La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune inflammatoire. La PR touche les articulations jusqu'à les détruire. Elle est caractérisée par la présence d’anticorps anti protéines citrullinées (ACPA) mais l’auto-antigène n’est toujours pas connu. Dans cette maladie, l’implication de l’immunité adaptative ne fait donc aucun doute mais le rôle de l’immunité innée reste encore flou. Le système du complément joue un rôle important dans l’immunité innée tout comme les récepteurs de type Toll (TLR) qui sont des récepteurs de celle-ci. C1q, par la reconnaissance des ses ligands, active une des voies du complément, la voie classique. Chez les patients atteints de PR, le complément est activé et un dépôt de C1q est retrouvé dans l’articulation. Le TLR9 reconnaît des ADN dérivés de bactéries ou de virus mais une expression à la surface des cellules pourrait conduire à la reconnaissance d’autres motifs comme les signaux de danger (DAMP). D’ailleurs, nous avons montré récemment qu’il existait un TLR9 exprimé à la surface des polynucléaires neutrophiles (PNN). Enfin, il a été mis en évidence récemment un nouveau mécanisme bactéricide effectué par les PNN : la formation de NET (neutrophil extracellular traps). Mais en dehors de leur rôle bactéricide, les NET ont été montrés comme pathogènes dans certaines maladies comme le lupus. Dans ce travail de thèse, je me suis intéressé à l’implication de ces acteurs, NET, C1q et TLR9 dans la PR. Nous avons montré que C1q est indispensable au développement de l’arthrite dans un modèle animal. De plus, l’expression des récepteurs au C1q par les PNN et les monocytes est corrélée à l’activité de la maladie et à l’inflammation. Nous avons montré que les NET représentent une cible pour les ACPA (ce qui en fait des auto-antigènes potentiels dans la PR) et que ces NET sont immunogènes. L’immunogénicité des NET est modulée par C1q. Enfin, il semblerait que le TLR9 ait moins d’importance dans l’arthrite. Par ce travail, nous avons montré l’importance du rôle joué par l’immunité innée dans la PR et ses modèles. / Rheumatoid artthritis (RA) is the most frequent rheumatic disease. This auto-immune disease causes pain and joint destruction. RA has been characterized by adaptative immunity involvement and anti-citrullinated protein antibodies (ACPA) production. Involvement of innate immunity is less investigated. Complement system, part of innate immunity, is activated in RA. C1q activates classical complement pathway by binding its ligands. C1q is found in joint of RA patients. On the other hand Toll-like-receptor (TLR), innate receptors could play a role in RA upon recognition of pathogen-derived DNA (TLR9). Cell surface expression of TLR9 has been reported as potentially pathological, and we describe that polymorphonuclear neutrophils (PMN) express a cell surface TLR9 wich could recognize damage associated molecular pattern (DAMP). Finally, neutrophil extracellular traps (NET) wich are expelled chromatin fiber and represent a physiological response to bacteria, have been reported as pathological in certain circumstances. We investigated the role of those three innate actors in RA. We have shown that C1q is mandatory to develop experimental arthritis and expression of their receptors on RA patient PMN and monocytes is correlated with disease activity and inflammation. We have also shown that NET are immunogenic and this immunogenicity is partly modulated and mediated by C1q. NET might trigger ACPA production in RA. Finally, it seems that involvement of TLR9 is less important in RA. With those experiments we have shown that the involvement of innate immunity in RA is more important than that has been reported so far.

Majorer la tolérance de l’hôte à l’inflammation est un facteur qui pourrait diminuer l’ampleur des lésions tissulaires au cours des pathologies inflammatoires. Dans ce travail, nous rapportons que la molécule clusterine, une protéine chaperonne extracellulaire très conservée et présente dans la plupart des tissus et fluides biologiques, neutralise les effets cytotoxiques de molécules associées à l’inflammation. Le taux sérique de clusterine est diminué chez les patients atteints de certaines maladies inflammatoires, et les souris déficientes en clusterine ont une sensibilité plus importante à l’inflammation. Clusterine interagit avec certaines molécules associées à l’inflammation et forme des complexes qui sont détectés dans le sérum des patients. In vitro, clusterine inhibe la mort cellulaire induite par les molécules associées à l’inflammation. Bien que l’inflammation induise la libération rapide d’un stock préformé contenu dans les polynucléaires neutrophiles et les plaquettes, les taux de clusterine sérique sont abaissés chez l’homme et la souris en contexte inflammatoire. Démontrant la non redondance et le rôle protecteur de clusterine, l’inflammation est majorée chez la souris déficiente en clusterine.Nous concluons que clusterine augmente la tolérance de l’hôte à l’inflammation. / Increasing host tolerance to inflammation may lower the intensity of tissular injury in inflammatory diseases. We report here that clusterin, a conserved extracellular chaperone, present in most tissues and fluids, neutralizes the in vitro and in vivo cytotoxic properties of inflammation-induced molecules. Serum clusterin levels are decreased in patients with some inflammatory diseases and clusterin deficient mice have higher sensibility to inflammation.Clusterin interacts with some inflammation-associated molecules and form complexes that are detected in human serum and, consequently, prevents in vitro cell death induced by these molecules. Although inflammation triggers the rapid release of preformed clusterin stock by neutrophils and platelets, serum clusterin concentrations get down in inflammatory conditions in human and mice. Inflammation is boosted, in vivo and in vitro, using clusterin-deficient mice, showing the non-redundant and major protective roles of clusterin. We conclude that clusterin enhances host tolerance to inflammation.

