<p>Breastfeeding from HIV-infected mothers is one of the major sources of pediatric HIV-1 infection; however, an intervention that promotes exclusive breastfeeding has significantly reduced vertical HIV transmission rates and infant mortality. The mechanisms underlying this phenomenon remain unknown; however, have been closely linked to high levels of innate immune factors in breast milk. Indeed, the level of several innate factors in breast milk correlate with protection and/or have direct anti-viral properties <em>in vitro.</em> The innate immune factor, soluble TLR2 (sTLR2) is found in high concentration in breast milk and has previously been investigated for its anti-bacterial properties; however, its anti-viral properties remain poorly understood. Thus, the research presented in this thesis extended our understanding of sTLR2 by characterizing the mechanisms by which sTLR2 inhibited HIV-induced inflammation and infection. Chapter 2 examined the predominant forms of sTLR2 in breast milk from different women, its cellular source, bioavailability and kinetics postpartum. Functionally, we confirmed sTLR2’s anti-bacterial properties and extended to show, for the first time, that sTLR2 directly inhibited HIV infection <em>in vitro.</em> Chapter 3 documented a potential mechanism of sTLR2’s direct inhibition of HIV infection <em>in vitro</em> and, investigated sTLR2 and TLR2 expression in HIV uninfected compared to HIV infected breast milk and breast milk cells, respectively. Chapter 4 investigated the role of TLR2’s recognition of novel HIV pathogen associated molecular patterns (PAMPs), and whether TLR2 expression increased HIV infection and integration. Taken together, we present novel anti-viral functions of sTLR2 by demonstrating that sTLR2 bound to specific HIV PAMPs, which led to significantly decreased HIV-induced inflammation, co-receptor expression, and HIV infection. Furthermore, we demonstrated, for the first time, that TLR2 recognizes specific HIV PAMPs, which led to significantly increased pro-inflammatory cytokine production, co-receptor expression and HIV infection. Thus, sTLR2 and TLR2 represent innate immune factors that might have preventative and therapeutic applications for both infants and adults in the future.<strong><br /> </strong></p> / Doctor of Philosophy (Medical Science)

Introdução: Chlamydia trachomatis (CT) é causa da infecção sexualmente transmitida de origem bacteriana mais comum. Na mulher, a infecção genital pela CT pode causar cervicite, uretrite, endometrite, salpingite. Infecções persistentes ou recorrentes provavelmente representam um importante fator de risco para o desenvolvimento de sequelas associadas, como dor pélvica crônica, gravidez ectópica e infertilidade por fator tubário. A lectina ligadora de manose (MBL), componente doo sistema imune inato, tem importante papel na defesa antimicrobiana, reconhecendo vírus, fungos e patógenos bacterianos. O gene que codifica para a MBL é polimórfico, e a substituição de um único nucleotídeo resulta na produção de uma proteína instável, que é rapidamente degradada. Objetivo: Avaliar se mulheres brasileiras portadoras de um polimorfismo do gene da MBL apresentam diferentes susceptibilidades para a ocorrência de obstrução tubária, na presença ou ausência de uma infecção prévia por Chlamydia trachomatis. Métodos: Em estudo caso-controle, foram avaliadas 75 pacientes com obstrução tubária e 75 pacientes com tubas pérvias, atendidas na Divisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). Anticorpos IgG anti-CT foram mensurados através de um ensaio de imunoabsorção enzimática para investigar uma infecção prévia pela CT. Para o polimorfismo, realizou-se coleta de células bucais e o DNA extraído foi analisado através de reação em cadeia da polimerase (PCR), digestão de endonuclease e gel de eletroforese, utilizando pares de primers específicos para a região polimórfica. Todo material foi mantido a -80°C e enviado em gelo seco para a Division of Immunology and Infectious Diseases da Weill Cornell Medicine em Nova York. Associações entre genótipos de MBL ou alelos e permeabilidade tubária foram analisadas pelo teste de qui-quadrado de Pearson com ou sem correção de Yates. Resultados: Não houve diferença na detecção de anticorpos da CT entre os grupos. Mulheres com tubas obstruídas tiveram uma prevalência maior do genótipo AB (36%) versus (16%), resultado estatisticamente significativo (p < 0,01). De maneira semelhante, a distribuição do alelo A e do alelo variante B também apresentaram diferenças significantes entre os grupos (p < 0,01). Conclusão: Os achados sugerem, que embora