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OBJECTIVE: The close relationship between obesity and type 2 diabetes (T2D) highlights the fact that most diabetes patients are overweight or obese. We propose that elevated glucose and free fatty acid levels in those patients cause beta-cell dysfunction. Chronic exposure to excess nutrients (glucose and free fatty acid) leads to glucolipotoxicity, characterized by basal insulin hypersecretion, a left-shift in the glucose dose-dependent insulin secretion curve, and blunted glucose-stimulated insulin secretion. One of the suggested reasons for this defect is elevated intracellular lipid. In this study, our objective was to investigate whether reducing beta-cell lipid levels can reverse basal insulin hypersecretion. METHODS: INS-1 (823/13) cells were cultured in 4 or 11 mM glucose media. Elevated glucose and KCl doses were added to cells in the insulin secretion experiments. In the KCl-induced insulin secretion experiment, cells were treated with a combination of 12 mM glucose and 250 μM diazoxide, then assigned to different test concentrations with elevated KCl doses. Insulin release and content were measured by the insulin ultra-sensitive homogenous time-resolved fluorescence (HTRF) kit (Cisbio). Following that, we monitored intracellular Ca2+ activity of KCl-induced insulin secretion on a fluorescence spectrophotometer F-2000 (Hitachi). Additionally, we acutely added Adipo C (20 µM) or fatty acid-free BSA to cells to reduce the lipids levels in the ß-cells. We also stained with Nile Red (Sigma) to examine the intrinsic lipid droplets in those cells. RESULTS: ß-cells cultured in excess nutrients (11 mM glucose) exhibited a left shift in the glucose dose-dependent response curve. The hypersecretion at low glucose could be blocked by the KATP channel activator, diazoxide, indicating that Ca2+ influx drives the increase in secretion at glucose concentrations normally considered basal. Here we extend this left shift to include KCl-induced insulin secretion, supporting a role for Ca2+ in the observed hypersensitivity. KCl-induced Ca2+ influx was also left-shifted. Interestingly, we found acute exposure to Adipo C or fatty acid-free BSA reversed the basal hypersecretion in cells cultured in excess nutrients. CONCLUSION: The work presented in this study provided supporting evidence that ß-cells cultured in excess nutrients were hypersensitive to glucose while extending these studies to KCl-induced insulin release. The excess nutrient-induced left shift in both glucose and KCl-stimulated insulin secretion was mediated by increased Ca2+. Thus, we postulate that excess nutrient exposure increases ß-cell plasma membrane lipids that alter Ca2+ handling to allow increased Ca2+ influx at inappropriate low glucose concentrations. Our results demonstrated that cells acutely exposed to the putative long-chain acyl-CoA synthetase inhibitor Adipo C or fatty acid-free BSA reversed basal insulin hypersecretion and supports a role for lipids mediating the adverse effect. T2D patients with obesity have a similar physiologically elevated fasting blood glucose and lipid. Thus, our findings suggest lowering lipid levels in ß-cells may have therapeutic potential in treating hyperinsulinemia leading to T2D.