Lors des infections bactériennes, selon les tissus infectés, et selon la nature des pathogènes, l’organisme répond en mobilisant différents acteurs. Nous avons décidé d’utiliser le modèle du zebrafish ou Danio rério pour étudier la réponse immunitaire innée dans les situations d’infection bactérienne où les phagocytes professionnels ne peuvent pas venir au contact direct des bactéries. Pour cela, j’ai développé un modèle d’infection de la notochorde del’embryon de zebrafish. Lors de l’injection des bactéries dans ce compartiment, les bactéries se retrouvent protégées par une épaisse gaine de collagènes que les phagocytes ne peuvent pas pénétrer. Alors que les mycobactéries,protégées par la gaine de collagène ne sont pas détectées par les phagocytes, les bactéries E. coli sont immédiatement détectées ce qui déclenche une importante inflammation locale autour de la notochorde. Alors que les bactéries E. coli, bien qu’inaccessibles à la phagocytose sont éliminées dans les première 24 heures qui suivent l’injection, l’inflammation dure plusieurs jours.J’ai étudié les mécanismes qui conduisent à cette inflammation persistante et ses conséquences à long terme sur le développement du poisson. J’ai montré le rôle central de la cytokine IL1b dans ce processus, et j’ai développé une lignée transgénique qui permet d’étudier l’induction de cette cytokine in vivo chez le poisson.J’ai ensuite étudié le rôle des deux principales populations de phagocytes dans l’élimination des bactéries E coli. J’ai montré que les macrophages ne sont pas impliqués dans la disparition des bactéries alors que les neutrophiles, bien qu’incapable de pénétrer à l’intérieur de la gaine de collagène sont nécessaires à l’élimination des bactéries.J’ai ensuite montré que la myelopéroxidase et le monoxyde d’azote ne sont pas impliqués dans l’élimination des bactéries alors que les espèces réactives de l’oxygène produites par les neutrophiles sont nécessaires pour éradiquer l’infection. / In bacterial infections, according to the infected tissue and the nature of pathogens, the body responds by mobilizing various actors. I decided to use zebrafish or Danio rerio model to study the innate immune response to bacterial infection in the situations that professional phagocytes cannot come in direct contact with the bacteria. For this, I developed a model of infection in the notochord of zebrafish embryo. Upon injection of bacteria in this compartment, the microbes find themselves protected by the thick collagensheath where the phagocytes cannot penetrate. While mycobacteria are not detected by phagocytes; E. coli bacteria are sensed and a significant local inflammation around the notochord is mounted. The E. coli, although inaccessible to phagocytosis are eliminated within the first 24 hours after injection, the inflammation lasts several days.I studied the mechanisms that lead to this persistent inflammation and its long term consequences on the development of the fish. I showed the central role of the cytokine IL1B in this process, and I developed a transgenic line that allows studying in vivo the induction of this cytokine in fish.I then studied the roles of the two main populations of phagocytes in the elimination of E. coli. I revealed that macrophages are not involved in the removal of bacteria but neutrophils, although unable to penetrate inside the collagen casing, are necessary for the bacterial elimination. I also confirmed that myeloperoxidase and nitrogen monoxide are not involved in the removal of bacteria, rather the reactive oxygen species produced by neutrophils are needed to eradicate the infection.

Dos nos jours, l'évolution croissante des domaines d'application des circuits intégrés impose aux industriels de nouvelles contraintes de conception. Afin de réaliser des circuits électroniques plus denses et plus performants, ils cherchent à faire cohabiter plusieurs types de composants sur des surfaces plus petites et de surcroît, fonctionnant à des fréquences de plus en plus élevées. Cependant, cette cohabitation pourrait générer des problèmes de CEM (compatibilité électromagnétique). Les travaux présentés dans ce mémoire rentrent dans le cadre du projet de recherche SEISME (Simulation de l'Emission et de l'Immunité des Systèmes et Modules Electroniques). Ils décrivent des méthodologies de mesure et de modélisation de’immunité conduite des circuits intégrés complexes comme les mémoires non volatiles ou bien les microcontrôleurs. L'objectif est d'étudier l'influence des changements de composants et de cartes sur le comportement électromagnétique d'un système électronique. Dans cette perspective, afin de valider son utilisation dans le cas des circuits intégrés complexes, une étude détaillée du standard de mesure DPI (Direct Power injection) est d'abord proposée. Basé sur cette dernière, un nouveau prototype de chemin de couplage est réalisé. Ce multiplexeur permet de superposer un signal agresseur à un signal fonctionnel, avec un chevauchement de leurs bandes de fréquences. Ainsi, il est possible d'agresser une broche fonctionnelle (horloge par exemple) d'un circuit intégré pendant son fonctionnement. Ensuite, une procédure de mesure globale d'immunité conduite est présentée. Elle permet de caractériser la susceptibilité conduite des circuits complexes en tenant compte des différents modes de fonctionnement et avec la possibilité d’utiliser un critère d’immunité fonctionnel ou électrique. Grâce à l'application de cette procédure à deux mémoires non volatiles compatibles broche à broche (mêmes caractéristiques mais de deux différents fournisseurs), il est possible de constater l’influence des technologies de fabrication sur l’immunité conduite de ce type de circuits. Par conséquent, l’effet du changement de composant sur le comportement électromagnétique d’un système électronique devient prédictible. Enfin pour la modélisation, deux méthodologies sont proposées. Une au niveau composant et l'autre au niveau carte. La démarche de modélisation au niveau composant repose sur le standard ICIM-CI (Integrated Circuit Immunity Model-Conducted Immunity) et vise à générer un modèle d’immunité simulable et prédictif. Grâce à l'application de cette démarche dans le contexte des mémoires non volatiles, il est possible de prédire leur immunité dans le cas de modification de l’impédance d'entrée par rajout d'éléments de filtrage par exemple. En ce qui concerne la modélisation au niveau carte, une procédure basée sur la proposition de modèle EBIM-CI (Electronic Board Immunity Model-Conducted Immunity) est développée. Elle consiste à générer un modèle d’immunité d’une carte électronique en utilisant les modèles des différents