Th.--Sci. pharm.--Paris 5, 1981. N°: 48.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-12-05T19:29:14Z No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Como a leishmaniose visceral (LV) ocorre principalmente em áreas onde os serviços de saúde são pouco desenvolvidos, o seu diagnóstico baseia-se principalmente no exame clínico, podendo ela ser confundida com outras doenças. Este estudo tem como objetivo a avaliação de antígenos recombinantes (rAg) visando o desenvolvimento e a validação de um “kit” para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral, que seja simples, barato e possa ser aplicado em condições precárias. O sistema a ser desenvolvido baseia-se no uso concomitante de múltiplas proteínas recombinantes. [MATERIAL E MÉTODOS] Vários rAg foram clonados e alguns deles foram analisados para o uso em sorodiagnóstico em 93 soros de pacientes com leishmaniose visceral, selecionados clinicamente e com diagnóstico confirmado parasitológicamente. [RESULTADOS] Um total de oito rAgs foi avaliado. Todos os soros de LV reconheceram pelo menos um dos rAgs, sendo portanto a sensibilidade do teste para o conjunto de antígenos, testados isoladamente, de 100%. A especificidade do teste para o conjunto de antígenos, avaliada bem preliminarmente em um total de 36 soros controle (de indivíduos sem leishmaniose), foi também de 100%. Nesta dissertação é descrita também uma maneira simples de identificar em bibliotecas de DNA exatamente rAgs que vão aumentar a sensibilidade de um ensaio imunodiagnóstico. / Since visceral leishmaniasis (VL) occurs in areas where health services are scarce, its diagnosis is based mainly on clinical examination, making possible it to be confounded with other diseases. The objective of this study is to evaluate recombinant antigens (rAg) aiming at developing and validating a kit for immunodiagnosis of the visceral leishmaniasis that were simple, cheap and could be put into practice under precarious CQnditions. The system to be developed is based on the concomitant use of multiple recombinant proteins. [MATERIAL AND METHODS] Several recombinant antigens have been cloned and analysed in order to be used in serodiagnosis with reference to the antibody detection in 93 sera of patients with visceral leishmaniasis, clinically selected and with diagnosis parasitologically confirmed. [RESULTS] A total of eight rAgs were evaluated. All sera of VL were recognized at least by one rAg, so that the sensitivity for the group of antigens, isolated tested, was 100%. The specificity, preliminarily evaluated in a total of 36 control sera (of individuals without leishmaniasis) was also 100%. This dissertation describes also a simple way to identify, in genetic libraries, exactly the rAgs that will increase immunoassay sensibility.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-08-04T19:05:43Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Émelin Alves dos Santos - 2016.pdf: 1617820 bytes, checksum: 16ea9a34990cb6d247fd464223a95256 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-05T12:41:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Émelin Alves dos Santos - 2016.pdf: 1617820 bytes, checksum: 16ea9a34990cb6d247fd464223a95256 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-05T12:41:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Émelin Alves dos Santos - 2016.pdf: 1617820 bytes, checksum: 16ea9a34990cb6d247fd464223a95256 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-04-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Strongyloidiasis is mainly predominant in regions of tropical and subtropical climates may present asymptomatic limited to the gastrointestinal tract. However, immunosuppression can cause hyperinfection and dissemination of larvae. Diabetes Mellitus (DM) causes immune dysregulation, became the individual more susceptible to secondary infections as strongyloidiasis. The chronicity of the disease in this group patients difficult the diagnosis, this fact conduct to research new methodologies such as circulating immune complex detections. Currently, there are few reports in literature on the evaluation immunological profile of strongyloidiasis in patients with DM and epidemiological research this disease important for monitoring the number of cases. In this context, this study had as objective determine serum levels of specific IgG antibodies and circulating immune complex in serum samples of infected patients and control individuals negative by ELISA. The survey was conducted with patients attended at the diabetes ambulatory in Jataí - GO and nondiabetic individuals residing in the city. The authorization for collect blood samples was obtained by signature Term of Informed Consent (TIC) it is characterized individuals in two groups: Group I patients with DM1 and 2, Group II individuals negative control for S. stercoralis and DM. Serum samples were tested by ELISA for detection of IgG and circulating immune complexes. We analyzed 50 serum samples from Group I and 50 in Group II, 30% were male and 70% female, for both groups. A total of 19 (38%) serum sample were positive for IgG in Group I and 2 (4%) for Group II, the majority were female age between 57 and 69 years. For detection circulating immune complexes only one sample was positive in Group I (2%) and Group II (0%). The seroprevalence of IgG anti-Strongyloides detection in diabetic patients was high when compared to the control group, detection of circulating immune complexes in Group I was low. In this context, we emphasize the importance the realization of immune complex research by ELISA as complementary tool in diagnosis of active infection S. stercoralis. / A estrongiloidíase é predominante principalmente em regiões de climas tropicais e subtropicais, podendo apresentar-se assintomática quando limitada ao trato gastrointestinal. No entanto, a imunodepressão pode levar a quadros de hiperinfecção e disseminação das larvas. O Diabetes Mellitus (DM) provoca disfunção do sistema imune, tornando o indivíduo mais susceptível a infecções secundárias, como a estrongiloidíase. A cronicidade da doença neste grupo de pacientes dificulta o seu diagnóstico, fato este que tem levado a pesquisa de novas metodologias, como a detecção de imuncomplexos circulantes. Atualmente, existem poucos relatos na literatura sobre a avaliação do perfil imunológico da estrongiloidíase em pacientes com DM, sendo a investigação epidemiológica desta doença importante para o acompanhamento do número de casos. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo determinar os níveis séricos de anticorpos IgG específicos e imunocomplexos circulantes em amostras de soros de pacientes infectados e de indivíduos controle negativo, por ELISA. A pesquisa foi realizada com pacientes atendidos no ambulatório de diabetes da prefeitura de Jataí - GO e indivíduos não diabéticos residentes no município. A autorização para coleta das amostras de sangue foi obtida pela assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), sendo os indivíduos caracterizados em dois grupos: Grupo I pacientes portadores de DM1 e 2, Grupo II indivíduos controle negativo para S. stercoralis e DM. As amostras de soro foram testadas pela técnica imunoenzimática ELISA para detecção de IgG e imunocomplexos circulantes. Foram analisadas 50 amostras de soro do Grupo I e 50 do Grupo II, sendo que 30% eram do sexo masculino e 70% do sexo feminino, para ambos os grupos. Um total de 19 (38%) amostras de soro foram reagentes para IgG no Grupo I e 2 (4%) para o Grupo II, sendo a maioria do sexo feminino com faixa etária entre 57 e 69 anos. Para detecção de imunocomplexos circulantes, apenas uma amostra foi reagente no Grupo I (2%) e nenhuma no Grupo II (0%). A soroprevalência para detecção de IgG anti-Strongyloides em pacientes diabéticos foi elevada quando comparado ao grupo controle, enquanto que a detecção de imunocomplexos circulantes no Grupo I foi baixa. Neste contexto, ressalta-se a importância da realização da pesquisa de imunocomplexos por ELISA como ferramenta complementar para o diagnóstico da infecção ativa por S. stercoralis.

A produção de kits para diagnóstico in vitro deve ser feita seguindo-se a legislação vigente de Boas Práticas de Fabricação e Controle (BPF). O objetivo deste trabalho foi elaborar um procedimento para desenvolvimento, produção e validação de um produto para diagnóstico in vitro, de acordo com a legislação vigente. Adotamos como modelo um kit imunoenzimático para Doença de Chagas. Dentro dos requisitos de BPF, a validação é uma etapa importante, pois tem por objetivos, dentre outros: auxiliar no estabelecimento de procedimentos de produção e controle de qualidade, avaliar desvios e dimensionar possíveis erros, avaliar o desempenho quanto à utilidade médica dos resultados obtidos e estabelecer condições ideais de uso. No estabelecimento dos requisitos para validação devem-se considerar as características do método utilizado, a utilidade clínica e diagnóstica dos resultados e as condições de uso do kit. Os parâmetros para validação devem ser definidos considerando a finalidade do uso do produto. Os resultados obtidos em três lotes pilotos demonstraram que o kit pode ser utilizado tanto com soro como com plasma, as amostras podem ser congeladas e descongeladas antes do uso por até 5 ciclos, o índice de concordância com kit comercial é de 0,9 (ótimo) e o kit mantém-se estável por pelo menos 7 dias à 37ºC, o que neste