Adenomas que se desenvolvem a partir da linhagem corticotrófica (corticotropinomas) secretam ACTH (hormônio adrenocorticotrófico) de modo autônomo. Esta secreção induz a produção crônica e excessiva de cortisol, pelo córtex das glândulas suprarrenais, caracterizando a doença de Cushing (DC). A grande maioria dos adenomas visível à ressonância magnética é microadenoma ( < 10 mm) e apenas 10-30 % dos indivíduos com DC possuem macroadenomas ( > 10 mm), enquanto macroadenomas invasivos são considerados raros. Para investigar os diferentes fenótipos destes tumores, estudamos o padrão de expressão gênica entre microadenomas e macroadenomas, incluindo como critério de classificação sua capacidade de invasão. Utilizando a metodologia de microarray, estudamos 12 amostras de corticotropinomas de indivíduos com diagnóstico clínico, laboratorial e histopatológico de DC (microadenomas não-invasivos n = 4, macroadenomas não-invasivos n = 5 e macroadenomas invasivos n = 3). Além disso, foi investigada a presença de mutações do gene USP8. Observamos que micro e macrocorticotropinomas não-invasivos possuem uma assinatura gênica semelhante, com apenas 48 genes diferencialmente expressos entre si. Por outro lado, macroadenomas invasivos apresentaram um perfil de expressão diferencial mais acentuado, com 168 genes diferencialmente expressos em relação aos não-invasivos (ANOVA p-valor < 0,05; fold change cut off = 2; FDR = 0,05). Nenhum dos pacientes apresentou variantes do USP8. Baseado em sua significância de expressão e funcionalidade, destacamos os genes CCND2, ZNF67 (hiper-expressos, DAPK1 e TIMP2 9 (hipo-expressos). A expressão desses transcritos foi validada por QPCR em 15 corticotropinomas não-invasivos e 3 invasivos, onde 28% destes tumores apresentou mutações somáticas para o gene da USP8. Dentre as vias biológicas comprometidas com pelo menos dois genes hipo ou hiperexpressos estão: via do receptor de Vitamina D, TGF-beta, sinalização por proteína G, resposta ao dano no DNA e controle do ciclo celular. Nossos resultados podem ser úteis para identificar novos marcadores envolvidos no fenótipo invasivo dos corticotropinomas clinicamente ativos. Apesar das funções específicas destes potenciais marcadores ainda precisarem ser elucidadas nos corticotropinomas, nossos resultados podem apresentar um impacto positivo na escolha e eficácia terapêutica, no prognóstico e na previsão de recorrência destes tumores / Adenomas that develop from the corticotrophic lineage (corticotrophinomas) secrete ACTH (adrenocorticotropic hormone) autonomously. This secretion leads to chronic and excessive production of cortisol, by the cortex of the adrenal glands, featuring Cushing\'s disease (CD). Most of the adenomas visible to the MRI are microadenomas (< 10 mm) and macroadenomas (> 10 mm) occur in only 10-30 % of individuals with CD, while invasive macroadenomas, although rare, have great clinical relevance. To investigate the different phenotypes of these tumors, we studied the pattern of differential gene expression between microadenomas and macroadenomas, including their invasiveness as classification a criterion. Using DNA microarray methodology, we studied 12 samples of corticotrophinomas of patients with clinical, laboratory and histopathologic diagnosis of CD (non-invasive microadenomas n = 4, non-invasive macroadenomas n = 5 and invasive macroadenomas n=3). In addition, we investigated the presence of USP8 mutations. We observed that non-invasive corticotrophinomas have a similar genic signature with each other, with only 48 genes differentially expressed between them. Moreover, invasive macroadenomas showed a more pronounced differential expression profile, with 168 differentially expressed genes compared to sellar corticotrophinomas (ANOVA p value < 0.05; fold change cut-off = 2; FDR = 0.05). None of them exhibited USP8 variants. Based on expression significance and functionality, we highlighted CCND2, ZNF676 (overexpressed), DAPK1 and TIMP2 (underexpressed). These results were validated through alfaRT-PCR in another cohort of 15 sellar and 3 invasive corticotrophinomas, in which 28% of these tumors harbored USP8 somatic mutations. Among the biological pathways committed with at least two under or overexpressed genes are: Vitamin D receptor pathway, TGF-beta, G-protein signaling, response to DNA damage and control of the cell cycle. Our results can be useful to identify new markers involved in the invasive phenotype of clinically active corticotrophinomas. Although the specific functions of these potential markers still need to be elucidated in corticotropinomas, our results may have a positive impact on choice and therapeutic efficacy, prognosis and prediction of recurrence of these tumors