composants qui la constituent. Un cas d’étude a été défini. Le modèle issu de cette approche permet de simuler l’immunité conduite globale du démonstrateur ainsi que de prédire le comportement électromagnétique de ce dernier lors du changement d’un ou plusieurs composants. / Nowadays, the growing evolution of application fields for integrated circuits sets new constraints for designers and manufacturers. Due to continuous technological advances in integrated circuits, those have become smaller, denser and operational at higher frequencies. The miniaturization of integrated circuits has led to the reduction of power consumption and, thus, noise margins. Mixing digital and analog functions inside the same chip also makes electromagnetic interferences (EMis) more likely to spread and cause disturbances. As a result, complex ICs with coexisting different functions represent a challenge from an EMC point of view, as interferences can cause critical functional failures. The work presented in this manuscript falls within the SEISME project which aims, among others, to perform the simulation of both the emission and the immunity of electronic systems and modules at different levels (JC, PCB, equipment, system). More precisely, this work deals with the development of measurement and modeling methodologies for the characterization of the conducted immunity of complex ICs, such as microcontrollers and non-volatile memories. The main goal is to study the effect of component and/or board replacement on the electromagnetic behavior of a complete electronic system. In this context, a thorough study of the Direct Power Injection (DPI) technique is presented, thus validating its use for complex integrated circuits. Based on this study, a new prototype for the disturbance coupling path is proposed. It consists of a multiplexer that enables the superposition of a disturbance signal and a functional one with overlapping frequency bands. Therefore, it is possible to disturb an IC functional pin (a clock for instance) during its operation. Moreover, measurement procedure for conducted immunity is introduced. Its advantage is to make it possible to characterize the immunity of complex ICs by taking into account different operation modes as well as flexible immunity criteria (electrical / functional). Thanks to the application of this methodology for two different, non-volatile, pin-to-pin-compatible memories (having the same characteristics but different manufacturers), the influence of fabrication technology on the conducted immunity of such ICs is better identified and understood. As a consequence, the effect of changing components on the electromagnetic behavior of an electronic system has become predictable. As far as modeling aspects are concerned, two methodologies are presented in this manuscript. The first one deals with the immunity at the component level whereas the other involves board level immunity. At the IC level, the modeling approach is rather based on the ICIM-CI (lntegrated Circuit Immunity Model-Conducted Immunity) draft standard which makes it possible to extract simulation models that can be incorporated within IC design flows. Once applied to the context of non-volatile memories, this approach allows predicting their immunity in the case of modified input impedance, for example. As far as immunity modeling at the board level is concerned, the idea is to make use of ICIM-CI models corresponding to different ICs on the PCB in order to construct an Electronic Board Immunity Model for Conducted Immunity (EBIM-CI). A case study has been defined and the extracted model makes it possible to simulate the demonstrator's global conducted immunity as well as to predict its electromagnetic behavior following the replacement of one or more components.

La compréhension récente des mécanismes impliqués dans l’échappement tumoral au système immunitaire est fondamentale. En effet, cela a permis le développement de nouvelles immunothérapies à l’origine de réponses prolongées chez les patients atteints par plusieurs types de cancers. Cependant, une majorité de patients répondent insuffisamment ou rechutent. Il est donc indispensable d’identifier les mécanismes de résistances aux immunothérapies, et de nouvelles cibles permettant d’augmenter l’activité de ces thérapeutiques.La Neuropiline-1 (Nrp1) est une glycoprotéine transmembranaire indispensable à de nombreux processus physiologiques tels que l’angiogénèse et la guidance axonale. Nous avons montré dans le laboratoire qu’elle était exprimée dans le système immunitaire, lors de la synapse immunologique puis sur les cellules T conventionnelles activées.L’objectif de ce travail était d’étudier le rôle de la Nrp1 dans la réponse anti tumorale des lymphocytes T CD8+ chez la souris et chez l’homme.Nous avons montré que la délétion de Nrp1 sur les cellules T CD8+ murines augmente la réponse anti tumorale et diminue la croissance tumorale. Les cellules T CD8+ murines délétées pour la Nrp1 ont des capacités effectrices augmentées. La Nrp1 ne pouvant pas signaliser de manière autonome, nous avons montré qu’elle forme un complexe avec PD-1 chez la souris et chez l’homme et qu’elle en module son activité. Enfin, nous avons observé un effet synergique entre l’inhibition de Nrp1 et de PD1 chez la souris, ouvrant la possibilité d’une efficacité clinique chez les patients. / T follicular helper (Tfh) cells play an essential role in the development of antigen-specific B cell immunity. Tfh cells regulate the differentiation and survival of activated B cells outside and inside germinal centers (GC) of secondary lymphoid organs. They act through cognate contacts with antigen-presenting B cells, but there is no current marker to specifically identify those Tfh cells which productively interact with B cells. Here we show that neuropilin 1 (Nrp1), a cell surface receptor, is selectively expressed by a subset of Tfh cells in human secondary lymphoid organs. Nrp1 expression on Tfh cells correlates with B cell differentiation in vivo and in vitro, is transient, and can be induced upon co-culture with autologous memory B cells in a cell contact-dependent manner. Comparative analysis of ex vivo Nrp1+ and Nrp1- Tfh cells reveals gene expression modulation during activation. Finally, Nrp1 is expressed by malignant Tfh-like cells in a severe case of angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) associated with elevated terminal B cell differentiation. Thus, Nrp1 is a specific marker of Tfh cells cognate activation in humans, which may prove useful as a prognostic factor and a therapeutic target in neoplastic diseases associated with Tfh cells activity.

