L'ischémie cérébrale est une pathologie complexe impliquant une cascade de mécanismes cellulaires qui conduisent, entre autres, à une augmentation de l’autophagie dans les neurones. Bien que l’activation de l’autophagie dans l’AVC ischémique soit aujourd’hui un fait avéré, le rôle de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA ; médicament utilisé dans la phase aigüe de l’AVC ischémique et neuromodulateur du système nerveux central) n’a jamais été décrit. Le tPA est une sérine protéase initialement découverte dans le compartiment vasculaire jouant un rôle important dans la fibrinolyse. Mais le tPA est aussi exprimé dans le parenchyme cérébral où il intervient dans le système glutamatergique, la plasticité synaptique et la survie neuronale. Afin de mieux comprendre les effets moléculaires du tPA dans l’autophagie, nous avons utilisé un modèle in vitro d'ischémie cérébrale consistant à sevrer en oxygène et en glucose (OGD) puis à réoxygéner des neurones corticaux primaires murins avec ou sans tPA. Nous avons confirmé, dans un premier temps, que l’OGD induit une autophagie délétère via une diminution de l’axe PI3K/Akt/mTORC1. Nous avons ensuite étudié l’effet du tPA sur l’autophagie induite par l’OGD. Nos résultats démontrent que le tPA protège les neurones de la mort induite par l’OGD en réduisant l’autophagie via l’activation du récepteur du facteur de croissance à l'insuline (IGF-1R, un récepteur tyrosine kinase) et de la voie PI3K/Akt/mTOR. Ce travail de thèse a donc permis de décrire le rôle neuroprotecteur et anti-autophagique du tPA, et d’identifier un nouveau récepteur cible du tPA : IGF-1R. / Cerebral ischemia is a complex pathology involving a cascade of cellular mechanisms leading, among other things, to an increase of neuronal autophagy. The activation of autophagy in ischemic stroke conditions is now well accepted, but the role of tissue-type plasminogen activator (tPA, a drug used in the acute phase of ischemic stroke, and a neuromodulator) on this pathway has never been studied. tPA is a serine protease originally discovered in the vascular compartment, that plays an important role in fibrinolysis. Interestingly, tPA is also expressed in the cerebral parenchyma where it is involved in the glutamatergic neurotransmission, synaptic plasticity and neuronal survival. To better understand molecular effects of tPA on autophagy, we used an in vitro model of cerebral ischemia consisting in an oxygen and glucose deprivation (OGD) followed by reoxygenation, on murine primary cortical neurons with or without tPA. First we reported that OGD enhances deleterious autophagy through the decrease of PI3K/Akt/mTOR pathways. Then, we investigated the effect of tPA on OGD-induced autophagy. Our results demonstrate that tPA protects neurons from OGD-induced death by reducing autophagy through Insulin Growth Factor Receptor (IGF-1R, a tyrosine kinase receptor) and an increase of PI3K/Akt/mTOR pathways. This thesis has made it possible to describe the neuroprotective and anti-autophagic effect of tPA, and to identify a new target receptor for tPA: IGF-1R.