Adenomas que se desenvolvem a partir da linhagem corticotrófica (corticotropinomas) secretam ACTH (hormônio adrenocorticotrófico) de modo autônomo. Esta secreção induz a produção crônica e excessiva de cortisol, pelo córtex das glândulas suprarrenais, caracterizando a doença de Cushing (DC). A grande maioria dos adenomas visível à ressonância magnética é microadenoma ( < 10 mm) e apenas 10-30 % dos indivíduos com DC possuem macroadenomas ( > 10 mm), enquanto macroadenomas invasivos são considerados raros. Para investigar os diferentes fenótipos destes tumores, estudamos o padrão de expressão gênica entre microadenomas e macroadenomas, incluindo como critério de classificação sua capacidade de invasão. Utilizando a metodologia de microarray, estudamos 12 amostras de corticotropinomas de indivíduos com diagnóstico clínico, laboratorial e histopatológico de DC (microadenomas não-invasivos n = 4, macroadenomas não-invasivos n = 5 e macroadenomas invasivos n = 3). Além disso, foi investigada a presença de mutações do gene USP8. Observamos que micro e macrocorticotropinomas não-invasivos possuem uma assinatura gênica semelhante, com apenas 48 genes diferencialmente expressos entre si. Por outro lado, macroadenomas invasivos apresentaram um perfil de expressão diferencial mais acentuado, com 168 genes diferencialmente expressos em relação aos não-invasivos (ANOVA p-valor < 0,05; fold change cut off = 2; FDR = 0,05). Nenhum dos pacientes apresentou variantes do USP8. Baseado em sua significância de expressão e funcionalidade, destacamos os genes CCND2, ZNF67 (hiper-expressos, DAPK1 e TIMP2 9 (hipo-expressos). A expressão desses transcritos foi validada por QPCR em 15 corticotropinomas não-invasivos e 3 invasivos, onde 28% destes tumores apresentou mutações somáticas para o gene da USP8. Dentre as vias biológicas comprometidas com pelo menos dois genes hipo ou hiperexpressos estão: via do receptor de Vitamina D, TGF-beta, sinalização por proteína G, resposta ao dano no DNA e controle do ciclo celular. Nossos resultados podem ser úteis para identificar novos marcadores envolvidos no fenótipo invasivo dos corticotropinomas clinicamente ativos. Apesar das funções específicas destes potenciais marcadores ainda precisarem ser elucidadas nos corticotropinomas, nossos resultados podem apresentar um impacto positivo na escolha e eficácia terapêutica, no prognóstico e na previsão de recorrência destes tumores / Adenomas that develop from the corticotrophic lineage (corticotrophinomas) secrete ACTH (adrenocorticotropic hormone) autonomously. This secretion leads to chronic and excessive production of cortisol, by the cortex of the adrenal glands, featuring Cushing\'s disease (CD). Most of the adenomas visible to the MRI are microadenomas (< 10 mm) and macroadenomas (> 10 mm) occur in only 10-30 % of individuals with CD, while invasive macroadenomas, although rare, have great clinical relevance. To investigate the different phenotypes of these tumors, we studied the pattern of differential gene expression between microadenomas and macroadenomas, including their invasiveness as classification a criterion. Using DNA microarray methodology, we studied 12 samples of corticotrophinomas of patients with clinical, laboratory and histopathologic diagnosis of CD (non-invasive microadenomas n = 4, non-invasive macroadenomas n = 5 and invasive macroadenomas n=3). In addition, we investigated the presence of USP8 mutations. We observed that non-invasive corticotrophinomas have a similar genic signature with each other, with only 48 genes differentially expressed between them. Moreover, invasive macroadenomas showed a more pronounced differential expression profile, with 168 differentially expressed genes compared to sellar corticotrophinomas (ANOVA p value < 0.05; fold change cut-off = 2; FDR = 0.05). None of them exhibited USP8 variants. Based on expression significance and functionality, we highlighted CCND2, ZNF676 (overexpressed), DAPK1 and TIMP2 (underexpressed). These results were validated through alfaRT-PCR in another cohort of 15 sellar and 3 invasive corticotrophinomas, in which 28% of these tumors harbored USP8 somatic mutations. Among the biological pathways committed with at least two under or overexpressed genes are: Vitamin D receptor pathway, TGF-beta, G-protein signaling, response to DNA damage and control of the cell cycle. Our results can be useful to identify new markers involved in the invasive phenotype of clinically active corticotrophinomas. Although the specific functions of these potential markers still need to be elucidated in corticotropinomas, our results may have a positive impact on choice and therapeutic efficacy, prognosis and prediction of recurrence of these tumors

