Dans le cadre de l’étude de la régulation de la synthèse de la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha dans les cellules myéloïdes stimulées aux lipopolysaccharides, nous avons pu mettre en évidence que l’effet anti-inflammatoire du nicotinamide (NAM) sur la production de cette cytokine s’opère au niveau de l’état de phosphorylation de la MAPK p38. Une diminution de la concentration intracellulaire de NAD entraine également une inhibition de la phosphorylation de la MAPK p38 en réponse aux lipopolysaccharides. De plus, une étude pharmacologique plus ciblée suggère que les sirtuines, une famille d’enzymes consommatrices de NAD, sont impliquées dans cette régulation. Nos résultats indiquent que ce processus s’effectuerait par un contrôle de l’expression des gènes mkp-1 et pac-1 codant pour des « dual-phosphatases » modulant l’état de phosphorylation des MAPKs. Enfin, nos données indiquent que l’effet anti-inflammatoire du NAM s’opère aussi par une régulation de l’efficacité traductionnelle du messager du TNF-alpha impliquant un raccourcissement de la queue poly(A) du messager. En conclusion, l’ensemble de nos données montre une complexité importante dans la régulation de la production de TNF-alpha dans les cellules myéloïdes par des enzymes consommatrices de NAD, dont les sirtuines. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

This work allowed the first characterization of the three members of the chloride channel CLC family in T.brucei. The TbCLCs are expressed in the two proliferative stages of the parasite and two of their members appear non-essential. The three TbCLCs act as chloride transporters in X.laevis oocytes and some of their biophysical properties were determined. Furthermore, TbCLC-b appeared to be involved in lysis by the human innate immunity protein apoL-1<p>A novel function of T.brucei adenylate cyclases was discovered in their ability to suppress expression of the innate immunity protein TNF-α. The suppression of the innate response occurs before the first peak of parasitemia and reduces the host ability to control the parasite.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’infection au VIH s’accompagne souvent de dérégulations du compartiment des lymphocytes B qui nuisent à la génération de réponses efficaces. En effet, détectées tôt après l’infection, ces dérégulations perdurent, ne sont pas totalement restaurées par la thérapie, et mènent souvent à des manifestations auto-immunes et lymphomes. Une étude longitudinale de notre groupe, effectuée avec des cellules mononucléées du sang circulant provenant de patients VIH+ avec différents types de progression clinique, a démontré qu’un niveau élevé de BLyS chez des individus VIH+ progresseurs était associé à une dérégulation des fréquences de populations de cellules B avec augmentation de cellules innées de la zone marginale (MZ) présentant des caractéristiques d’immaturité et d’activation. Au contraire, chez des individus VIH+ non-progresseurs avirémiques ou contrôleurs d’élite, les niveaux de BLyS étaient dans la normale et ce sont les fréquences de cellules B MZ plus matures qui étaient diminuées. La résistance au VIH pourrait aussi impliquer le contrôle de BLyS et son impact sur les cellules B. De ce fait, nous avons préalablement recruté une cohorte de travailleuses du sexe (TS) à Cotonou (Bénin) dans laquelle nous avons identifié des femmes qui demeurent séronégatives malgré une exposition soutenue au virus. Nous avons mesuré les niveaux de BLyS dans le sang et dans les lavages cervico-vaginaux (CVL) de TS VIH- et les avons comparés à ceux mesurés chez des TS VIH+ et un groupe contrôle de non-TS VIH- . Nous avons trouvé que les niveaux de BLyS dans le sang et le CVL des TS VIH- étaient inférieurs à ceux des TS VIH+ et des non-TS VIH-. Le niveau d’expression de BLyS à la surface des lymphocytes T, monocytes et cellules dendritiques de TS VIH- était augmenté, mais à un niveau moindre que les TS VIH+. Chez les TS VIH+, les hauts niveaux de BLyS étaient concomitants avec une dérégulation du compartiment B caractérisée par une hyperglobulinémie, une augmentation de