TSSP (Protéase à Sérine Spécifique du Thymus) est une protéase exprimée de manière prépondérante dans le thymus par les cellules épithéliales thymiques corticales (cTEC) et par les cellules dendritiques thymiques (tDC). En revanche, TSSP n'est pas exprimée par les cellules dendritiques (DC) en périphérie même après activation par des agonistes de TLR (Toll-like Receptor). L'équipe a précédemment montré que les souris NOD déficientes pour TSSP (NOD TSSP°) sont totalement résistantes au développement du diabète de type 1 (T1D) contrairement aux souris NOD WT qui développent de manière spontanée la pathologie. L'absence de T1D est due à une augmentation de la sélection négative de cellules T CD4 spécifiques de certains antigènes des ilots de Langerhans par les tDC. Ainsi, la déficience en TSSP conduit à l'épuration du répertoire des cellules T CD4 auto-réactifs par des évènements de sélection négative dans le thymus limitant ainsi le développement du T1D. Bien que la fonction précise de TSSP reste inconnue, ces données et des données complémentaires montrent que TSSP dans les tDC limite la présentation de certains antigènes des ilots de Langerhans dans la voie classe II. Nous avons, dans un premier temps, déterminé si le rôle de TSSP peut être généralisé à une autre maladie auto-immune médiée également par les cellules T CD4, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle murin de sclérose en plaque. Nous avons montré que la sévérité de l’EAE induite par immunisation avec le peptide MOG35-55 (Glycoprotéine de l'Oligodendrocyte de la Myéline) est réduite chez les souris NOD TSSP°. La réduction de sévérité chez les souris NOD TSSP° est associée à une augmentation de la délétion des cellules T CD4 spécifiques du peptide MOG35-55. TSSP limiterait la délétion thymique des cellules T CD4 spécifiques de MOG35-55. Ainsi TSSP, en réduisant le répertoire peptidique présenté par les molécules I-Ag7, conduirait à un défaut de tolérance centrale favorisant le développement de maladies auto-immunes. Dans un second temps, l’objectif de mes travaux de thèse a été d'apporter de nouvelles connaissances quant à la fonction de TSSP dans les tDC. L’ensemble des données suggèrent que TSSP limiterait la présentation d’antigènes dans la voie classe II, nous avons donc analysé les capacités d’internalisation et de dégradation des tDC par imagerie en flux. Nous avons montré que TSSP limite spécifiquement l'internalisation de la protéine ovalbumine dans les cellules dendritiques conventionnelles 2 (cDC2) et dans une lignée de DC mais n'affecte pas leurs capacités dégradatives. De plus, la réduction de l’internalisation des antigènes dans les tDC de souris NOD WT est indépendant de l’endocytose médiée par récepteur. Ces données suggèrent que TSSP en réduisant l'internalisation des antigènes pourrait limiter la formation de complexes peptide/CMH II et la présentation antigénique dans la voie classe II. Par ce mécanisme, TSSP induirait un défaut de tolérance centrale et favoriserait le développement de maladies auto-immunes. / TSSP (Thymus Specific Serine Protease) is a protease expressed predominantly in the thymus by thymic epithelial cortical cells (cTEC) and thymic dendritic cells (tDC). In contrast, TSSP is not expressed by dendritic cells (DC) in the periphery even after activation by TLR agonists (Toll-like Receptor). Previous studies showed that TSSP-deficient NOD mice are completely resistant to the development of type 1 diabetes (TD1) whereas NOD WT mice spontaneously develop pathology. The absence of T1D is due to an increase in the negative selection, by tDC, of CD4 T cells specific for certain antigens of the islets of Langerhans. Thus, TSSP deficiency leads to the crippling of the autoreactive CD4 T cells repertoire by negative selection in the thymus limiting the development of T1D. Although the precise function of TSSP remains unknown, these data and complementary data show that TSSP in tDC limits the presentation of certain islet antigens in the class II pathway. At first, the aim of my PhD work was to determine if the role of TSSP can be generalized to another autoimmune disease also mediated by CD4 T cells, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model of multiple sclerosis. We have shown that the severity of EAE induced by immunization with MOG35-55 (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) peptide is reduced in NOD TSSP° mice. Reduced disease severity is linked to increased deletion of MOG35-55 specific CD4 T cells in TSSP-deficient NOD mice. TSSP would limit the thymic deletion of MOG35-55 specific CD4 T cells. Thus, by reducing the peptide repertoire presented by the IAg7 molecules, TSSP would limit central tolerance and favor the development of autoimmune diseases. In continuation, the second objective of my thesis work was to clarify the function of TSSP in tDC. Given the suspected role of TSSP in the class II pathway we analyzed the internalization and degradation capabilities of tDCs by flow imaging. We have shown that TSSP specifically limits the internalization of ovalbumin protein in conventional dendritic cells 2 (cDC2) and in a DC line but does not affect the degradation of endocytosed OVA. The reduction of antigens internalization in the tDC of NOD WT mice is independent of receptor-mediated endocytosis. These data suggest that, by reducing internalization of antigens, TSSP could limit the formation of peptide/MHC II complexes and antigenic presentation in the class II pathway. By this mechanism, TSSP induces a defect of central tolerance and promotes the development of autoimmune diseases