O hipercortisolismo ACTH-dependente (HAD), também chamado de doença de Cushing, é uma das endocrinopatias mais comumente diagnosticadas na espécie canina. A sintomatologia clínica ocorre, secundariamente, aos efeitos gliconeogênicos, catabólicos, antiinflamatórios e imunossupressores dos glicocorticóides sobre vários sistemas orgânicos. Há uma marcante predisposição da doença na raça poodle e casos familiais têm sido diagnosticados sugerindo uma causa genética. As alterações moleculares que levam ao desenvolvimento do HAD em cães permanecem indefinidas. Dentre os genes implicados no desenvolvimento dos corticotrofos e na regulação do eixo corticotrófico, destacam-se o Tbx19 e o Crhr1, respectivamente. O Tbx19 é um fator de transcrição obrigatório para a transcrição do gene da proopiomelanocortina (POMC) e para a diferenciação terminal dos corticotrofos. Como está presente, exclusivamente, em corticotrofos normais e adenomatosos, foi proposto seu envolvimento na secreção excessiva de ACTH na doença de Cushing. A presença de CRHR1 nos corticotrofinomas na espécie humana e canina levantou a hipótese da sua participação na tumorigênese hipofisária, promovendo uma estimulação celular prolongada, mesmo na ausência de hormônios hipotalâmicos. Um aumento da expressão do CRHR1 foi demonstrado nos tumores corticotróficos, apesar da secreção autônoma de ACTH e dos níveis portais suprimidos de CRH em pacientes humanos e caninos com doença de Cushing. Os objetivos do presente trabalho foram pesquisar a presença de mutações germinativas nas regiões codificadoras dos genes Tbx19 e Crhr1 em cães com HAD. Para tanto, estudamos 50 cães da raça poodle com hipercortisolismo ACTH-dependente (33 fêmeas e 17 machos), com idade média de 8,71 anos e 50 cães controle da mesma raça (32 fêmeas e 18 machos) com idade superior a 6 anos (média de 9,38 anos) e sem endocrinopatias. O DNA genômico foi extraído e amplificado através da reação de polimerização em cadeia (PCR), utilizando-se oligonucleotídeos (primers) específicos para os genes Tbx19 e Crhr1. Foi identificada uma nova variante alélica tanto no Tbx19 como no Crhr1, ambas não descritas na literatura. No gene Tbx19, a variante p. S343G foi encontrada em dois cães não aparentados, mas também em dois controles normais, sugerindo tratar-se de um novo polimorfismo. Já a variante p. V97M do Crhr1 foi encontrada, em heterozigose em um animal com HAD, porém não foi observada em cem alelos normais. O códon 97 está localizado no domínio extracelular aminoterminal do gene Crhr1, de extrema importância para a ligação com alta afinidade ao ligante. O estudo molecular da estrutura quartenária da proteína mutada, seguido da avaliação da energia de ligação da superfície de contato entre o hormônio e o receptor revelou um rearranjo estrutural com alteração da superfície de contato entre o CRH e o seu receptor CRHR1, resultando em uma energia de ligação 17% superior à do receptor selvagem. Em conclusão, esse estudo não identificou alterações no gene Tbx19 associadas ao hipercortisolismo ACTH-dependente canino, mas por outro lado, identificou pela primeira vez, uma mutação ativadora no Crhr1, provavelmente responsável pelo hipercortisolismo ACTH-dependente em um cão da raça poodle. / The ACTH-dependent hypercortisolism (ADH), also called Cushing\'s disease, is one of the most commonly diagnosed endocrine diseases in dogs. The symptoms occur due to glucocorticoids excess leading to gluconeogenic, catabolic, anti-inflammatory and immunosuppressive effects in multiple organs and systems. There is a high incidence of Cushing\'s disease in Poodles and familial disease has been identified suggesting a genetic involvement. The molecular changes that lead to the development of ACTH-dependent hypercortisolism in dogs remain undefined. Among genes implicated in corticotroph development