a exposição à Chlamydia trachomatis tenha sido semelhante em ambos os grupos, a presença do alelo variante B do gene que codifica para a MBL aumenta o risco de desenvolvimento da obstrução tubária, subsequente à infecção pela CT ou outros agentes infecciosos. Nas mulheres brasileiras avaliadas a presença de tal polimorfismo genético aumentou a probabilidade de obstrução tubária em consequência de uma infecção do trato genital / Introduction: Chlamydia trachomatis (CT) is the cause of the most common bacterial sexually transmitted infection. In women, genital CT infection may cause cervicitis, urethritis, endometritis, salpingitis. Persistent or recurrent infections probably represent an important risk factor for the development of associated sequelae, such as chronic pelvic pain, ectopic pregnancy and tubal factor infertility. Mannose-binding lectin (MBL), a component of the innate immune system, has an important role in antimicrobial defense, recognizing viral, bacterial and fungal pathogens. The gene coding for MBL is polymorphic and a single nucleotide substitution results in production of an unstable protein, that is rapidly degraded. Objective: To evaluate whether Brazilian women with a polymorphism in the MBL gene present different susceptibilities to the occurrence of fallopian tube damage, in the presence or absence of a previous infection by CT. Method: In a case-control study, 75 patients with tubal obstruction and 75 patients with patent tubes were studied, all seen at the Gynecology Division of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). IgG anti-CT antibodies were measured by enzyme-linked immunoassay to investigate a previous CT infection. For the polymorphism analysis, buccal cells were collected and the extracted DNA was analyzed by polymerase chain reaction (PCR), endonuclease digestion and gel electrophoresis using primer pairs specific for the polymorphic region. All material was maintained at -80 ° C and sent on dry ice to the Division of Immunology and Infectious Diseases at Weill Cornell Medicine in New York. Associations between MBL genotypes or alleles and tubal permeability were analyzed by the Pearson chi-square test with or without Yates correction. Results: There was no difference in CT antibody detection between the two groups. Women with obstructed tubes had a higher prevalence of being positive for the heterogenous genotype AB (36%) versus (16%) (p < 0.01). Similarly, the distribution of the normal A allele and variant B allele were also significant different between the two groups (p < 0,01). Conclusion: The findings suggest that while exposure to CT was similar in both groups of women the presence of the variant MBL B allele increases the risk for development of tubal obstruction, subsequent to a CT or other infection. In the Brazilian women evaluated possession of this genetic polymorphism increased the likelihood that blocked fallopian tubes will be a consequence of a genital tract infection

INTRODUÇÃO: Imunodeficiências primárias são um grupo heterogêneo de distúrbios de origem genética que afetam a imunidade e se caracterizam por infecções de repetição. Aproximadamente metade dos casos estão ligados a deficiências humorais e dentre estas podemos destacar a Imunodeficiência Comum Variável (ICV). Uma vez que os pacientes com ICV possuem redução dos níveis de anticorpos, esses pacientes apresentam infecções recidivantes do trato respiratório e aproximadamente 90% tiveram no mínimo um episódio de rinossinusite (RNS). A RNS se instala devido ao desequilíbrio entre o meio ambiente e fatores do hospedeiro e a infecção viral é pelo menos 20 vezes mais frequente do que a infecção bacteriana em indivíduos normais. OBJETIVOS: (1) Identificar os agentes virais da RNS nos pacientes com ICV e em indivíduos controles em um contexto prospectivo; (2) Definir quais citocinas e quimiocinas estão presentes e avaliar a expressão de genes relacionados à imunidade inata e adaptativa antiviral no lavado nasal de pacientes com ICV e nos indivíduos controles. CASUÍSTICA, MATERIAIS E MÉTODOS: Pacientes com ICV e indivíduos controles foram avaliados quando apresentavam sinais e sintomas de uma RNS viral e foi realizado a coleta de lavado nasal para a identificação de vírus respiratórios, além da quantificação da secreção de citocinas e quimiocinas e da avaliação da expressão gênica de genes relacionados à imunidade inata e adaptativa antiviral. A avaliação foi repetida quando todos os indivíduos previamente estudados se encontravam assintomáticos. RESULTADOS: De abril de 2012 a novembro de 2014, foram colhidas 65 amostras de lavado