La sclérose en plaques (SP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une neurodégénérescence et une invalidité croissante avec le temps. Au Canada, plus de 100 000 personnes sont atteintes de SP. Plusieurs facteurs peuvent contribuer à l’aggravation de la maladie, mais la cause exacte n’est toujours pas connue. Il est largement admis que les lymphocytes T et B franchissent la barrière hémato-encéphalique et invoquent une attaque inflammatoire contre la myéline du SNC. Le rôle des cellules T et B dans l'auto-immunité du SNC peut être étudié à l'aide d'un modèle animal appelé encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Dans la première partie de la thèse, j'ai utilisé une souris transgénique sur un fond de diabète non obèse (DNO) appelé 1C6, dont les cellules T réagissent spécifiquement à un peptide de la myéline, la glycoprotéine de la myéline provenant des oligodendrocytes 35-55 (MOG[35-55]). Les cellules T CD4 de souris 1C6 mâles et femelles sont différenciées en cellules Th17 et sont transférées de manière adoptive à des souris DNOscid déficientes en lymphocytes. Les cellules 1C6 Th17 mâles sont devenues très pathogéniques par rapport aux femelles et ont induit une maladie évolutive sévère chez les receveurs. Les cellules Th17 des deux sexes présentaient une plasticité phénotypique telle que mesurée par leur expression de la cytokine Th1 classique IFN-©. Cependant, les Th17 mâles affichent une production accrue d’ IFN-© par les cellules Th17 mâles, ce qui est corrélé à la gravité de la maladie chez les souris receveuses. L'utilisation d'un modèle de génotype à quatre noyaux nous a permis de séparer l'effet des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels dans l'EAE. Nous avons découvert qu'un gène de régulation immunitaire dans le chromosome X, appelé Jarid1c, s'est avéré être régulé négativement dans les cellules Th17 mâles ayant causé une plus grande sévérité, ainsi que dans les cellules T CD4+ provenant du sang périphérique d'hommes atteints de SP. Dans la deuxième partie de la thèse, j'ai utilisé une souris transgénique appelée IgH[MOG] sur un fond DNO dont les cellules B sont spécifiques de la protéine MOG. Lors de l'immunisation avec MOG[35-55], les souris IgH[MOG] ont présenté une EAE rapide et létale, qui est corrélée à l'inflammation et à la démyélinisation du système nerveux central de ces souris. Ceci est accompagné par l'infiltration de cellules B et de cellules T dans le système nerveux central. Chez les souris IgH[MOG], les cellules T CD4+ infiltrantes dans le SNC sont devenues très pro-inflammatoires, comme le montre leur production d'IL-17 et de GM-CSF dans le SNC. Par conséquent, nos données fournissent un aperçu des contributions des réponses des cellules T Th17, du sexe masculin et des cellules B dans l'auto-immunité chronique du SNC. À l’avenir, ces travaux pourraient nous permettre d’identifier des molécules et des voies pouvant être ciblées pour le traitement de la SP. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) marked by neurodegeneration and accumulating disability over time. Over 100,000 people in Canada are affected by MS. Multiple factors could contribute to the worsening of the disease and yet the exact cause is still unknown. It is widely accepted that T and B lymphocytes cross the blood-brain barrier and invoke an inflammatory attack against CNS myelin. The role of T and B cells in CNS autoimmunity can be studied using an animal model called experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). In the first part of this thesis, I have used a transgenic mouse on a non-obese diabetic (NOD) background called 1C6 whose T cells possess specificity for a myelin-derived peptide, myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG[35-55]). 1C6 CD4+ T cells from both male and female mice are differentiated into Th17 cells and are adoptively transferred into lymphocyte deficient NOD.Scid mice. Male 1C6 Th17 cells became highly pathogenic compared to the females and induced a severe progressive disease in the recipients. Th17 cells from both sexes exhibited phenotypic plasticity as measured by their expression of the classic Th1 cytokine IFN-©. However, male Th17 display increased production of IFN-© by male Th17 cells and this is correlated with disease severity in recipient mice. The use of four core genotype model has allowed us to segregate the effect of sex hormones and sex chromosomes in EAE. We uncovered an immune regulatory gene in the X chromosome called Jarid1c is found to be downregulated in both male Th17 cells that caused greater severity as well as in CD4+ T cells from the peripheral blood of men with MS. In the second part of the thesis, I utilized a transgenic mouse called IgH[MOG] on a NOD background whose B cells are specific for MOG protein. Upon immunization with MOG[35-55], IgH[MOG] mice displayed a rapid and lethal EAE, which is correlated to the inflammation and demyelination in the CNS of these mice. This is accompanied by the infiltration of B cells and T cells into the CNS. In IgH[MOG] mice, CNSinfiltrating CD4+ T cells became highly proinflammatory as measured by their production of IL-17 and GM-CSF in the CNS. Hence, our data provide insight into the contributions of Th17 T cell responses, male sex and B cells in chronic CNS autoimmunity. In the future, this work may permit us to identify targetable molecules and pathways for the treatment of MS.

Clostridium difficile est une bactérie présente sous formes de spores dans l’environnement qui vont être ingérées par l’hôte puis germer en formes végétatives dans le tube digestif. Les formes végétatives vont coloniser l’hôte grâce à différents facteurs de colonisation. Ensuite, C. difficile va produire des toxines A et B qui vont être responsables des signes cliniques de l’infection.Après ingestion et colonisation par une souche toxinogène, les présentations cliniques sont variables d’un individu à l’autre. Certaines personnes vont rester porteuses asymptomatiques et d’autres peuvent déclarer des formes menaçant le pronostic vital. De plus, un caractère particulier de l’infection à C. difficile (ICD) est la survenue de récidives. Cette variabilité inter-individuelle de réponses de l’hôte à la colonisation par C. difficile est probablement multifactorielle mais elle paraît reposer largement sur le développement d’une réponse immune efficace de l’hôte.De nombreux travaux ont évalué l’intérêt de la réponse immune développée contre les toxines de C. difficile aboutissant à l’élaboration de thérapeutiques par immunisations ciblant les toxines.Cependant, la réponse immune dirigée contre les toxines n’est pas exclusive. Au vu des principaux résultats de l’équipe et de la littérature récente, il semble que le précurseur des protéines de la couche S SlpA et la flagelline FliC soient d’une importance particulière puisque ces protéines interagissent activement avec les cellules de l’immunité innée via les TLR (Toll Like Receptor) et sont immunogènes chez l’Homme.Nous avons donc voulu reposer les bases du développement d’une réponse immune chez un individu naïf en utilisant un modèle murin d’ICD.Nous avons montré qu’après une infection dans ce modèle aussi