trabalho foi equivalente a pelo menos um ano na sua condição ideal de armazenamento de 2 a 8ºC. Além disso, o kit apresentou 100% de sensibilidade, 99% de especificidade, com coeficiente de variação 15,2% tanto na repetitividade como na reprodutibilidade de amostras positivas. Quanto à análise de interferentes, amostras hemolisadas e a presença de fator reumatóide podem interferir nos resultados e anticorpos anti-Leishmania na amostra podem dar reação cruzada. Conclui-se que o procedimento elaborado e o kit desenvolvido e validado atenderam aos requisitos pré-estabelecidos, de acordo com as regras de BPF vigentes. / The production of an in vitro diagnostic kit should be done following current Good Manufacturing Practices (GMP). The objective of this work was to establish a procedure for the development, production and validation of an in vitro diagnostic product in accordance with current regulations governing Medical Devices. An enzyme-linked immunoassay kit for Chagas\' disease was used as a model. Validation is a very important step contained within GMP requirements. Validation provides documented evidence that processes and product batches are consistent, it aids in the establishment of production and quality control procedures, evaluate deviations and identify possible mistakes, evaluate the performance and medical usefulness of the product based on the obtained results, and establish ideal conditions of use and storage. In order to establish validation requirements for product development, it is necessary to consider the characteristics of the assay method, the clinical and diagnostic usefulness of the results and the conditions of use of the kit. The parameters for validation should be defined considering the purpose of the use of the product. In the case of this Chagas assay, results obtained in three pilot lots demonstrated that the kit could be used with both serum and plasma, samples could be frozen and thawed before use for up to 5 cycles. The agreement index when compared with a commercially licensed kit is 0,9 (optimum correlation). The kit remained stable for at least 7 days at 37ºC, which is equivalent to at least one year stability in its ideal storage condition of 2 to 8ºC. The kit presented 100% sensitivity and 99% specificity, with variation coefficient of 15,2% for both repeatability and reproducibility of the positive samples. Interference analysis indicated that: hemolyzed samples and the presence of reumathoid factor could interfere with test results. Antibodies anti-Leishmania in the test sample can cross react with T. cruzi proteins. In conclusion: the established procedure for development and validation of chagas kit, and the actual developed and validated kit are in accordance with pre-established current GMP requirements.

A produção de kits para diagnóstico in vitro deve ser feita seguindo-se a legislação vigente de Boas Práticas de Fabricação e Controle (BPF). O objetivo deste trabalho foi elaborar um procedimento para desenvolvimento, produção e validação de um produto para diagnóstico in vitro, de acordo com a legislação vigente. Adotamos como modelo um kit imunoenzimático para Doença de Chagas. Dentro dos requisitos de BPF, a validação é uma etapa importante, pois tem por objetivos, dentre outros: auxiliar no estabelecimento de procedimentos de produção e controle de qualidade, avaliar desvios e dimensionar possíveis erros, avaliar o desempenho quanto à utilidade médica dos resultados obtidos e estabelecer condições ideais de uso. No estabelecimento dos requisitos para validação devem-se considerar as características do método utilizado, a utilidade clínica e diagnóstica dos resultados e as condições de uso do kit. Os parâmetros para validação devem ser definidos considerando a finalidade do uso do produto. Os resultados obtidos em três lotes pilotos demonstraram que o kit pode ser utilizado tanto com soro como com plasma, as amostras podem ser congeladas e descongeladas antes do uso por até 5 ciclos, o índice de concordância com kit comercial é de 0,9 (ótimo) e o kit mantém-se estável por pelo menos 7 dias à 37ºC, o que neste trabalho foi equivalente a pelo menos um ano na sua condição ideal de armazenamento de 2 a 8ºC. Além disso, o kit apresentou 100% de sensibilidade, 99% de especificidade, com coeficiente de variação 15,2% tanto na repetitividade como na reprodutibilidade de amostras positivas. Quanto à análise de interferentes, amostras hemolisadas e a presença de fator reumatóide podem interferir nos resultados e anticorpos anti-Leishmania na amostra podem dar reação cruzada. Conclui-se que o procedimento elaborado e o kit desenvolvido e validado atenderam aos requisitos pré-estabelecidos, de acordo com as regras de