la fréquence de populations avec un profil immature/inné et une plus grande proportion de plasmablastes IgG vs IgA. Au contraire, les niveaux inférieurs de BLyS dans le sang des TS VIH- coïncident avec un compartiment B préservé, révélant que les lymphocytes B MZ peuvent être impliqués dans l’immunité naturelle au VIH. Ces résultats démontrent l’importance du contrôle des niveaux de BLyS et du maintien de l’intégrité du compartiment B dans la résistance au VIH. / HIV infection leads to B cell dysregulations that disrupt efficient immune responses. Detected early after infection, these dysregulations are lasting, are not totally resolved by therapy and often lead to auto-immune defects. We have shown that excess BLyS in plasma and on the surface of blood dendritic cells (DC) of HIV-infected progressors coincides with B cell dysregulation and increased frequency of “precursor” innate marginal zone (MZ)-like B cells. In contrast, BLyS levels were normal in elite-controllers and frequency of precursor MZ-like B cells was unaltered. Instead, percentages of MZ-like B-cells presenting a more “mature” profile were decreased in the blood of these individuals, suggesting peripheral recruitment of these cells could be beneficial to the control of disease progression. Based on this, we hypothesize that control of BLyS status and innate B cells could be relevant to the understanding of natural immunity to HIV. We previously established an ongoing cohort of heavily HIV-exposed female commercial sex workers (CSWs) in Cotonou (Benin) and identified individuals who remain HIV-uninfected after several years of active prostitution. Herein, we have measured BLyS levels in the blood and cervico-vaginal lavages (CVLs) of HIV-uninfected CSWs and have compared them to those of HIV-infected CSWs and control uninfected non-CSWs. We found that BLyS levels in the blood and CVLs of HIV-uninfected CSWs were lower when compared to HIV-infected CSWs and even to controls. BLyS surface expression on T-cells, monocytes, and DC of HIV-uninfected CSWs was increased, but to a significantly lower extent than those measured in HIV-infected CSWs, albeit higher than controls. In HIV-infected CSWs, high BLyS levels were concomitant with a dysregulated blood B-cell compartment, characterized by hyperglobulinemia, increased frequency of populations presenting immature and/or innate profiles and a higher proportion of IgG+ than IgA+ plasmablasts. In contrast, contained BLyS levels in the blood of HIV-uninfected CSWs coincided with a rather preserved B-cell compartment, which reveals that “mature” MZ-like B-cells could be involved in natural immunity against HIV. These results highlight the importance of a better understanding of B cell populations and BLyS in the context of HIV resistance.

SUMMARY:<p>The bacterial lipopolysaccharide (LPS)-sensing machinery with the innate immune system receptor Toll-like receptor 4 (TLR4) at its centre has been the subject of extensive research but while TLR4 and myeloid differentiation factor 2 (MD2) were both shown to be essential, the role of other, so-called "accessory", molecules is much less clear. The co-receptor cluster of differentiation 14 (CD14) has been widely perceived as being a mere facilitator for the capture and transfer of LPS to TLR4, until recent studies suggested it might have a determining influence on which TLR4-dependent signaling cascades are triggered in response to LPS. The TLR4 receptor complex was shown to be specifically activated by diC14 amidine, a cationic lipid originally synthesized for its carrier properties. The lipid's immunostimulatory activity extends to both TLR4-dependent signaling cascades, the MyD88 and TRIF pathways.<p>The aim of this work was to gain more insight into how diC14 amidine is able to trigger these cascades and to contribute to the general understanding of the TLR4 machinery and its activation by non-LPS ligands. More precisely we were interested in the role of CD14 in the activation of both MyD88 and TRIF pathways by diC14-amidine and in potential consequences of possible divergent requirements of diC14 amidine and LPS for this co receptor.