bien qu’après deux infections itératives, les animaux développaient une réponse de type IgM dirigée contre les toxines avec une commutation de classe en IgG au niveau sérique. Cependant, bien que nous ayons également observé la production d’IgM spécifiquement dirigées contre SlpA ou FliC, les souris n’avaient paradoxalement pas développé d’IgG dirigés contre SlpA ou FliC.Nous avons ensuite décidé de mener des essais d’immunisation chez la souris en se focalisant sur SlpA. Après des immunisations répétées, en présence de la toxine cholérique utilisée comme adjuvant, nous avons mis en évidence une réponse spécifique objectivée par une augmentation des IgG sériques et des IgA mucosales anti-SlpA dans les deux modèles. Cette réponse était associée à une diminution significative des taux de colonisation et un retard au décès des hamsters.Nous avons ensuite montré sur une première cohorte prospective que les patients atteints d’une ICD simple avaient significativement plus d’IgG spécifiques anti-SlpA que les patients récidivant de l’ICD entre 5 et 25 jours après l’infection.Enfin, nous avons également constitué une deuxième cohorte de patients sur la base d’une étude cas-témoins avec des objectifs plus ambitieux notamment de constitution de collections biologiques cliniquement documentée. Parmi les objectifs, l’étude vise à déterminer de la valeur prédictive des anticorps dirigés contre les facteurs de colonisation et les toxines de C. difficile sur l’évolution de l’ICD et notamment les récidives. Les résultats préliminaires concernant les IgG dirigés contre SlpA sur les premiers couples de cas et de leurs témoins permettent de confirmer ceux qui avaient été observées sur la première cohorte. L’ensemble des collections biologiques et des données cliniques associées permettront très rapidement de générer de nombreux résultats pour chacun des antigènes d’intérêt et ouvrent à de nombreuses perspectives en termes de compréhension des processus physiopathologiques et d’études ancillaires sur la réponse immune cellulaire et/ou humorale ou l’étude de marqueurs biologiques prédictifs des formes sévères et/ou récidivantes. / Clostridium difficile is a bacterium found in the environment as spores. It can be ingested by a host and germinate under vegetative forms in the digestive tract. These forms colonize hosts through colonization factors. C. difficile will then produce two toxins (A and B), responsible for clinical signs of infection.Following the ingestion and colonization by a toxigenic strain, a wide spectrum of clinical presentations can occur between individuals. Some will remain asymptomatic carriers when others will develop life-threatening infections. Besides, C. difficile infections (CDI) are specific as they can develop recurrences. These inter-individuals variabilities seem to be multifactorial, though, vastly depending on a host efficient immune response.Studies have assessed the interest of an immune response against C. difficile toxins, leading to immunization therapeutics targeting the toxins.However, immune response against toxins isn’t exclusive. Considering our team findings and recent literature, it seems that the S layer proteins precursor SlpA, as well as the FliC flagellin, have an important role. They indeed actively interact with the innate immunity cells via the TLR (Toll Like Receptor) and are immunogen in Humans.We therefore aimed at laying the foundations of an immune response development in a naïve individual, using a CDI mice model.We demonstrated within this model that further to one or two iterative infections, the animals developed an IgM response against the toxins, with a commutation in IgG at the serum level. However, despite the production of IgM specifically targeting SlpA or FliC, mice didn’t develop IgG against SlpA or FliC.We then decided to conduct immunization assays in mice, focusing on SlpA. After repetitive immunizations with the choleric toxin as an adjuvant, we noticed a specific response, objectified by a growth of serum IgG and anti-SlpA mucosal IgA in both models, as well as a significant decrease in colonization levels and a delay in the hamsters’ death.We showed on a first prospective cohort that patients with simple CDI had significantly more specific anti-SlpA IgG than patients with a CDI recurrence, occurring 5 to 25 days post infection.Finally, we constituted a second cohort of patients with a case-control study. It had more ambitious objectives, including the collection of clinically documented biologic samples. Among the objectives, this study aims at assessing the predictive value of antibodies against C. difficile colonization factors and toxins on the CDI evolution, notably on the recurrences.Preliminary results of IgG against SlpA on the first case-control couples confirm the first cohort observations. The biological collections and associated clinical data will soon enable to generate results for each antigen of interest. It opens new perspectives in terms of understanding of pathophysiological processes, and ancillary studies on the cellular and/or humoral immune response, as well as the study of predictive biological markers of severe forms or recurrences.

Chez l’homme, la primo-infection par le vírus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) a lieu au niveau de la muqueuse oro-pharyngée. Après une phase de réplication, les virions pénètrent les terminaisons axonales et migrent vers le ganglion trijumeau ipsilatéral (TG), puis vers le TG controlatéral. Le virus entre alors dans un état de latence dans les 2 TG. Les réactivations d’HSV-1 dans ces neurones sont responsables des kératites herpétiques (KH), unilatérales et survenant toujours du même côté chez un patient donné.En utilisant un modèle murin oro-oculaire, qui reproduit les aspects essentiels de la maladie chez l’homme, nous avons précédemment démontré que l’inoculation virale latéralisée d’un côté de la bouche entraine une réplication virale dans la lèvre, suivie d’une KH ipsilatérale à l’inoculation 6 jours plus tard. De manière concomitante, le virus se propage aux 2 TG, mais les réactivations ne surviennent que du côté ipsilatéral à l’inoculation. Nous avons également observé qu’après une primo-infection dans une lèvre avec une souche d’HSV-1 non-neurovirulente, les souris étaient protégées contre les signes de la maladie et contre la réactivation d’une souche sauvage pleinement