nasal, 43 amostras de 34 indivíduos controles e 22 amostras de 14 pacientes com ICV. Quatro amostras foram positivas para vírus pela técnica da imunofluorescência direta e dezoito amostras foram positivas pelo PCR. Pacientes com ICV tiveram mais infecções, duração maior dos sintomas e maior necessidade de uso de antibióticos que o grupo controle. A avaliação da produção de citocinas e quimiocinas no lavado nasal mostrou aumento da secreção de CXCL10, CCL2, CCL5, CXCL8 IL-6, IL-10, IL-1beta e TNF em ambos os grupos quando esses apresentavam quadro agudo de RNS viral. Foi realizada a expressão de genes pela técnica do PCR Real Time. Os pacientes com ICV apresentaram um aumento de expressão de genes relacionados à imunidade inata e adaptativa anitiviral substancialmente maior frente a um quadro de RNS viral do que os indivíduos controles em situações semelhantes. Quando comparamos os pacientes ICV e os controles ambos sem infecção aguda, observamos que os genes apresentam em sua maioria uma redução de expressão nos pacientes com ICV. DISCUSSÃO: Os vírus detectados respeitaram a sazonalidade em que normalmente são detectados e pacientes com ICV proporcionalmente tiveram mais infecções e uma evolução pior que o grupo controle. Aparentemente não houve diferenças significativas entre os grupos estudados quanto à liberação de citocinas e quimiocinas. Com relação ao estudo da expressão gênica, a maior amplitude de variação observada nos pacientes com ICV pode significar um desajuste de resposta imune levando a um quadro de maior inflamação local com consequente maior dano tecidual e justificando assim a incidência aumentada de complicações, duração aumentada dos sintomas e replicação viral aumentada nesse grupo de pacientes / INTRODUCTION: Primary immunodeficiencies (PIDs) are a heterogeneous group of genetic disorders that affect immunity and are characterized by relapsing, usually severe infections. Approximately half of the cases are linked to humoral deficiencies, being common variable immunodeficiency (CVID) the most frequent. CVID patients have reduced levels of antibodies; therefore, these patients have recurrent infections in the respiratory tract and approximately 90% had at least one episode of rhinosinusitis (RS). RS installs itself due to the imbalance between the environment and host factors and viral infection is at least 20 times as common as the bacterial infection in normal individuals. OBJECTIVES: (1) Identify the viral agents of rhinosinusitis in patients with CVID and in control individuals on a prospective context; (2) define which cytokines and chemokines are present in the nasal wash and evaluate the expression of genes related to innate and adaptive antiviral immunity in nasal wash of CVID patients and in control individuals. CASES, MATERIALS, AND METHODS: patients with CVID and control individuals were examined at Outpatient Facility of Dermatological Manifestations of Primary Immunodeficiencies and when they presented signs and symptoms of a viral RS. Nasal wash was collected in order to identify respiratory viruses; secretion of cytokines and chemokines were quantified and gene expression of genes related to innate and adaptive antiviral immunity were evaluated. This evaluation was repeated when all individuals previously studied were asymptomatic. RESULTS: From April 2012 to November 2014, 65 samples of nasal wash, 43 samples of 34 control individuals and 22 samples of 14 patients with CVID were collected. Four samples were positive for virus by direct immunofluorescence technique and eighteen samples by PCR. The detected viruses behaved according to the season in which they are normally detected and patients with CVID proportionally had more and longer infections and required more antibiotics than the control group. The evaluation of the production of cytokines and chemokines showed an increased secretion of CXCL10, CXCL8 CCL2, CCL5, IL-6, IL-10, IL-1beta and TNF in both groups when they presented acute viral RS. Gene expression was performed by using Real Time PCR. CVID patients showed increased expression of genes related to innate and adaptive antiviral immunity when compared to control individuals presenting acute viral RS. Conversely, when we compared CVID patients and control individuals both without acute infection, we observed a reduction in gene expression in CVID patients. DISCUSSION: The viral rhinosinusitis respected seasonality and CVID patients had proportionally more infections and a worse evolution than the control group. Apparently, there were no significant differences between the groups regarding the release of cytokines and chemokines. The greater magnitude of gene expression variation observed in CVID patients suggests an imbalance of immune response leading to a state of greater local inflammation with consequent greater tissue damage, therefore justifying an increased incidence of complications, increased duration of symptoms and increased viral replication in this group of patients