<p>Our study of the role of the membrane-associated and the soluble form of CD14 in the activation of the TLR4-dependent pathways by diC14 amidine revealed that – unlike LPS – the cationic lipid does not require CD14 to exercise its immunostimulatory activity, although the presence of the co receptor modulates the TLR4 activation and infrared spectroscopy experiments suggest a direct interaction.<p>In the case of sensing LPS, CD14 is required for the endocytosis of TLR4 and the subsequent activation of the TRIF pathway. By blocking the endocytosis mechanism at different stages we found that diC14-amidine generally enters the cell via endocytosis and that it activates – unlike LPS – both signaling cascades from inside endosomal vesicles, albeit at different stages of the endocytosis process.<p>Although the eventual immunological responses caused by diC14 amidine and LPS resemble each other or are even identical, our research revealed differences in the actual mechanism of activating TLR4, the receptor responsible for the corresponding innate immune response. These findings illustrate the uniqueness of diC14 amidine and the potential of further exploring its intriguing properties and mechanisms as a tool to decipher the TLR4 signaling machinery and with the perspective of designing new immunomodulators for vaccination and therapy.<p><p><p>RÉSUMÉ:<p>Le mécanisme de reconnaissance des lipopolysaccharides bactériens (LPS) par le récepteur de l'immunité innée Toll-like receptor 4 (TLR4) a fait l'objet d'une recherche intensive ces dernières années. Alors que TLR4 et son co-récepteur myeloid differentiation factor 2 (MD2) ont été démontrés comme étant essentiels pour la détection du LPS, le rôle des molécules dites "accessoires" est beaucoup moins évident. Le co-récepteur cluster of differentiation 14 (CD14) a largement été considéré comme un simple facilitateur pour la capture et le transfert des LPS à TLR4, mais des études récentes suggèrent qu'il pourrait avoir une influence déterminante sur les cascades de signalisation dépendantes de TLR4 induites en réponse au LPS. La diC14-amidine, un lipide cationique synthétisé initialement pour ses qualités en tant que vecteur de transfection, a révélé récemment une activité immunostimulatrice dépendante du récepteur TLR4, impliquant les deux cascades de signalisation dépendantes de TLR4, les voies MyD88 et TRIF.<p>Le but de ce travail était de mieux comprendre le mécanisme par lequel la diC14¬ amidine induit ces cascades et de contribuer à la compréhension générale du fonctionnement du complexe récepteur TLR4 et son activation par des ligands non-LPS. Plus précisément nous nous sommes intéressés au rôle de CD14 dans l'activation des voies MyD88 et TRIF par la diC14-amidine et des conséquences potentielles d’éventuelles divergences en termes d’exigence pour ce co-récepteur entre la diC14-amidine et le LPS. <p>Notre étude sur le rôle de la forme membranaire ou soluble de CD14 dans l'activation des voies dépendantes de TLR4 par la diC14-amidine a révélé que - contrairement au LPS - le lipide cationique ne nécessite pas de CD14 pour exercer son activité immunostimulatrice. Cependant, la présence du co-récepteur module l'activation de TLR4 et des expériences de spectroscopie infrarouge suggèrent une interaction directe entre le lipide et le CD14. <p>Dans le cas de la détection de LPS, le CD14 est nécessaire pour l'endocytose de TLR4 et l'activation subséquente de la voie TRIF. En bloquant le mécanisme d'endocytose à différents stades, nous avons montré que la diC14-amidine active - contrairement au LPS - les deux cascades de signalisation depuis l'intérieur des vésicules endosomiales, mais à des stades différents du processus d'endocytose.<p>En conclusion, bien que les réponses immunologiques causées par la diC14-amidine et le LPS se ressemblent, notre recherche a mis en évidence des différences substantielles dans leurs modes d'action. Ces différences illustrent le caractère unique de la diC14-amidine et son potentiel comme outil pour explorer la complexité du système de signalisation du TLR4 et en tirer des enseignements qui permettront de contribuer à la conception de nouveaux immunomodulateurs pour la vaccination et la thérapie. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La plupart des infections par le VIH-1 sont acquises lors de rapports hétérosexuels. En Afrique subsaharienne on observe 71 % des infections mondiales et 60 % des nouvelles infections par le VIH-1 touchent les femmes. Le tractus génital féminin (TGF) constitue la principale porte d’entrée pour le VIH-1 et joue un rôle important dans la défense de l’organisme contre les microorganismes pathogènes tout en maintenant une tolérance de la flore commensale. On y trouve les cellules épithéliales qui participent à l’élaboration des réponses immunes en collaboration avec les cellules dendritiques (DCs), mais également d’autres types de cellules immunitaires qui confèrent une protection à la muqueuse vaginale, notamment à travers la production de cytokines et de chimiokines. Nous avons établi une cohorte de travailleuses du sexe (CSWs) au Bénin et nous avons identifié des femmes hautement exposées et séronégatives au VIH-1 (HESN), qui demeurent séronégatives après plus de sept années actives dans le travail du sexe. Les personnes HESN étant un excellent modèle d’immunité naturelle contre le VIH-1, le but de notre projet consiste donc à étudier les cellules immunitaires impliquées dans la protection de l’hôte face au VIH-1, au niveau du tractus génital féminin. Nous émettons l’hypothèse que le maintien de faibles conditions inflammatoires dans le TGF des femmes HESN préviendrait une activation immunitaire excessive en préservant l’intégrité de la barrière de la muqueuse vaginale et contribuerait ainsi à maintenir une protection contre l’infection par le VIH-1. Des études antérieures sur les HESN béninoises et kenyanes ont démontré que ces femmes présentent de faibles niveaux d’inflammation dans leur TGF inférieur. En accord avec cela, nous avons observé de faibles niveaux de BLyS/BAFF dans la muqueuse vaginale des HESN comparativement aux travailleuses du sexe séropositives (CSWs+ HIV+). BLyS/BAFF est une molécule importante pour la différenciation des cellules B et pour la sélection de cellules B de première ligne de la zone marginale (MZ). De ce fait, nous rapportons pour la première fois la présence de cellules B CD1c+ de type MZ qui sont capables de se lier naturellement à la gp120 glycosylée, au niveau de la muqueuse vaginale. Or, des cellules B CD1c+ exprimant IgG sont augmentées chez les CSWs+ HIV+ comparativement aux HESN, ce qui pourrait contribuer à l’hyperglobulinémie observée dans le TGF inférieur des CSWs+ HIV+. Les faibles niveaux de BLyS/BAFF retrouvés dans la muqueuse vaginale des HESN semblent donc préserver une homéostasie au sein du compartiment B et des cellules B CD1c+ du TGF. De plus, nous y détectons une réactivité des IgG1 avec la gp-41 de l’enveloppe virale, qui pourrait contribuer à leur immunité naturelle. Avec les cellules épithéliales, les DCs sont l’une des premières à être en contact avec le virus dans le TGF. Elles jouent un rôle essentiel dans l’orchestration des réponses immunitaires. Nous pensons que les DCs contribuent au maintien de faibles conditions inflammatoires dans le TGF des HESN, prévenant ainsi l’activation immunitaire excessive et préservant l’intégrité de la barrière muqueuse de façon à maintenir une protection/contrôle contre le virus. Nous avons caractérisé une population myéloïde endocervicale « tolérogénique » HLA-DR+CD14+CD11c+ exprimant HLA-G, ILT4, CD103 et de forts taux d’IFN-α et d’IL-10 dont la fréquence relative était augmentée au niveau du col de l’utérus des HESN comparativement aux CSWs+ HIV+. De plus, des populations Tregs/Tr1 étaient aussi augmentées chez les HESN. Ces données reflètent à la fois une réponse antivirale et une contribution au contrôle des conditions inflammatoires dans le TGF des HESN. Afin de mieux comprendre la nature des cellules myéloïdes tolérogéniques, nous avons voulu dériver des monocytes en cellules dendritiques (MoDCs). Toutefois, nous avons remarqué que la différenciation des MoDCs des HESN était altérée. Suite