virulente inoculée secondairement dans l’autre lèvre (souche ré-infectante). Afin de comprendre les mécanismes immunitaires en jeu dans cet état de protection, nous avons combiné une analyse en cytométrie en flux multiparamétrique à des tests immunologiques, pour quantifier et définir l’infiltrat immunitaire hématopoïétique et les chémokines inflammatoires au site d’inoculation et dans les TG. Nous avons démontré qu’après une inoculation unique avec la souche sauvage virulente, un infiltrat immun riche en cellules pro-inflammatoires, survenaient de manière retardée dans les lèvres inoculées, et persistaient dans les TG. A l’opposé, l’infiltrat immunitaire était plus précoce dans les tissus réinfectés (après une primo-infection par la souche non neurovirulente), plus riche en cellules de l’immunité adaptative, et associé à des concentrations moindres de chémokines inflammatoires. En outre, cet infiltrat s’estompait plus rapidement, avec une disparition concomitante des chémokines inflammatoires. Ces données permettent de mieux comprendre la nature et la cinétique de la réponse immunitaire anti-HSV-1, et pourront être utiles pour le développement futur de stratégies vaccinales anti-HSV-1. / In humans, Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), primary infection occurs in the oral mucocutaneous tissues. Virions replicated here penetrate sensitive neuronal axons, migrate to both trigeminal ganglion (TG) where it established a lifelong latency. Reactivations of HSV-1 in the TG neurons induce clinical recurrences in the connected peripheral tissues. This process is involved in herpes simplex keratitis (HSK), a condition that, strikingly, occurs almost exclusively in the same eye for a given patient. Based on an experimental oro-ocular (OO) model of HSV-1 infection, that recapitulates most of these human clinical features, we previously demonstrated that a virus inoculation on one side of the mouth, leads to viral replication in the lip, followed by HSK. Virus concomitantly disseminates to both TG, but reactivation only occurs in the TG ipsilateral to the inoculation site. We also observed that after a primary inoculation with a non-neurovirulent strain of HSV-1 in one lip, mice are protected against both acute phase disease and reactivation after a superinfection with a fully virulent wild-type strain of HSV-1 in the contralateral lip.In order to understand the underlying mechanisms involved in this state of protection, we combined high resolution flow cytometry and bead-based immunoassays, to quantify hematopoietic subsets and inflammatory chemokines in the site of inoculation and in the TG. We demonstrated that after a single inoculation with the wild-type strain, a delayed immune infiltrate, boasting more proinflammatory subsets, occurred in the lip and persisted in the TG. In contrast, the immune infiltrate occurred earlier in the superinfected lip and ipsilateral TG, with less inflammatory chemokines but more adaptive immune subsets. Moreover, cellular infiltrate resolved faster, correlating with nullification of inflammatory chemokines locally. These data show that immune response kinetics influence the development of natural immunity to HSV-1, and can be harnessed to protect against disease and reactivations.

Mitochondria are intracellular organelles in control of numerous biological functions (e.g.,from energy supply to steroidogenesis and programmed cell death by apoptosis). Evolutively, mitochondria are considered as derived from the endosymbiosis between an α-proteobacterium and a primitive eukaryotic cell. Due to its origin, the organelle displays prokaryotic motifs such as a circular double-stranded hypomethylated DNA (i.e., mtDNA) and N-formylated peptides. Intact or damaged mitochondria, as well as mitochondrial components may be extruded in the extracellular space upon cell activation or death. These features, as well as several biomolecules localized within the mitochondrion (e.g.,ATP, cytochrome C) are able to be recognized by the innate immune system as mitochondrial damage-associated molecular patterns, thus eliciting a proinflammatory response. A humoral immune response comprising anti-mitochondrial antibodies (AMA) is also described in various autoimmune conditions, such as AMA-M2 in primary biliary cirrhosis (i.e., PBC). Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by the alternance of flares and phases of remission, due to the deposition of antibody-antigen scaffolds (i.e., immune complexes) within tissues, leading to various clinical manifestations (e.g., neuropsychiatric, hematological or dermatological disorders). The antiphospholipid syndrome (i.e., APS) is an autoimmune disease, with thromboembolic and/or obstetrical manifestations, that can either be found alone or along with SLE. While the immunogenicity of cardiolipin (i.e., a phospholipid uniquely synthetized by mitochondria In humans) is well described in SLE and APS (i.e., anticardiolipins), mitochondrial proteins targeted by autoantibodies are still poorly known. The present doctoral thesis follows my masters' project during which I developed ELISAs allowing for the detection of AMA targeting intact mitochondria (i.e., AwMA) or mtDNA (i.e., AmtDNA)¹. The present project aims aims to characterize the mitochondrial immunogenicity in SLE and APS. The University of Toronto Lupus Clinic cohort comprise sera from patients with SLE or APS (n=175 and n=12 respectively). AwMA and AmtDNA levels were assessed in these samples, as well as in sera from healthy volunteers (n=43) or patients with PBC (n=12). I observed that all patients had increased AwMA, compared to healthy individuals. AmtDNA were only increased in SLE patients and were associated with increased past reports of lupus nephritis (p=0.01). These results were published in March 2019 in Scientific Reports². During the acquisition of these data, I observed that patients' sera also presented immunoreactivity against mitochondrial RNA (i.e., mtRNA). I thus adapted my assays to detect autoantibodies against mtRNA (i.e., AmtRNA), and assessed their levels in sera from patients includes in the systemic autoimmune rheumatic disease biobank and data repository (i.e., SARD-BDB. Healthy:n=30, SLE:n=87). AmtRNA were significantly elevated in SLE (IgG: p<0.0001, IgM:p=0.0493). Surprisingly, AmtRNA-IgG were associated with decreased reports of past lupus nephritis (p=0.03) and