Introdução: Chlamydia trachomatis (CT) é causa da infecção sexualmente transmitida de origem bacteriana mais comum. Na mulher, a infecção genital pela CT pode causar cervicite, uretrite, endometrite, salpingite. Infecções persistentes ou recorrentes provavelmente representam um importante fator de risco para o desenvolvimento de sequelas associadas, como dor pélvica crônica, gravidez ectópica e infertilidade por fator tubário. A lectina ligadora de manose (MBL), componente doo sistema imune inato, tem importante papel na defesa antimicrobiana, reconhecendo vírus, fungos e patógenos bacterianos. O gene que codifica para a MBL é polimórfico, e a substituição de um único nucleotídeo resulta na produção de uma proteína instável, que é rapidamente degradada. Objetivo: Avaliar se mulheres brasileiras portadoras de um polimorfismo do gene da MBL apresentam diferentes susceptibilidades para a ocorrência de obstrução tubária, na presença ou ausência de uma infecção prévia por Chlamydia trachomatis. Métodos: Em estudo caso-controle, foram avaliadas 75 pacientes com obstrução tubária e 75 pacientes com tubas pérvias, atendidas na Divisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). Anticorpos IgG anti-CT foram mensurados através de um ensaio de imunoabsorção enzimática para investigar uma infecção prévia pela CT. Para o polimorfismo, realizou-se coleta de células bucais e o DNA extraído foi analisado através de reação em cadeia da polimerase (PCR), digestão de endonuclease e gel de eletroforese, utilizando pares de primers específicos para a região polimórfica. Todo material foi mantido a -80°C e enviado em gelo seco para a Division of Immunology and Infectious Diseases da Weill Cornell Medicine em Nova York. Associações entre genótipos de MBL ou alelos e permeabilidade tubária foram analisadas pelo teste de qui-quadrado de Pearson com ou sem correção de Yates. Resultados: Não houve diferença na detecção de anticorpos da CT entre os grupos. Mulheres com tubas obstruídas tiveram uma prevalência maior do genótipo AB (36%) versus (16%), resultado estatisticamente significativo (p < 0,01). De maneira semelhante, a distribuição do alelo A e do alelo variante B também apresentaram diferenças significantes entre os grupos (p < 0,01). Conclusão: Os achados sugerem, que embora a exposição à Chlamydia trachomatis tenha sido semelhante em ambos os grupos, a presença do alelo variante B do gene que codifica para a MBL aumenta o risco de desenvolvimento da obstrução tubária, subsequente à infecção pela CT ou outros agentes infecciosos. Nas mulheres brasileiras avaliadas a presença de tal polimorfismo genético aumentou a probabilidade de obstrução tubária em consequência de uma infecção do trato genital / Introduction: Chlamydia trachomatis (CT) is the cause of the most common bacterial sexually transmitted infection. In women, genital CT infection may cause cervicitis, urethritis, endometritis, salpingitis. Persistent or recurrent infections probably represent an important risk factor for the development of associated sequelae, such as chronic pelvic pain, ectopic pregnancy and tubal factor infertility. Mannose-binding lectin (MBL), a component of the innate immune system, has an important role in antimicrobial defense, recognizing viral, bacterial and fungal pathogens. The gene coding for MBL is polymorphic and a single nucleotide substitution results in production of an unstable protein, that is rapidly degraded. Objective: To evaluate whether Brazilian women with a polymorphism in the MBL gene present different susceptibilities to the occurrence of fallopian tube damage, in the presence or absence of a previous infection by CT. Method: In a case-control study, 75 patients with tubal obstruction and 75 patients with patent tubes were studied, all seen at the Gynecology Division of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). IgG anti-CT antibodies were measured by enzyme-linked immunoassay to investigate a previous CT infection. For the polymorphism analysis, buccal cells were collected and the extracted DNA was analyzed by polymerase chain reaction (PCR), endonuclease digestion and gel electrophoresis using primer pairs specific for the polymorphic region. All material was maintained at -80 ° C