Der IGF1R gehört zur Familie der transmembranären Tyrosinkinaserezeptoren. Als Mediator der biologischen Effekte von IGF1 und IGF2 belegt er eine zentrale Rolle im Zellwachstum und der Zelldifferenzierung. Seit 2003 wurden bis heute über 20, vor allem heterozygote IGF1R Mutationen publiziert. Die erste der bisher zwei veröffentlichten homozygoten IGF1R Mutationen erschien im Jahr 2012. Bis zu diesem Zeitpunkt legten Untersuchungen transgener IGF1R knockout Mäuse eine Unvereinbarkeit solcher Mutationen mit dem Leben nahe. Versuche zeigten, dass die mutationstragenden Mäuse unmittelbar nach Geburt an respiratorischem Versagen starben. Hieraus wurde abgeleitet, dass humane homozygote Mutationsträger mit komplettem Funktionsverlust ebenfalls nicht lebensfähig wären. Ziel dieser Arbeit war die molekularbiologische Aufarbeitung des zum damaligen Zeitpunkt noch einzigartigem homozygoten Trägerstatus der Indexpatientin. Das Interesse lag vor allem auf der Genotyp-Phänotyp Korrelation, da es sich aller Wahrscheinlichkeit nach nicht um einen völligen Funktionsverlust der Allele handeln konnte. Bei dieser Patientin lag eine Missense Mutation – Aminosäureaustausch von Glutamat zu Aspartat an Position 56 des IGF1R – in der ligandenbindenden Domäne L1 vor. Phänotypisch zeigte die Patientin neben ihrem proportionierten Kleinwuchs, ein rundes Puppengesicht mit großen Augen, sehr dichten schwarzen Augenbrauen und einem dichten Kopfhaarwuchs mit einem tiefen nuchalen Haaransatz. Die molekularbiologische Untersuchung dieser Mutation erfolgte sowohl an Hautfibroblasten der Indexpatientin als auch rekombinant in Säugerzellen. Die in vitro Untersuchungen dieser homozygoten IGF1R(E56D) Mutation, legten im Wesentlichen folgende Ergebnisse dar: 1. Die Expression der IGF1R Untereinheiten wurde mittels Immunoblotting untersucht und zeigte im Falle des mutierten Rezeptors eine substantielle Erhöhung des Prorezeptors auf Kosten der reifen α- und β-Untereinheiten. Dies lässt auf eine gestörte Prozessierung in die Rezeptoruntereinheiten schließen. 2. Die IGF1 induzierte Autophosphorylierungskapazität des mutierten Rezeptors, ebenfalls mittels Immunoblot visualisiert, war substantiell verringert. Eine Quantifizierung der pIGF1R Signale auf das Gesamtprotein im Vergleich zur Normalisierung auf den unphosphorylierten IGF1R legte nahe, dass die Aktivierungskinetik des mutierten Rezeptors unverändert ist. Anzunehmen ist, dass aufgrund der fehlerhaften Prozessierung des Prorezeptors der funktionelle IGF1R quantitativ beeinträchtigt ist. 3. Eine Abnahme der Aktivierung der intrazellulären Signalkaskade, die anhand des Signalproteins B/AKT untersucht wurde, konnte nicht in allen untersuchten Zelllinien bestätigt werden. 4. Die Oberflächenexpression des mutationstragenden Rezeptors wurde im Durchflusszytometer untersucht. Einhergehend mit der verminderten Expression reifer IGF1R Untereinheiten war die Oberflächenexpression des Rezeptors signifikant verringert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Mutation quantitative Auswirkung auf die Prozessierung und Oberflächenexpression des IGF1R hat. Im Gegensatz zum völligen Funktionsverlust des Rezeptors im knock-out Mausmodell, bestand hier eine Restaktivität, weshalb man von einem hypomorphen Charakter dieser Mutation spricht. Diese Ergebnisse lassen auf einen kausalen Zusammenhang zwischen der Mutation und dem IGF1-resistenten Phänotyp der Schwestern schließen. Phänotypisch ähneln biallele Mutationsträger den bisher publizierten heterozygoten Individuen. Die biallelen Indexpatienten zeigen allerdings eine ausgeprägtere Hormonresistenz, einen markanteren Wachstumsrückstand und vermehrt Komorbiditäten (z.B. Störungen der Glukosehomöostase). Eine Korrelation dieser Merkmale mit der Lokalisation der Mutation und dem Trägerstatus lässt sich allerdings erst mit der Identifizierung weiterer Patienten endgültig klären.:Inhaltsverzeichnis 2 1.1 Wachstum als lebenslanger Prozess 3 1.2 IGF1 und IGF2 in der pränatalen Wachstumsphase 4 1.3 Die Ätiologie und Pathogenese des Kleinwuchses 5 1.5 Pathologien der somatotropen Achse 8 1.6 Der Insulin-like growth factor 1 Rezeptor 9 1.7 IGF1R Mutationen 13 2 Fragestellung 14 3 Material und Methoden 15 3.1 Patientin 15 3.2 Molekulargenetik 16 3.3 Molekularbiologie 17 3.3.1 Basismethoden 17 3.3.2 Plasmide, Klonierungen und ortsgerichtete Mutagenese 18 3.4 Zellkultur 19 3.4.1 Transiente Transfektion 21 3.4.2 Immunoblotting 21 3.4.3. Durchflusszytometrie 23 4. Ergebnisse 24 4.1 Klinisches Bild und Genotypisierung der Patientin 24 4.2 Expression der IGF1R Untereinheiten 31 4.3 IGF1R Autophosphorylierung und intrazelluläre Signaltransduktion 32 4.4 Oberflächenexpression des IGF1R 37 5. Diskussion 38 5.1 Der homozygote Charakter der Mutation 38 5.2 Die Genotyp-Phänotyp Korrelation 42 6. Zusammenfassung der Arbeit 46 Literaturverzeichnis 48 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 57 Lebenslauf 58 Danksagung 60 7. Anhang 61 7.1 Abbildungsverzeichnis 61 7.2 Tabellenverzeichnis 61 7.3 Abkürzungsverzeichnis 62 7.4 Aminosäurecodes 65

La protéine Klotho (KL) possède des propriétés anti-vieillissement et anti-cancer. Les données cliniques montrent que l’expression de KL est associée à une meilleure survie des patients atteints de liposarcome. De plus, elle est réduite par rapport au tissu sain dans les liposarcomes dédifférenciés (DDLPS), un type de tumeur maligne rare mais de mauvais pronostic. Nos résultats montrent que KL sensibilise les DDLPS aux chimiothérapies (gemcitabine, navitoclax). L’abondance de KL dans les tumeurs pourrait donc servir de biomarqueur pour prédire l’efficacité des chimiothérapies et mettre en place une médecine plus personnalisée. De plus, des médicaments utilisés pour d’autres pathologies et connus pour stimuler l’expression de KL (Cozaar) pourraient être testés en association avec la chimiothérapie. Enfin, inspirés par le mode d’action de KL, nous avons testé la combinaison de la gemcitabine avec le navitoclax, qui s’est révélée très efficace sur les DDLPS. / Klotho (KL) is both an anti-ageing and anti-cancer protein. Analysis of clinical data highlights that high expression of KL is associated with a better overall survival of liposarcoma patients. Moreover, its expression in downregulated in dedifferentiated liposarcomas (DDLPS), a rare type of tumor associated with a poor prognosis due to high chemoresistance. Our results show that KL sensitizes DDLPS cells to chemotherapeutic agents (gemcitabine, navitoclax). So, abundance of KL in tumoral tissues could serve as a biomarker for predicting gemcitabine efficacy and so, could help for establishing personalized therapy. Moreover, drugs increasing KL expression could be tested in combination with chemotherapy. Based on KL mechanism of action, we also highlight that the combination between gemcitabine and navitoclax is very effective for killing DDLPS cells.