carotid plaque (p=0.04). This study was published in Frontiers in Immunology in May 2019³. As each AMA assessed displayed biostatistical associations with antiphospholipids, I replicated these protocols, using sera from patients with APS, included in the SARD-BDB (n=27). AmtRNA (IgG:p=0.0005, IgM:p=0.01) and AmtDNA-IgM were increased in APS (p=0.009). However, only AmtDNA-IgM were associated with reports of arterial thromboses (p=0.047). This pilot study was published in Lupus in August 2020⁴. In a a recent study, accepted in Arthritis & Rheumatology in January 2022⁵, we identified by mass spectrometry 1345 proteins associated with AwMA, 431 of with were assigned to the mitochondrial proteome. These results allowed to identify two candidates: C1qBP and Mfn-1. IgGs to C1qBP were increased in (p=0.0167) and associated with positivity to the lupus anticoagulant (p=0.049) in SLE. IgGs against Mfn-1 are interesting candidates for the prediction of the disease (p=0.0052) and are associated with positivity to antiphospholipids (p=0.011) and antibodies against double-stranded DNA (p = 0.0005). These results highlight the immunogenicity of the organelle in SLE and APS. Mitochondrial antigens are interesting candidates for the development of novel clinical assays allowing improved prognosis, diagnosis, or disease stratification, ultimately contributing to the improvement of medical care for people with autoimmune conditions. / Les mitochondries sont des organelles intracellulaires considérées comme issues de l'endosymbiose entre une α-protéobactérie et une cellule eucaryote primitive. L'organelle exprime ainsi des motifs moléculaires en lien avec son origine procaryote tels qu'un ADN hypométhylés (i.e., mtDNA) ou des peptides N-formylés. Des mitochondries ou bien des composantes mitochondriales pourront être libérées dans le milieu extracellulaire lors de différents évènements d'activation ou de mort cellulaire. Ces caractéristiques ainsi que certaines biomolécules, spécifiquement localisées dans la mitochondrie (e.g.,ATP, cytochrome C) auront la capacité d'être reconnues comme des motifs de dangers et de stimuler une réponse proinflammatoire de la part des cellules du système immunitaire inné. Une réponse humorale constituée d'anticorps anti-mitochondriaux (AMA) est connue dans différents troubles auto-immuns tels que les AMA-M2 dans la cirrhose biliaire primitive (PBC). Le lupus érythémateux disséminé (SLE) est une maladie auto-immune caractérisée par une succession de phases d'exacerbation et de rémission dues au dépôt d'enchevêtrements d'autoanticorps et de leurs antigènes dans les tissus, aboutissant à une grande variété de manifestations cliniques (e.g.,manifestations neuropsychiatriques, hématologiques, dermatologiques). Le syndrome des antiphospholipides (APS) est une maladie qui peut être distincte ou associée au SLE et présente des manifestations thromboemboliques et/ou obstétriques. Bien que l'immunogénicité de la cardiolipine (i.e., phospholipide uniquement synthétisée dans la mitochondrie chez l'humain) soit connue dans le cadre du SLE et de l'APS (i.e., anticardiolipines), l'antigénicité des protéines mitochondriales reste encore méconnue. Cette thèse de doctorat fait suite à mes travaux de maîtrise au cours desquels, j'ai développé des ELISAs permettant de mesurer des niveaux des IgGs dirigés contre les mitochondries intactes (i.e., AwMA) et le mtDNA (i.e., AmtDNA)¹. Mon projet de thèse vise à caractériser l'immunogénicité mitochondriale dans l'auto-immunité. La cohorte de la University of Toronto Lupus Clinic regroupe des échantillons d'échantillons de séra de patients souffrant de SLE ou d'APS (n=175 et n=12, respectivement). Les AwMA, et AmtDNA ont été mesurés au sein de ces échantillons ainsi que d'échantillons de volontaires sains (n=43) et de donneurs souffrant de PBC (n=12). Les patients souffrant des trois conditions présentaient une augmentation significative des AwMA par rapport aux contrôles sains. Les AmtDNA, uniquement augmentés chez les patients SLE (p=0.0004) ont été associés à des antécédents accrus de néphrite lupique (p=0.01). Ces résultats ont été publiés en mars 2019 dans le journal Scientific Reports² . Durant ces mesures, j'ai observé que les séra de patients présentaient aussi une immunoréactivité dirigée contre l'ARN mitochondrial (mtRNA). J'ai, par la suite, adapté mes tests pour détecter les AMA dirigés contre le mtRNA (i.e., AmtRNA) et les ai mesurés à l'aide de séra inclus dans la cohorte des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (MRAS. Sains:n=30, SLE:n=87). Les d'AmtRNA sont significativement élevés dans le SLE (IgG:p<0.0001 , IgM:p=0.0493). De façon surprenante, les AmtRNA-IgG sont associés avec des historiques réduits de néphrite lupique (p=0.03) et de plaque carotidienne (p=0.04). Ces travaux ont été publiés dans le journal Frontiers in Immunology en mai 2019³. L'ensemble des AMA mesurés présentant des associations biostatistiques avec différents anticorps antiphospholipides. J'ai répliqué mon protocole sur des échantillons de patients souffrant d'APS, inclus dans la cohorte MRAS (n=27). Les AmtRNA (IgG:p=0.0005, IgM:p=0.01) et les AmtDNA-IgM sont augmentés dans l'APS (p=0.009). Seuls les AmtRNA-IgM sont associées avec une diminution des antécédents de thromboses artérielles (p=0.047). Ce projet a fait l'objet d'un article, publié dans Lupus en aout 2020⁴. Dans une autre étude, acceptée dans le journal Arthritis & Rheumatology en janvier 2022⁵, nous avons identifié, par spectrométrie de masse, 1345 protéines associées aux AwMA dont 431 sont associées avec le protéome mitochondrial. Ces résultats m'ont permis d'identifier deux candidats d'intérêts : C1qBP et Mfn-1. Les anti-C1qBP sont significativement augmentés chez les patients lupiques (p=0.0167) et sont associés avec la positivité pour l'anticoagulant lupique (p=0.049). Les anti-Mfn1 constituent de potentiels candidats pour prédire la maladie (p=0.0052). Ils sont, par ailleurs, associés avec la positivité aux antiphospholipides (p=0.011) et aux anti-ADN double brins (p=0.0005). Ces résultats soulignent l'immunogénicité de la mitochondrie dans le SLE et l'APS. Les AMA et leurs cibles constituent de nouvelles avenues d'intérêt dans la mise au point de nouveaux tests cliniques permettant le diagnostic, le pronostic ou la classification de la maladie afin d'améliorer la prise en charge des patients lupiques.