and sent on dry ice to the Division of Immunology and Infectious Diseases at Weill Cornell Medicine in New York. Associations between MBL genotypes or alleles and tubal permeability were analyzed by the Pearson chi-square test with or without Yates correction. Results: There was no difference in CT antibody detection between the two groups. Women with obstructed tubes had a higher prevalence of being positive for the heterogenous genotype AB (36%) versus (16%) (p < 0.01). Similarly, the distribution of the normal A allele and variant B allele were also significant different between the two groups (p < 0,01). Conclusion: The findings suggest that while exposure to CT was similar in both groups of women the presence of the variant MBL B allele increases the risk for development of tubal obstruction, subsequent to a CT or other infection. In the Brazilian women evaluated possession of this genetic polymorphism increased the likelihood that blocked fallopian tubes will be a consequence of a genital tract infection

O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis

Introdução: Durante o inverno de 2009, o vírus influenza A(H1N1)09pdm surgiu e se espalhou globalmente. A infecção por este vírus pode induzir a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) em alguns pacientes. O dano alveolar difuso (DAD), padrão histopatológico principal da SDRA, tem etiologia multifatorial, sendo possível que a imunopatologia seja diferente nas várias apresentações do DAD. Objetivo: Descrever, quantificar e comparar a imunopatologia viral (influenza A (H1N1) pdm09) e não-viral em casos de autópsia com dano alveolar difuso. Métodos: Foram analisados tecidos pulmonares de autopsia de 44 pacientes, sendo divididos em 3 grupos: grupo H1N1 (n=15), caracterizado por DAD secundário à influenza A(H1N1)pdm09; grupo SDRA (n=13), caracterizado por pacientes com DAD exsudativo de causas não-pulmonares; e o grupo de controle (n=16) com indivíduos que faleceram de causas não-pulmonares. Foram utilizadas as técnicas de imunohistoquímica e análise de imagem para quantificar, no parênquima pulmonar e nas pequenas vias aéreas, os marcadores de células imunes. Resultados: Foi observada uma elevada densidade celular de linfócitos T CD4+ e T CD8+, células Natural Killer CD57+, células dendríticas CD83+ e granzima A+ no parênquima pulmonar do grupo H1N1 (p < 0,05) em relação aos outros grupos. Na análise das pequenas vias aéreas, observou-se uma menor densidade célular de mastócitos (triptase), células dendríticas (CD207), e um aumento de IL-17 nos grupos H1N1 e SDRA, além de um aumento do número de granzimas A+ e diminuição de celulas dendríticas (CD83) apenas no grupo H1N1 (p < 0,05). Conclusão: O DAD causado pelo vírus influenza A (H1N1) pdm09 está associado com um fenótipo citotóxico inflamatório diferente do DAD de causas não-virais, com uma resposta parcialmente divergente no parênquima pulmonar em relação às pequenas vias aéreas / Rationale: The pandemic influenza A (H1N1) virus emerged in 2009 and spread globally. This virus infection can induce acute respiratory distress syndrome (ARDS) in some patients. Diffuse alveolar damage (DAD), which is the histological surrogate for ARDS, has a multifactorial etiology. Therefore, it is possible that the immunopathology differs among the various presentations of DAD. Objectives: To compare the lung immunopathology of viral (influenza A(H1N1)pdm09) to non-viral, extrapulmonary etiologies in autopsy cases with DAD. Methods: The lung tissue of 44 patients, was divided into 3 groups: the H1N1 group (n=15) characterized by DAD due to influenza A(H1N1)pdm09 infection; the ARDS group (n=13), characterized by patients with exudative DAD due to non-pulmonary causes; and the control group (n=16), consisting of patients with non-pulmonary causes of death. Measurements and main results: Immunohistochemistry and image analysis were used to quantify, in the lung parenchyma and small airways, several immune cell markers. There was higher expression of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, CD83+ dendritic cells, granzyme A+ and natural killer+ cell density in the lung parenchyma of the H1N1 group (p < 0,05). In the small airways, there was a lower cell density of tryptase+ mast cells and dendritic+ cells and an increase of IL-17 in both DAD groups, with an increased number of granzyme A in H1N1 group (p < 0,05). Conclusion: DAD due to viral A(H1N1)pdm09 is associated with a cytotoxic inflammatory phenotype that is different from non-viral causes of DAD, with partially divergent responses in the parenchyma relative to the small airways.

