donovani. This activity is accompanied by an increase of inracellular ROS production and the ability of oleuropein to increase the percentage of IL-12 producing myeloid DCs when is administrated in vitro. This data suggested testing the leishmanicidal activity of oleuropein upon in vivo murine visceral model. Intraperitoneal administration of oleuropein every other day for 28 days in L. donovani infected BALB/c mice, led to the dramatic reduction of the parasite load in spleen and liver. Interestingly, oleuropein treated L. donovani infected BALB/c mice, switch towards a TH1 type of immune response characterized by relevant IgG2a/IgG1 isotype and Tbx21/GATA-3 transcription factor ratio. Analysis of the whole spleen tissue revealed small but significant fold changes in gene expression of TH1 versus TH2 type of cytokines between treated and non-treated L. donovani infected BALB/c mice. Particularly, the dominance of TH1 type of response was confirmed by the up regulation of IL-12p40, IFN-γ and TNF-α which triggers elevated expression of iNOS in splenocytes in oleuropein treated L. donovani infected BALB/c mice. Despite the presence of TH2 type of response, the abiding down regulation of IL-1β permits Tbx21 expression and prevents prolonged inflammatory process and thus to disease exacerbation. We also found that oleuropein promoted a dose-dependent ROS production on spleen cells from BALB/c mice infected with L. donovani while it was able to evoke a dose-independent NO production on spleen and liver cells. NO production seems to affect parasitic viability but did not alter physiological function of spleen and liver cells since glutathione cell reservoir is capable of maintaining the continuity of host cell survival confirmed by the absence of NF-kB2 expression increase. Furthermore, oleuropein selectively regulates the transcription of glutathione and trypanothione gene which encode their synthesis enzymes at expense of parasitic antioxidant defense mechanism. The overall conclusion of the research described in this thesis suggests that oleuropein acts as an effective antileishmanial drug with demonstrable immunostimulating properties and selectively induces parasitic death by microbicidal molecules. The option of testing the combining effects of classical antileishmanial drugs with safe, non-toxic and cost effective natural products like oleuropein remains a promising future perspective. Moreover, interesting remains the effect of oleuropein upon other antioxidant genes and cell populations that play crucial roles in the in vivo experimental visceral leishmaniasis such as mDCs, NK and CD8+ cells. Finally, oleuropein could be used upon HIV/L. donovani experimental protocol since oleuropein is also capable to cease viral multiplication.

The scope of the present work was to investigate whether the protective role of the traditional Mediterranean diet (TMD), and virgin olive oil (VOO) rich in phenolic compounds (PC), towards cardiovascular disease can be mediated through gene expression changes. Two trials were performed to assess the in vivo nutrigenomic effects of TMD and VOO in healthy volunteers. The results point out: a) significant gene expression changes of those genes related with cardiovascular-risk processes after VOO ingestion; b) a down-regulation in the expression of atherosclerosis-related genes after a 3-month intervention with a TMD; and c) an olive oil PC health-protective nutrigenomic effect within the frame of the TMD. Changes in gene expression were concomitant with decreases in oxidative damage and systemic inflammation markers. Data from our studies provide further evidence to recommend both the TMD and the VOO as a useful tool for the prevention of atherosclerosis. / El objetivo de este estudio es investigar si el papel protector de la dieta Mediterránea tradicional (TMD) y del aceite de oliva virgen (VOO), rico en compuestos fenólicos (PC), puede ser mediado a través de cambios en la expresión génica. Se realizaron dos ensayos clínicos para evaluar los efectos nutrigenómicos de la TMD y del VOO, in vivo, en voluntarios sanos. Los resultados mostraron a) cambios en la expresión génica de genes relacionados con el riesgo cardiovascular tras la ingestión del aceite virgen de oliva, b) una infra-expresión en la expresión de genes relacionados con el proceso aterosclerótico tras una intervención con TMD de 3 meses y c) que los compuestos fenólicos del aceite de oliva ejercen un efecto nutrigenómico protector en el marco de la TMD. Los cambios en la expresión génica fueron coherentes.