BPF vigentes. / The production of an in vitro diagnostic kit should be done following current Good Manufacturing Practices (GMP). The objective of this work was to establish a procedure for the development, production and validation of an in vitro diagnostic product in accordance with current regulations governing Medical Devices. An enzyme-linked immunoassay kit for Chagas\' disease was used as a model. Validation is a very important step contained within GMP requirements. Validation provides documented evidence that processes and product batches are consistent, it aids in the establishment of production and quality control procedures, evaluate deviations and identify possible mistakes, evaluate the performance and medical usefulness of the product based on the obtained results, and establish ideal conditions of use and storage. In order to establish validation requirements for product development, it is necessary to consider the characteristics of the assay method, the clinical and diagnostic usefulness of the results and the conditions of use of the kit. The parameters for validation should be defined considering the purpose of the use of the product. In the case of this Chagas assay, results obtained in three pilot lots demonstrated that the kit could be used with both serum and plasma, samples could be frozen and thawed before use for up to 5 cycles. The agreement index when compared with a commercially licensed kit is 0,9 (optimum correlation). The kit remained stable for at least 7 days at 37ºC, which is equivalent to at least one year stability in its ideal storage condition of 2 to 8ºC. The kit presented 100% sensitivity and 99% specificity, with variation coefficient of 15,2% for both repeatability and reproducibility of the positive samples. Interference analysis indicated that: hemolyzed samples and the presence of reumathoid factor could interfere with test results. Antibodies anti-Leishmania in the test sample can cross react with T. cruzi proteins. In conclusion: the established procedure for development and validation of chagas kit, and the actual developed and validated kit are in accordance with pre-established current GMP requirements.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-30T13:40:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:13:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:13:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T19:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / O Neospora caninum é um protozoário filogenéticamente relacionado a vários coccídeos de importância médico veterinária, além de ser um parasito intracelular obrigatório capaz de causar abortamentos em bovinos e paralisia neoromuscular em cães. A interação ligantes/receptores são requisitos que permitem que o parasito explore sua capacidade invasiva, sendo o contato inicial mediado por proteínas de superfície imunodominantes como Nc-p43 e Nc-p29. O estudo de antígenos e proteínas recombinantes de N. caninum gerou uma série de informações para aprimorar o diagnóstico e diferenciação deste protozoário e demais agentes a ele relacionados, principalmente com relação ao Toxoplasma gondii. No presente trabalho foi realizada uma revisão bibliográfica das proteínas envolvidas na interação hospedeiro-parasito utilizadas como alvos vacinais e na aplicação em testes diagnósticos devido a sua especificidade. Dentre as proteínas descritas, os antígenos de superfície Nc-p43 e Nc-p29 são amplamente estudados devido a sua especificidade e capacidade de induzer uma resposta imune protetiva, além de não apresentar reação cruzada com outros parasitos Apicomplexas quando utilizadas em ensaios diagnósticos. Frente a isso, propomos a expressão das proteínas específicas de N. caninum, Nc-p43 e Nc-p29 em sistema procarioto, para avaliar sua antigenicidade frente a soros de animais naturalmente infectados por N. caninum e especificidade quando testados frente a soros de animais infectados por T. gondii. A proteína rNc-p43 foi utilizada na produção de um anticorpo policlonal, que foi purificado, conjugado a peroxidase (HPR) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) afim de detectar as proteínas recombinantes e nativas Nc-p43, espectivamente. pAb e pAb/HRP foram capazes de reconhecer rNcp-43, enquanto pAb/FITC se mostrou eficiente na imunomarcação do complexo apical de taquizoítos. Um ensaio imunoenzimático de bloqueio (b-ELISA) foi realizado para avaliar a performance do pAb/HRP como ferramenta de diagnóstico. A porcentagem de inibição média para as amostras de soros positivos e negativos de bovinos com neosporose obteve diferença estatística (P <0,0001). Estes resultados sugerem que o pAb pode ligar-se aos mesmos epítopos da Ncp-43 que