INTRODUÇÃO: Imunodeficiências primárias são um grupo heterogêneo de distúrbios de origem genética que afetam a imunidade e se caracterizam por infecções de repetição. Aproximadamente metade dos casos estão ligados a deficiências humorais e dentre estas podemos destacar a Imunodeficiência Comum Variável (ICV). Uma vez que os pacientes com ICV possuem redução dos níveis de anticorpos, esses pacientes apresentam infecções recidivantes do trato respiratório e aproximadamente 90% tiveram no mínimo um episódio de rinossinusite (RNS). A RNS se instala devido ao desequilíbrio entre o meio ambiente e fatores do hospedeiro e a infecção viral é pelo menos 20 vezes mais frequente do que a infecção bacteriana em indivíduos normais. OBJETIVOS: (1) Identificar os agentes virais da RNS nos pacientes com ICV e em indivíduos controles em um contexto prospectivo; (2) Definir quais citocinas e quimiocinas estão presentes e avaliar a expressão de genes relacionados à imunidade inata e adaptativa antiviral no lavado nasal de pacientes com ICV e nos indivíduos controles. CASUÍSTICA, MATERIAIS E MÉTODOS: Pacientes com ICV e indivíduos controles foram avaliados quando apresentavam sinais e sintomas de uma RNS viral e foi realizado a coleta de lavado nasal para a identificação de vírus respiratórios, além da quantificação da secreção de citocinas e quimiocinas e da avaliação da expressão gênica de genes relacionados à imunidade inata e adaptativa antiviral. A avaliação foi repetida quando todos os indivíduos previamente estudados se encontravam assintomáticos. RESULTADOS: De abril de 2012 a novembro de 2014, foram colhidas 65 amostras de lavado nasal, 43 amostras de 34 indivíduos controles e 22 amostras de 14 pacientes com ICV. Quatro amostras foram positivas para vírus pela técnica da imunofluorescência direta e dezoito amostras foram positivas pelo PCR. Pacientes com ICV tiveram mais infecções, duração maior dos sintomas e maior necessidade de uso de antibióticos que o grupo controle. A avaliação da produção de citocinas e quimiocinas no lavado nasal mostrou aumento da secreção de CXCL10, CCL2, CCL5, CXCL8 IL-6, IL-10, IL-1beta e TNF em ambos os grupos quando esses apresentavam quadro agudo de RNS viral. Foi realizada a expressão de genes pela técnica do PCR Real Time. Os pacientes com ICV apresentaram um aumento de expressão de genes relacionados à imunidade inata e adaptativa anitiviral substancialmente maior frente a um quadro de RNS viral do que os indivíduos controles em situações semelhantes. Quando comparamos os pacientes ICV e os controles ambos sem infecção aguda, observamos que os genes apresentam em sua maioria uma redução de expressão nos pacientes com ICV. DISCUSSÃO: Os vírus detectados respeitaram a sazonalidade em que normalmente são detectados e pacientes com ICV proporcionalmente tiveram mais infecções e uma evolução pior que o grupo controle. Aparentemente não houve diferenças significativas entre os grupos estudados quanto à liberação de citocinas e quimiocinas. Com relação ao estudo da expressão gênica, a maior amplitude de variação observada nos pacientes com ICV pode significar um desajuste de resposta imune levando a um quadro de maior inflamação local com consequente maior dano tecidual e justificando assim a incidência aumentada de complicações, duração aumentada dos sintomas e replicação viral aumentada nesse grupo de pacientes / INTRODUCTION: Primary immunodeficiencies (PIDs) are a heterogeneous group of genetic disorders that affect immunity and are characterized by relapsing, usually severe infections. Approximately half of the cases are linked to humoral deficiencies, being common variable immunodeficiency (CVID) the most frequent. CVID patients have reduced levels of antibodies; therefore, these patients have recurrent infections in the respiratory tract and approximately 90% had at least one episode of rhinosinusitis (RS). RS installs itself due to the imbalance between the environment and host factors and viral infection is at least 20 times as common as the bacterial infection in normal individuals. OBJECTIVES: (1) Identify the viral agents of rhinosinusitis in patients with CVID and in control individuals on a prospective context; (2) define which cytokines and chemokines are present in the nasal wash and evaluate the expression of genes related to innate and adaptive antiviral immunity in nasal wash of CVID patients and in control individuals. CASES, MATERIALS, AND METHODS: patients with CVID and control individuals were examined at Outpatient Facility of Dermatological Manifestations of Primary Immunodeficiencies and when they presented signs and symptoms of a viral RS. Nasal wash was collected in order to identify respiratory viruses; secretion of cytokines and