Etwa 3-5% der Neugeborenen werden kleinwüchsig geboren. Bei einem Teil dieser Kinder bleibt auch nach der Geburt ein Aufholwachstum aus. Eine prä- und postnatale Wachstumsverzögerung kann neben unmittelbaren Folgen wie zum Beispiel psychosozialen Problemen auch mit Langzeitrisiken im Erwachsenenalter, vor allem Diabetes mellitus und kardiovaskulären Erkrankungen einhergehen. In den letzten 10 Jahren konnten verschiedene Mutationen im Gen des IGF1 Rezeptors (IGF1R) bei Patienten mit Kleinwuchs, Mikrozephalie und erhöhten IGF1-Spiegeln identifiziert werden. Aufgrund eines gestörten IGF1 Signales kommt es hauptsächlich zu einem fehlenden Längenwachstum. Aber auch Funktionen des Glukosestoffwechsels sind bei manchen Patienten gestört. In dieser Arbeit wurde eine solche IGF1R Mutation in der Tyrosinkinasedomäne bei zwei Brüdern und deren Vater nachgewiesen. Auffällig waren neben einem Kleinwuchs und Mikrozephalie auch ein zunehmend gestörter Glukosemetabolismus unter Wachstumshormontherapie. Der IGF1R Gendefekt liegt in einer über Speziesgrenzen hinweg hochkonservierten Region und ließ sich mittels dHPLC und Genotypisierungsuntersuchungen bei über 1200 Kontrollen nicht nachweisen. Zusätzlich machen Vererbungsmodus und klinische Manifestationsform die IGF1R Mutation als Ursache der beobachteten prä- und postnatalen Wachstumsverzögerung sehr wahrscheinlich. Eine aufgezeichnete zunehmende Glukoseintoleranz der IGF1R Mutationsträger unter Wachstumshormontherapie spricht für eine komplexe Mitbeteiligung des IGF1R im Glukosestoffwechsel. Bei der Resequenzierung des AKT1 Gens, einem Haupteffektormolekül des IGF1R, wurden bei 70 kleinwüchsigen Kindern fünf neue Genpolymorphismen identifiziert. Eine die Proteinsequenz verändernde Mutation konnte jedoch ausgeschlossen werden. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die wichtige Funktion des IGF1R im menschlichen Wachstumsprozess und geben Hinweise auf eine mögliche Mitbeteiligung des IGF1R Signalweges bei Störungen des Glukosestoffwechsels.:Inhaltsverzeichnis Bibliographische Beschreibung I. Abkürzungen 1. Einführung 1.1 Epidemiologie und Ätiologie prä- und postnatalen Kleinwuchses 1.2 Das IGF-System im Wachstumsprozess 1.3 Der IGF Typ 1 Rezeptor 1.4 Die Protein Kinase PKBα/AKT1 1.5 Die Rolle des IGF-Systems im Glukosestoffwechsel 2. Das Promotionsprojekt 2.1 Hintergrund und Fragestellung 2.2 Gen-Sequenzierung des AKT1 bei 70 SGA-Kindern 2.2.1 Methoden 2.2.2 Ergebnisse der AKT1 Resequenzierung 2.3 Geno- und phänotypische Charakterisierung der heterozygoten C1248Y IGF Typ 1 Rezeptor Mutation 2.3.1 Patienten und Methoden 2.3.2 Ergebnisse 2.4 Anmerkungen 3. Publikation 4. Zusammenfassung und Interpretation 5. Literaturverzeichnis II. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit III. Lebenslauf IV. Danksagung

Astronauts at are risk of losing 1.0-1.5% of their bone mass for every month they spend in space despite their adherence to high impact exercise training programs and diets high in nutrients, potassium, calcium, and vitamin D, all designed to preserve the skeletal system. This article reviews the basics of bone formation and resorption and details how exposure to microgravity or simulated microgravity affects the structure and function of osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and their mesenchymal and hematologic stem cell precursors. It details the critical roles that insulin-like growth factor-1 and its receptor insulin-like growth factor-1 receptor (GFR1) play in maintaining bone homeostasis and how exposure of bone cells to microgravity affects the function of these growth factors. Lastly, it discusses the potential of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, syncytin-A, sclerostin inhibitors and recombinant IGF-1 as a bone-saving treatment for astronauts in space and during their colonization of the Moon.

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.