os anticorpos anti-N. caninum de amostras positivas testadas. O b-ELISA utilizando o pAb/HRP representa uma opção interessante aos testes de diagnóstico disponíveis para a neosporose, uma vez que menos passos estão envolvidos na sua realização e seu formato evita a reatividade cruzada com anticorpos anti-espécie específicos. Em resumo, este trabalho descreve a clonagem e expressão das proteínas Nc-p43 e Nc-p29 de N. caninum em sistema procarioto, a produção de um anticorpo policlonal monoespecífico contra a proteína recombinante Nc-p43 e a avaliação de sua aplicabilidade como ferramenta no diagnóstico para neosporose. / Neospora caninum is a protozoan phylogenetically related to several coccidia with importance in veterinary medicine. This obligate intracellular parasite causes abortions in cattle and neoromuscular paralysis in dogs. Interaction ligand/receiver are required that allow the parasite explore your ability invasive, being the initial contact mediated for immunodominant surface proteins as Ncp43 and Nc-p29. The study of antigens and recombinant proteins of N. caninum have generated a serie of informations aiming the improvement of diagnosis and differentiation of this protozoan and other agents related to it, especially Toxoplasma gondii.In the present work was carried out a literature review focusing in the proteins involved in host-parasite interaction used as vaccine targets and application in diagnostic tests due to its specificity. Among the described proteins, antigens of surface Nc-p43 and Nc-p29 are widely studied due to their specifity and ability to induzer a protective immunity, and not reported cross reaction with other Apicomplexa parasite when used in trials diagnostics. Furthermore, the expression of specific proteins of N. caninum, Ncp43 and Nc-p29, in prokaryote system, are here described, followed by their evaluating concerning their antigenicity, using sera from animals naturally infected with N. caninum; and their specificity through reaction with sera from animals infected with T. gondii. The rNc-p43 protein was used for polyclonal antibody production in rabbit, purified and conjugated to peroxidase (HPR) and fluorescein isothiocyanate (FITC), in order to detect the recombinant and native Nc-p43, respectivelly. pAb and pAb/HRP were able to recognize rNc-p43, which was evaluated by Dot blot and ELISA assays, while pAb/FITC was able to mark the apical complex of tachyzoites. A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA) was performed to evaluate the performance of pAb/HRP as diagnostic tool. The average percentage of inhibition for the positive sera pool and the negative sera pool of cattle neosporosis was significantly different (p <0.0001). These results suggest that pAb may bind to the same epitopes of Ncp43 and anti-N. caninum antibodies positive samples tested. b-ELISA using pAb/HRP is an interesting option for diagnostic tests that are available for neosporosis since fewer steps are involved in their implementation and their shape prevents cross-reactivity with anti-species-specific antibodies. In short, this work describes the cloning and expression of Nc-p43 and Nc-p29 proteins N. caninum in prokaryotic system, to produce a monnoespecific polyclonal antibody against the recombinant protein Nc-p43 and evaluation of its suitability as a tool in diagnosis of neosporosis.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-27T17:20:49Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Vitor Ferreira Alves - 2014.pdf: 3685107 bytes, checksum: fe9f9fed0534abe30c80c9eb985428e4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-27T17:20:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Vitor Ferreira Alves - 2014.pdf: 3685107 bytes, checksum: fe9f9fed0534abe30c80c9eb985428e4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T17:20:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Vitor Ferreira Alves - 2014.pdf: 3685107 bytes, checksum: fe9f9fed0534abe30c80c9eb985428e4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-04-30 / Leishmaniasis is a group of diseases with distinct clinical, histopathological and immunological characteristics, caused by parasites belonging to the Leishmania genus. The serological tests used until the moment have several limitations. There are a great interest to identify immunogenic proteins of Leishmania to be tested as potential antigens for the development of techniques for the diagnosis of American cutaneous leishmaniasis (ACL). The aim of this study was to produce and purify the recombinant proteins "Leishmania activated C kinase" (rLACK); "Thiol Specific Antioxidant" (TSA), "Leishmania elongation initiation factor" (LeIF) and "Leishmania braziliensis stress inducible protein 1" (LbSTI) to evaluate the antigenicity. The recombinant proteins were produced by recombinant DNA techniques as described by Salay et al. (2007). To perform the ELISA, L.