and in corticotropic axis regulation, we would like to point out Tbx19 and Crhr1, respectively. Tbx19 gene is a transcription factor required for transcription of the proopiomelanocortin gene and for terminal differentiation of the corticotroph. Inactivating mutations in that gene are associated with human isolated ACTH deficiency. Since Tbx19 is present exclusively in normal and adenomatous corticotroph cells, its involvement in the secretion of ACTH in Cushing\'s disease was proposed. The presence of CRHR1 in corticotrophinomas in humans and dogs raised the possibility of its involvement in pituitary tumorigenesis, promoting prolonged cell stimulation, even in the absence of hypothalamic hormones. An increased expression of the CRHR1 mRNA was demonstrated in human and canine ACTH-secreting pituitary adenomas, despite the autonomous ACTH secretion and the low portal levels of CRH. The aim of this study was to investigate Tbx19 and Crhr1 coding region mutations in Poodle dogs with ACTH-dependent hypercortisolism. We studied 50 Poodle dogs with ADH (33 females and 17 males) with a mean age of 8.71 years and 50 control dogs of the same breed (32 females and 18 males) older than 6 years (mean 9.38 years) and without endocrinopathies. Genomic DNA was extracted from peripheral blood, amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using specific intronic primers and submitted to automatic sequence. We identified a new allelic variant in the Tbx19 and Crhr1 coding regions. The allelic variant p. S343G in the Tbx19 gene was found in two unrelated dogs, but also in two normal controls, suggesting that this is a new polymorphism. The Crhr1 allelic variant p. V97M was found in heterozygosity in one animal with ACTH-dependent hypercortisolism, but was not observed in one hundred normal alleles. The codon 97 is located in the extracellular amino terminal domain of the Crhr1 and is extremely important for high affinity ligand binding. The molecular analysis of the quaternary structure of normal and mutated proteins, followed by evaluation of the binding energy of the contact surface between the hormone and the receptor showed a structural rearrangement of the mutated protein by changing the contact surface between the CRH and its receptor CRHR1, resulting in a binding energy 17% higher than the wild type. In conclusion, this study did not identify Tbx19 mutations associated with canine ACTH-dependent hypercortisolism, but on the other hand, we first identified a Crhr1 gain-of-function mutation probably responsible for ACTH-dependent hypercortisolism in a Poodle dog of our cohort.

O cetoconazol, inicialmente descrito como um agente antifúngico, revelou-se um potente inibidor da esteroidogênese adrenal, podendo, assim, ser utilizado no manejo da doença de Cushing, como terapia primária ou após insucesso cirúrgico, enquanto aguarda o efeito da radioterapia. Durante o tratamento com cetoconazol, uma redução dos níveis de cortisol é observada, usualmente não acompanhada por uma elevação do ACTH plasmático, como poderia ser esperada. Este fenômeno paradoxal, caracterizado pela redução do cortisol com níveis de ACTH inadequadamente normais ou não elevados, pode estar relacionado a uma ação adicional do cetoconazol nas células hipofisárias produtoras de ACTH. Para se testar essa hipótese, alguns estudos in vitro realizados na década de 80, avaliando a secreção de ACTH na vigência do cetoconazol, sugeriram a sua ação em células adenohipofisárias. Em adição, foi evidenciado que o cetoconazol ativou vias de apoptose em linhagens tumorais não hipofisárias. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito in vitro do cetoconazol na viabilidade celular e na expressão de genes envolvidos na apoptose e replicação do DNA em linhagens tumorais hipofisárias imortalizadas corticotróficas (AtT-20), gonadotróficas (alfaT3.1), mamossomatotróficas (GH3) e mamotróficas (MMQ), utilizando-se a técnica de RT-qPCR. Os resultados mostraram que, na presença do cetoconazol, ocorreu uma redução da viabilidade celular nas linhagens hipofisárias, de forma concentração-dependente, às custas do estímulo da via extrínseca e intrínseca da apoptose, com aumento da expressão dos receptores de morte celular (ex.: Fas, TNFR) e/ou caspases (ex.: -2, -3, -6 ,-7 ,-9). Estes resultados foram associados a um aumento da expressão gênica dos inibidores do ciclo celular p21 (nas linhagens GH3 e alfaT3.1) e p27 (nas