chemokines were quantified and gene expression of genes related to innate and adaptive antiviral immunity were evaluated. This evaluation was repeated when all individuals previously studied were asymptomatic. RESULTS: From April 2012 to November 2014, 65 samples of nasal wash, 43 samples of 34 control individuals and 22 samples of 14 patients with CVID were collected. Four samples were positive for virus by direct immunofluorescence technique and eighteen samples by PCR. The detected viruses behaved according to the season in which they are normally detected and patients with CVID proportionally had more and longer infections and required more antibiotics than the control group. The evaluation of the production of cytokines and chemokines showed an increased secretion of CXCL10, CXCL8 CCL2, CCL5, IL-6, IL-10, IL-1beta and TNF in both groups when they presented acute viral RS. Gene expression was performed by using Real Time PCR. CVID patients showed increased expression of genes related to innate and adaptive antiviral immunity when compared to control individuals presenting acute viral RS. Conversely, when we compared CVID patients and control individuals both without acute infection, we observed a reduction in gene expression in CVID patients. DISCUSSION: The viral rhinosinusitis respected seasonality and CVID patients had proportionally more infections and a worse evolution than the control group. Apparently, there were no significant differences between the groups regarding the release of cytokines and chemokines. The greater magnitude of gene expression variation observed in CVID patients suggests an imbalance of immune response leading to a state of greater local inflammation with consequent greater tissue damage, therefore justifying an increased incidence of complications, increased duration of symptoms and increased viral replication in this group of patients

O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Carolina Campana - texto completo.pdf: 1739324 bytes, checksum: 2c77a0541ea8a062d1765a13e6b4e9e5 (MD5) Previous issue date: 2010-09-02 / Immunity against tuberculosis depends on the establishment of an effective Th1 response, with IFN- production, a pivotal cytokine to the activation of macrophages and bacilli destruction. It is known that several factors are related to the host s resistance to tuberculosis. In the present work, the influence of T regulatory cells (Tregs) in the immune response against Mtb was evaluated in whole blood and PBMC cultures from tuberculin skin test positive (TST+) and tuberculin skin test negative (TST-) individuals. Paralelly, we also evaluated if different levels of resistance to anti-mycobacterial drugs displayed by different Mtb clinical isolates could interfere with the cytokine profile, Tregs frequency, and with its proliferative capacity on both PBMC and whole blood cultures from TST+ and TST- subjects. Twenty-two healthy volunteers were invited to participate in our study, 11 TST+ and 11 TST-. Twelve Mtb clinical isolates were used, 6 drug-resistant and 6 drug-susceptible. Our data shows that differences in drug susceptibility did not affected any of the evaluated parameters. In the other hand, TST status correlated with differences in Treg frequencies, which was significantly elevated among TST+ when compared to TSTsubjects. The increase in Tregs was also associated with a decrease in the microbicidal effect observed in whole blood cultures from TST+, when compared to TST-. This association was confirmed through the depletion of Tregs, which restored the microbicidal activity and an increase in IFN-, IL-2, IL10, and TNF- when compared to undepleted cultures. Data presented here supports the hypothesis that pre-exposure to MTB, represented by a positive TST result, may increase the number of Treg cells, which in turn could affect negatively the establishment of a protective immunity against TB in TST+ individuals / A resposta imune contra a tuberculose é mediada por uma resposta do tipo Th1, com a produção de IFN-&#947;, citocina fundamental para a ativação dos macrófagos e, consequentemente para a eliminação do bacilo. Vários fatores podem estar relacionados com a resistência a tuberculose. Neste trabalho, foi avaliado o impacto das células T reguladoras na resposta imune contra o Mtb em infecções de amostras de sangue total e CMSP de indivíduos positivos para o teste com PPD (PPD+) e negativos ao teste com PPD (PPD-). Além disso, avaliamos também se o perfil de resistência dos isolados de Mtb tem relação com o perfil de citocinas secretadas, com a frequência de células T reguladoras e com sua capacidade proliferativa em culturas de sangue total e CMSP dos indivíduos estudados. Para isso, foram arrolados 22 voluntários