(V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903) and L.(L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) species were cultivated and the antigenic extracts and recombinant proteins were used as antigens. Sixty serum samples from patients with ATL assisted at Anuar Auad hospital, Goiânia, Goiás, were assayed, and from them, 45 were from patients with localized cutaneous leishmaniasis (LCL) and 15 were from mucosal leishmaniasis (ML). To analyze the specificity of the response of total extract and the recombinant proteins, sera from patients with other pathologies were tested. The total extract of L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI and rLeIF showed a sensitivity of 85%, 75%, 70%, 76.7% and 56.1% respectively. The specificity of total extract of L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF were 72.5%, 80%, 60%, 30% and 62.5% respectively. Thus, these results showed that recombinants proteins and total extract of L. (L.) amazonensis were antigenic and the total extract of L. (L.) amazonensis and rLACK were the antigen that had the best sensibility and specificity. / As leishmanioses compreendem um grupo de doenças que apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas distintas, é causada por parasitos intracelulares que pertencem ao gênero Leishmania. Os testes sorológicos utilizados até o presente, para o diagnóstico, apresentam várias limitações e por isto é de grande importância identificar proteínas imunogênicas da Leishmania, para que sejam testadas como potenciais antígenos para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA). O objetivo deste estudo foi produzir e purificar as proteínas recombinantes “Leishmania activated C kinase” (rLACK); “Thiol Specific Antioxidant” (TSA), “Leishmania elongation initiation factor” (LeIF) e “Leishmania braziliensis stress inducible protein 1” (LbSTI) e avaliar a sua antigenicidade. As proteínas recombinantes foram produzidas pela técnica de DNA recombinante segundo descrito por Salay et al. (2007). Para a realização do ELISA foram cultivadas as espécies L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903) e L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) e seus extratos antigênicos e as proteínas recombinantes produzidas foram utilizados como antígenos. Foram utilizadas 60 amostras de pacientes com LTA, atendidos no hospital Anuar Auad, Goiânia, Goiás, sendo que destas, 45 eram de pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) e 15 eram de leishmaniose mucosa (LM). Para a análise da especificidade foram utilizados o soro de pacientes com outras patologias. O extrato total de L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF apresentarem sensibilidade de 85%, 75%, 70%, 76,7%, e 56,1% respectivamente. O extrato total de L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF obtiveram especificidade de 72,5%, 80%, 60%, 30% e 62,5%, respectivamente. Os resultados do presente trabalho demonstraram que as proteínas recombinantes e o extrato total de L. (L.) amazonensis foram antigênicas e o extrato total de L. (L.) amazonensis e a rLACK foram os antígenos que tiveram as melhores sensibilidades e especificidades.

Orientadores: Dagmar Ruth Stach-Machado, Marcos Antonio Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peroni_LuisAntonio_D.pdf: 5677765 bytes, checksum: 2a4cb6ec8aba9b1ec6655c771981377f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este trabalho visou efetuar a identificação dos epitopos das prottnas recombinantes CB-22 e CB-104 do capsídeo do Cítrus tristeza vírus (CTV), reconhecidos pelos anticorpos monoclonais (MAb) produzidos por Stach-Machado e colaboradores (2000). Assim, os epitopos reconhecidos pelos MAbs 30.G.02 e 37.G.ll, correspondem às seqüências de aminoácidos NLHIDPTLI e TQQNAALNRDLF, localizadas nas posições 32 a 40 e 50 a 61 das proteínas recombinantes CB-22 e CB-104. O epitopo reconhecido pelo MAb 39.07 que apresenta especificidade apenas para a CB-104, homóloga aos isolados severos do CTV corresponde a seqüência TDVVFNSKGIGN, localizados na posição 120 a 131 da proteína. Estes dados corroboram com os ensaios de ELlSA, confirmando o MAb 30.G.02 como um anticorpo universal, atuando quer como anticorpo de captura ou de detecção em ELlSA Sandwich, uma vez que, seu epitopo é conservado em 87.2% dos isolados de CTV. O MAb 37.G.ll deve ser adotado apenas como anticorpo de detecção pois reconhece uma seqüência encontrada em 62,6% dos isolados, permitindo uma identificação ampla, sem efetuar a diferenciação de estirpes. O