linhagens GH3 e MMQ), com uma redução acentuada da expressão destes genes após retirada do cetoconazol do meio de cultura. Concluímos que o cetoconazol tem o potencial de reduzir a viabilidade celular em linhagens tumorais hipofisárias possivelmente devido a uma ação citotóxica (pelo aumento de genes pró-apoptóticos) e citostática (pelo aumento de genes inibidores do ciclo celular) / Ketoconazole, initially described as an antifungal agent, proved to be a potent inhibitor of steroidogenesis, allowing its use in the management of Cushing\'s disease as primary or after unsuccessfully surgery and waiting the effect of radiotherapy. During treatment with ketoconazole, there a reduction in the cortisol levels is observed, usually not accompanied by an elevation of plasmatic ACTH, as could be expected. This paradoxical phenomenon, characterized by reduced cortisol with ACTH levels inappropriately normal or not elevated, could be related to an additional action of ketoconazole on ACTH-producing pituitary cells. In agreement with this hypothesis, some in vitro studies in the 80\'s, evaluating ACTH secretion in the presence of ketoconazole, suggested its action in pituitary cells. In addition, ketoconazole activated apoptosis pathways in non-pituitary tumor cell lines. Therefore, the present study aims to revisit this topic and evaluate the in vitro effect of ketoconazole on cell viability and expression of genes involved in apoptosis and DNA replication by RT-qPCR in immortalized pituitary tumoral corticotroph (AtT-20), gonadotroph (alphaT3.1), mammosomatotroph (GH3), mammotroph (MMQ) cell line. As a result, there was a reduction in pituitary cell viability with ketoconazole, in a concentration-dependent manner, due to stimulation of the extrinsic and intrinsic pathway of apoptosis, with increased expression of cell death receptors (eg. Fas, TNFR) and/or caspases (eg. -2, -3, -6, -7, -9). These results were associated with an increased gene expression of the cell cycle inhibitors p21 (in GH3 and alphaT3.1 cell line), and also p27 (in GH3 and MMQ cell line), with a significant reduction in the expression of these genes after removal of ketoconazole in the media. In conclusion, the ketoconazole have the potential of reduce cell viability in pituitary tumoral lineages possibly due to a cytotoxic effect (by increasing of pro-apoptotic genes) and cytostatic (by increasing of inhibitors of cell cycle genes)

O hipercortisolismo ACTH-dependente (HAD), também chamado de doença de Cushing, é uma das endocrinopatias mais comumente diagnosticadas na espécie canina. A sintomatologia clínica ocorre, secundariamente, aos efeitos gliconeogênicos, catabólicos, antiinflamatórios e imunossupressores dos glicocorticóides sobre vários sistemas orgânicos. Há uma marcante predisposição da doença na raça poodle e casos familiais têm sido diagnosticados sugerindo uma causa genética. As alterações moleculares que levam ao desenvolvimento do HAD em cães permanecem indefinidas. Dentre os genes implicados no desenvolvimento dos corticotrofos e na regulação do eixo corticotrófico, destacam-se o Tbx19 e o Crhr1, respectivamente. O Tbx19 é um fator de transcrição obrigatório para a transcrição do gene da proopiomelanocortina (POMC) e para a diferenciação terminal dos corticotrofos. Como está presente, exclusivamente, em corticotrofos normais e adenomatosos, foi proposto seu envolvimento na secreção excessiva de ACTH na doença de Cushing. A presença de CRHR1 nos corticotrofinomas na espécie humana e canina levantou a hipótese da sua participação na tumorigênese hipofisária, promovendo uma estimulação celular prolongada, mesmo na ausência de hormônios hipotalâmicos. Um aumento da expressão do CRHR1 foi demonstrado nos tumores corticotróficos, apesar da secreção autônoma de ACTH e dos níveis portais suprimidos de CRH em pacientes humanos e caninos com doença de Cushing. Os objetivos do presente trabalho foram pesquisar a presença de mutações germinativas nas regiões codificadoras dos genes Tbx19 e Crhr1 em cães com HAD. Para tanto, estudamos 50 cães da raça poodle com hipercortisolismo ACTH-dependente (33 fêmeas e 17 machos), com idade média de 8,71 anos e 50 cães controle da mesma raça (32 fêmeas e 18 machos) com idade superior a 6 anos (média de 9,38 anos) e sem endocrinopatias. O DNA genômico foi extraído e amplificado através da reação de polimerização em cadeia (PCR), utilizando-se oligonucleotídeos (primers) específicos