à cela, nous avons caractérisé le profil transcriptomique des monocytes. Les résultats préliminaires mettent en lumière l’éventuel rôle des récepteurs nucléaires NR4A dans la modulation des MoDCs et, possiblement, sur le plan des cellules myéloïdes tolérogéniques chez les HESN. Dans l’ensemble, ces résultats nous ont permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes mis en place chez les HESN dans l’immunité naturelle contre le VIH-1. / Most HIV-1 infections are acquired through heterosexual intercourse. In sub-Saharan Africa, 71% of global infections are observed and 60% of new HIV-1 infections affect women. The female genital tract (FGT) constitutes a main portal of entry for HIV-1 and plays an important role in protecting the host against pathogens while maintaining a tolerance to a commensal flora. FGT immunity involves genital epithelial cells as well as dendritic cells (DCs) and many other types of immune cells which confer protection, through the production of chemokines and cytokines. We established a cohort of commercial sex workers (CSWs) in Benin and identified HIV-1 highly exposed seronegative (HESN) individuals, who remain uninfected after more than seven years of active prostitution. These HESN individuals being an exceptional model of natural immunity against HIV-1, the aim of our project is to characterize immune cells involved in protection from HIV-1 infection, in the female genital tract. We hypothesize that maintenance of low inflammatory conditions in the FGT of HESN women helps to prevent excessive immune activation likely preserving the mucosal barrier integrity and would help to maintain a protection against HIV infection. Previous studies of Beninese and Kenyan HESN have shown that these women have a low inflammatory profile in their lower FGT. Accordingly, we found that vaginal mucosa of HESN had lower soluble BLyS/BAFF levels when compared to HIV-infected CSWs (CSWs+ HIV+). BLyS/BAFF is highly recognized for its role in B-cell ontogenesis, as well as cell fate decision towards the innate marginal zone (MZ) B-cell pool. For the first time, we report the presence of genital MZ-like CD1c+ B-cells that naturally bind to fully glycosylated gp120 in the vaginal mucosa. However, CD1c+ B-cells expressing IgG are increased in the lower FGT of CSWs+ HIV+ when compared to HESN, suggesting that these cells could contribute to the hyperglobulinemia observed in the lower FGT of CSWs+ HIV+. The low levels of BLyS/BAFF found in the vaginal mucosa of HESN thus appear to preserve homeostasis of the FGT B cell compartment and CD1c+ B-cells. In addition, we detect a reactivity of IgG1 to HIV-gp41 in cervico-vaginal lavages (CVL) supernatants of HESN, which could contribute to their natural immunity. Epithelial cells and DCs are one of the earliest cell types to sense the virus in the FGT. They play a key role in the orchestration of immune responses. We characterized a "tolerogenic" endocervical myeloid HLA-DR+CD14+CD11c+ population expressing HLA-G, ILT4, CD103 and high levels of IFN-α and IL-10, that was increased in the cervix of HESN when compared to CSWs+ HIV+. In addition, frequencies of Tregs/Tr1 cells were also increased in HESN. We believe that DCs contribute to maintaining low inflammatory conditions in the FGT of HESN, preventing excessive immune activation and preserving the integrity of the mucosal barrier to maintain a protection/control against the virus. These data reflect both an antiviral response and a contribution to the control of inflammatory conditions in the FGT of HESN. To better understand the nature of tolerogenic myeloid cells, we wanted to derive monocyte-derived dendritic cells (MoDCs). However, derivation of blood MoDCs was impaired in HESN. As a result, we decided to characterize the transcriptomic profile of total blood monocytes. Preliminary results appear to demonstrate the possible role of NR4A nuclear receptors in MoDCs modulation, and possibly in tolerogenic myeloid cells in HESN. Overall, our results contribute to a better understanding of the mechanisms established by HESN in natural immunity to HIV-1.