MAb 39.07 foi classificado como "forte", pois seu epitopo está presente em apenas 19,7% das seqüências, sendo estas provenientes de isolados fortes do CTV de todo o mundo. A utilização de peptídeos lineares não permitiu a identificação e caracterização do epitopo do MAb 1C.04-12, confirmando dados preliminares de nosso laboratório que permitiram inferir que o mesmo reconhece um epítopo conformacional. O conhecimento das características estruturais da proteína do capsídeo viral possibilita obtenção de informações relevantes quanto às suas propriedades biológicas, como a participação na organização e montagem da partícula viral, proteção do material genético, interação com o inseto-vetor e com a planta hospedeira e também, pela "movimentação" da partícula viral no processo de infecção na planta. Considerando que até a presente data não existem dados disponíveis no Protein Data Bank (PDB) sobre a estrutura tridimensional da proteína do capsídeo do CTV, efetuamos o estudo estrutural da CB-22, utilizando Dicroísmo Circular (CD) e Difração de Raios X a Baixo Ângulo (SAXS). A análise dos dados de CD mostrou um espectro característico de proteínas cuja estrutura secundária é predominantemente formada por a-hélices, sendo este resultado coerente com a estrutura secundária predita pelo software PSIPRED. Os estudos de SAXS revelaram uma proteína altamente oligomerizada com estruturas formadas por subunidades, que variam de acordo com a concentração da mesma em solução. Este resultado, embora tenha impossibilitado a resolução e modelagem da estrutura secundária da CB-22, demonstrou que esta proteína recombinante mantém a função da proteína nativa, responsável pela formação do capsídeo vira!. Assim sendo, podemos postular a sua utilização como uma molécula carreadora, podendo ser aplicada em protocolos de vacinação ou no transporte dirigido de ácidos nucléicos ou proteínas. Por fim, este trabalho estabeleceu diagnósticos imunomoleculares como Imunocaptura-PCR (IC-PCR) e Imuno-PCR (I-PCR) para a detecção da bactéria gramnegativa Xylella jastid[osa, agente etiológico da Cvc. Os ensaios imunomoleculares apresentaram o limite de detecção muito superior aos diagnósticos utilizados na rotina como ELlSA e PCR, sendo o limite de detecção do IC-PCR e do I-PCR de 103 a 101 células, respectivamente. Portanto, estes métodos são uma alternativa viável para efetuar o diagnóstico da CVC e também em estudos epidemiológicos, com a vantagem de eliminar as etapas de extração e concentração do material genético bacteriano, permitindo um diagnóstico acurado dessa doença / Abstract: This work aims to carry out the identification of epitopes of the Citrus tristeza virus (CTV) recombinant coat protein (CB-22 and CB-l04) which are recognized by four monoclonal antíbodies (MAb) produced by Stach-Machado et aI. (2000). MAb 1C.04-12 recognizes CB-22 protein, homologous to CTV isolates that induce weak symptoms in indicators plants; while MAb 39.07 reacts to CB-l04 protein, homologous to severe CTV isolates and, MAbs 30.G.02 and 37.G.ll recognize both proteins. MAb 30.G.02 recognized the sequence formed by amino acids NLHIDPTLI, located at positions 32 to 40, while MAb 37.G.ll recognized the amino acids from 50 to 61, whose sequence is TQQNAALNRDLF. On the other hand, the MAb 39.07 recognized the sequence TDVVFNSKGIGN, located at positions 120 to 131 in CB-l04 protein. MAb 30.G.02 was considered a Universal antibody, once its epitope is conserved in 87.2% of CTV isolates, and can be applied as a coating antibody or even as a detection antibody in ELlSA Sandwich assays. The epitope of MAb 37.G.ll is conserved in 62.6% of sequences and, can be applied as detection antibody, allowing a quick and wide range screening but without strains differentiation. Finally, MAb 39.07 was classified as "Severe" antibody, once its epitope is present at only 19.7% of CTV sequences, which were derived frem severe worldwide CTV isolates. The technique of linear peptides did not allow the epitope determination of MAb 1C.04-12, since this antibody may recognize a conformational epitope in the CB-22 tridimensional structure, according to the early data from our laboratory showing that this MAb did not recognize the CB-22 under denaturating conditions, confirming the conformational nature of its eptiope. The knowledge about structural features of viral coat protein enables acquiring relevant information about biological properties of this protein. The coat protein plays an essential role in the organization and assembly of viral particle, acts in genetic material protection and, probably is involved in the interaction with insect-vector and with host plant, being responsible for the movement of viral particle in the