para os genes Tbx19 e Crhr1. Foi identificada uma nova variante alélica tanto no Tbx19 como no Crhr1, ambas não descritas na literatura. No gene Tbx19, a variante p. S343G foi encontrada em dois cães não aparentados, mas também em dois controles normais, sugerindo tratar-se de um novo polimorfismo. Já a variante p. V97M do Crhr1 foi encontrada, em heterozigose em um animal com HAD, porém não foi observada em cem alelos normais. O códon 97 está localizado no domínio extracelular aminoterminal do gene Crhr1, de extrema importância para a ligação com alta afinidade ao ligante. O estudo molecular da estrutura quartenária da proteína mutada, seguido da avaliação da energia de ligação da superfície de contato entre o hormônio e o receptor revelou um rearranjo estrutural com alteração da superfície de contato entre o CRH e o seu receptor CRHR1, resultando em uma energia de ligação 17% superior à do receptor selvagem. Em conclusão, esse estudo não identificou alterações no gene Tbx19 associadas ao hipercortisolismo ACTH-dependente canino, mas por outro lado, identificou pela primeira vez, uma mutação ativadora no Crhr1, provavelmente responsável pelo hipercortisolismo ACTH-dependente em um cão da raça poodle. / The ACTH-dependent hypercortisolism (ADH), also called Cushing\'s disease, is one of the most commonly diagnosed endocrine diseases in dogs. The symptoms occur due to glucocorticoids excess leading to gluconeogenic, catabolic, anti-inflammatory and immunosuppressive effects in multiple organs and systems. There is a high incidence of Cushing\'s disease in Poodles and familial disease has been identified suggesting a genetic involvement. The molecular changes that lead to the development of ACTH-dependent hypercortisolism in dogs remain undefined. Among genes implicated in corticotroph development and in corticotropic axis regulation, we would like to point out Tbx19 and Crhr1, respectively. Tbx19 gene is a transcription factor required for transcription of the proopiomelanocortin gene and for terminal differentiation of the corticotroph. Inactivating mutations in that gene are associated with human isolated ACTH deficiency. Since Tbx19 is present exclusively in normal and adenomatous corticotroph cells, its involvement in the secretion of ACTH in Cushing\'s disease was proposed. The presence of CRHR1 in corticotrophinomas in humans and dogs raised the possibility of its involvement in pituitary tumorigenesis, promoting prolonged cell stimulation, even in the absence of hypothalamic hormones. An increased expression of the CRHR1 mRNA was demonstrated in human and canine ACTH-secreting pituitary adenomas, despite the autonomous ACTH secretion and the low portal levels of CRH. The aim of this study was to investigate Tbx19 and Crhr1 coding region mutations in Poodle dogs with ACTH-dependent hypercortisolism. We studied 50 Poodle dogs with ADH (33 females and 17 males) with a mean age of 8.71 years and 50 control dogs of the same breed (32 females and 18 males) older than 6 years (mean 9.38 years) and without endocrinopathies. Genomic DNA was extracted from peripheral blood, amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using specific intronic primers and submitted to automatic sequence. We identified a new allelic variant in the Tbx19 and Crhr1 coding regions. The allelic variant p. S343G in the Tbx19 gene was found in two unrelated dogs, but also in two normal controls, suggesting that this is a new polymorphism. The Crhr1 allelic variant p. V97M was found in heterozygosity in one animal with ACTH-dependent hypercortisolism, but was not observed in one hundred normal alleles. The codon 97 is located in the extracellular amino terminal domain of the Crhr1 and is extremely important for high affinity ligand binding. The molecular analysis of the quaternary structure of normal and mutated proteins, followed by evaluation of the binding energy of the contact surface between the hormone and the receptor showed a structural rearrangement of the mutated protein by changing the contact surface between the CRH and its receptor CRHR1, resulting in a binding energy 17% higher than the wild type. In conclusion, this study did not identify Tbx19 mutations associated with canine ACTH-dependent hypercortisolism, but on the other hand, we first identified a Crhr1 gain-of-function mutation probably responsible for ACTH-dependent hypercortisolism in a Poodle dog of our cohort.