saudáveis. Desses indivíduos, 11 eram PPD+ e 11 eram PPD-. Foram também utilizados 12 isolados de Mtb, sendo 6 sensíveis e 6 resistentes a drogas antituberculose. Não foram encontradas diferenças entre os perfis de resistência dos isolados de Mtb e os parâmetros avaliados. O número de células T reguladoras encontrado nos indivíduos PPD+ foi maior em relação aos PPD- e a presença dessas células afetou negativamente o efeito microbicida nas culturas de sangue total de indivíduos PPD+, nas quais os isolados de M. tuberculosis proliferaram mais. Quando foram feitas infecções com isolados de Mtb em culturas de CMSP nas quais as células T reguladoras foram depletadas uma diminuição na proliferação do Mtb foi encontrada tanto nas amostras de indivíduos PPD+ quanto PPD-. Essa alteração na proliferação do Mtb foi acompanhada de maiores níveis de INF-&#947;, IL-2, IL-10 e TNF-&#945; em relação às culturas de CMSP na presença das células T reguladoras. Os resultados desse trabalho sugerem que a pré-exposiçã o ao Mtb, evidenciada pelo teste positivo com o PPD, pode aumentar o número de células T reguladoras que, por sua vez, podem prejudicar a resposta imune protetora contra a tuberculose nos indivíduos PPD+

Introdução: Durante o inverno de 2009, o vírus influenza A(H1N1)09pdm surgiu e se espalhou globalmente. A infecção por este vírus pode induzir a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) em alguns pacientes. O dano alveolar difuso (DAD), padrão histopatológico principal da SDRA, tem etiologia multifatorial, sendo possível que a imunopatologia seja diferente nas várias apresentações do DAD. Objetivo: Descrever, quantificar e comparar a imunopatologia viral (influenza A (H1N1) pdm09) e não-viral em casos de autópsia com dano alveolar difuso. Métodos: Foram analisados tecidos pulmonares de autopsia de 44 pacientes, sendo divididos em 3 grupos: grupo H1N1 (n=15), caracterizado por DAD secundário à influenza A(H1N1)pdm09; grupo SDRA (n=13), caracterizado por pacientes com DAD exsudativo de causas não-pulmonares; e o grupo de controle (n=16) com indivíduos que faleceram de causas não-pulmonares. Foram utilizadas as técnicas de imunohistoquímica e análise de imagem para quantificar, no parênquima pulmonar e nas pequenas vias aéreas, os marcadores de células imunes. Resultados: Foi observada uma elevada densidade celular de linfócitos T CD4+ e T CD8+, células Natural Killer CD57+, células dendríticas CD83+ e granzima A+ no parênquima pulmonar do grupo H1N1 (p < 0,05) em relação aos outros grupos. Na análise das pequenas vias aéreas, observou-se uma menor densidade célular de mastócitos (triptase), células dendríticas (CD207), e um aumento de IL-17 nos grupos H1N1 e SDRA, além de um aumento do número de granzimas A+ e diminuição de celulas dendríticas (CD83) apenas no grupo H1N1 (p < 0,05). Conclusão: O DAD causado pelo vírus influenza A (H1N1) pdm09 está associado com um fenótipo citotóxico inflamatório diferente do DAD de causas não-virais, com uma resposta parcialmente divergente no parênquima pulmonar em relação às pequenas vias aéreas / Rationale: The pandemic influenza A (H1N1) virus emerged in 2009 and spread globally. This virus infection can induce acute respiratory distress syndrome (ARDS) in some patients. Diffuse alveolar damage (DAD), which is the histological surrogate for ARDS, has a multifactorial etiology. Therefore, it is possible that the immunopathology differs among the various presentations of DAD. Objectives: To compare the lung immunopathology of viral (influenza A(H1N1)pdm09) to non-viral, extrapulmonary etiologies in autopsy cases with DAD. Methods: The lung tissue of 44 patients, was divided into 3 groups: the H1N1 group (n=15) characterized by DAD due to influenza A(H1N1)pdm09 infection; the ARDS group (n=13), characterized by patients with exudative DAD due to non-pulmonary causes; and the control group (n=16), consisting of patients with non-pulmonary causes of death. Measurements and main results: Immunohistochemistry and image analysis were used to quantify, in the lung parenchyma and small airways, several immune cell markers. There was higher expression of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, CD83+ dendritic cells, granzyme A+ and natural killer+ cell density in the lung parenchyma of the H1N1 group (p < 0,05). In the small airways, there was a lower cell density of tryptase+ mast cells and dendritic+ cells and an increase of IL-17 in both DAD groups, with an increased number of granzyme A in H1N1 group (p < 0,05). Conclusion: DAD due to viral A(H1N1)pdm09 is associated with a cytotoxic inflammatory phenotype that is different from non-viral causes of DAD, with partially divergent responses in the parenchyma relative to the small airways.