O cetoconazol, inicialmente descrito como um agente antifúngico, revelou-se um potente inibidor da esteroidogênese adrenal, podendo, assim, ser utilizado no manejo da doença de Cushing, como terapia primária ou após insucesso cirúrgico, enquanto aguarda o efeito da radioterapia. Durante o tratamento com cetoconazol, uma redução dos níveis de cortisol é observada, usualmente não acompanhada por uma elevação do ACTH plasmático, como poderia ser esperada. Este fenômeno paradoxal, caracterizado pela redução do cortisol com níveis de ACTH inadequadamente normais ou não elevados, pode estar relacionado a uma ação adicional do cetoconazol nas células hipofisárias produtoras de ACTH. Para se testar essa hipótese, alguns estudos in vitro realizados na década de 80, avaliando a secreção de ACTH na vigência do cetoconazol, sugeriram a sua ação em células adenohipofisárias. Em adição, foi evidenciado que o cetoconazol ativou vias de apoptose em linhagens tumorais não hipofisárias. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito in vitro do cetoconazol na viabilidade celular e na expressão de genes envolvidos na apoptose e replicação do DNA em linhagens tumorais hipofisárias imortalizadas corticotróficas (AtT-20), gonadotróficas (alfaT3.1), mamossomatotróficas (GH3) e mamotróficas (MMQ), utilizando-se a técnica de RT-qPCR. Os resultados mostraram que, na presença do cetoconazol, ocorreu uma redução da viabilidade celular nas linhagens hipofisárias, de forma concentração-dependente, às custas do estímulo da via extrínseca e intrínseca da apoptose, com aumento da expressão dos receptores de morte celular (ex.: Fas, TNFR) e/ou caspases (ex.: -2, -3, -6 ,-7 ,-9). Estes resultados foram associados a um aumento da expressão gênica dos inibidores do ciclo celular p21 (nas linhagens GH3 e alfaT3.1) e p27 (nas linhagens GH3 e MMQ), com uma redução acentuada da expressão destes genes após retirada do cetoconazol do meio de cultura. Concluímos que o cetoconazol tem o potencial de reduzir a viabilidade celular em linhagens tumorais hipofisárias possivelmente devido a uma ação citotóxica (pelo aumento de genes pró-apoptóticos) e citostática (pelo aumento de genes inibidores do ciclo celular) / Ketoconazole, initially described as an antifungal agent, proved to be a potent inhibitor of steroidogenesis, allowing its use in the management of Cushing\'s disease as primary or after unsuccessfully surgery and waiting the effect of radiotherapy. During treatment with ketoconazole, there a reduction in the cortisol levels is observed, usually not accompanied by an elevation of plasmatic ACTH, as could be expected. This paradoxical phenomenon, characterized by reduced cortisol with ACTH levels inappropriately normal or not elevated, could be related to an additional action of ketoconazole on ACTH-producing pituitary cells. In agreement with this hypothesis, some in vitro studies in the 80\'s, evaluating ACTH secretion in the presence of ketoconazole, suggested its action in pituitary cells. In addition, ketoconazole activated apoptosis pathways in non-pituitary tumor cell lines. Therefore, the present study aims to revisit this topic and evaluate the in vitro effect of ketoconazole on cell viability and expression of genes involved in apoptosis and DNA replication by RT-qPCR in immortalized pituitary tumoral corticotroph (AtT-20), gonadotroph (alphaT3.1), mammosomatotroph (GH3), mammotroph (MMQ) cell line. As a result, there was a reduction in pituitary cell viability with ketoconazole, in a concentration-dependent manner, due to stimulation of the extrinsic and intrinsic pathway of apoptosis, with increased expression of cell death receptors (eg. Fas, TNFR) and/or caspases (eg. -2, -3, -6, -7, -9). These results were associated with an increased gene expression of the cell cycle inhibitors p21 (in GH3 and alphaT3.1 cell line), and also p27 (in GH3 and MMQ cell line), with a significant reduction in the expression of these genes after removal of ketoconazole in the media. In conclusion, the ketoconazole have the potential of reduce cell viability in pituitary tumoral lineages possibly due to a cytotoxic effect (by increasing of pro-apoptotic genes) and cytostatic (by increasing of inhibitors of cell cycle genes)