infection processo However, there are not any data in Protein Data Bank (PDB) about the secondary and tertiary structures of CTV coat protein, and so, this work carried out a structural study about CB-22 by Circular Oichroism Spectroscopy (CO) and Small-Angle X-ray Scattering (SAXS). The CO data analysis demonstrated a spectrum characteristic of proteins whose secondary structure is predominantly formed by a-helixes, and these results are coherent of predicted structure by PSIPREO software. The SAXS data revealed a highly oligomeric protein comprising many subunits whose quantities are dependent and vary according to the protein concentration in solution. These data, although had impaired the modeling and resolving of CB-22 secondary structure, demonstrated that this recombinant protein maintain the function of native protein, responsible for the assembly of CTV capsid, and this structure without bacterial ONA is also called virus-/ike, which allows to postulate its usefulness as nucleic acid ca rrier in vaccination protocols. Finally, the third objective of this work was the establishment of immunomolecular diagnosis to gram-negative bacterium, Xy/ella fastidiosa, which causes Citrus Variegated Chlorosis in Brazil. We carried out two immunomolecular assays, like !mmmuno,Çapture PCR and !mmuno-PCR for direct detection of X. fastidiosa without ONA isolation. Whereas the reactivity of ELlSA and PCR ranged from 106 to 104 bacterial cells, the IC-PCR sensitivity was up to 103 and the detection limit of I-PCR was up to 101 bacterial cells. Therefore, ICPCR and I-PCR assays provide an alternative for quick and very sensitive rnethods to screening X. fastidiosa, with the advantage of not requiring any concentration or ONA purification steps while still allowing an accurate diagnosis of Cvc / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ana_munhoz_vianna.pdf: 719262 bytes, checksum: c1b68d796b66c4c6c3d0037b6024cb3d (MD5) Previous issue date: 2011-07-25 / The equine piroplasmosis caused by Theileria equi is considered one of the most important equine diseases in both tropical and subtropical countries. Theileriosis is endemic in Brazil and causes significant economic losses for equine breeders. Disease-free countries restrict horse transit coming from endemic areas due to the high prevalence of asymptomatic carrier animals. In order to prevent and control this disease, it is therefore necessary to develop efficient diagnostic methods. Previous Theileria equi immunological diagnostic studies have been based in outer membrane antigens. Equi merozoite antigen (EMA) is a major outer membrane antigen of this protozoan, recognized by antibodies of Theileria equi positive horses. In this study, we reported the expression, purification and characterization of EMA-2 protein of Theileria equi in the yeast Pichia pastoris. The EMA-2 gene was cloned into the expression vector pPICZαB and the expressed protein was secreted to the medium as a soluble form. The expression and antigenicity of rEMA-2 protein was demonstrated by Dot and Western Blotting, using anti-histidine and equine Theileriosis clinically positive antibodies. An indirect ELISA with the rEMA-2 was performed and it was possible to differentiate with more than a threefold difference between negative and positive serum from horses confirmed with Theileriosis. The data obtained in this work suggest that the rEMA-2 protein expressed in P. pastoris is a potential candidate for use as antigen in immunodiagnostic of T. equi. / A Piroplasmose equina causada por Theileria equi é considerada uma das mais importantes doenças dos equinos em regiões tropicais e subtropicais. Acomete os equinos de forma endêmica no Brasil levando a significativas perdas econômicas. Países livres da doença não permitem a entrada de animais provindos de regiões endêmicas devido à alta prevalência de animais assintomáticos. Para controle e prevenção desta enfermidade se faz necessário desenvolvimento de métodos de diagnóstico eficazes. Os estudos sobre o diagnóstico imunológico para Theileriose concentram-se em antígenos da membrana externa. O principal antígeno da membrana externa deste protozoário, Equi Antígeno Merozoite (EMA) é reconhecido por anticorpos de cavalos positivos para Theileria equi. Neste estudo reportamos a expressão, purificação e a caracterização da proteína EMA-2 de Theileria equi na levedura Pichia pastoris. O gene EMA-2 foi clonado no vetor de expressão pPICZαB sendo a proteína expressa, secretada de forma solúvel ao meio. A expressão e antigenicidade da proteína rEMA-2 foi demonstrado por Dot e Western Blotting utilizando-se anti-histidina e anticorpos de equinos clinicamente positivos para Theileriose. Um ELISA indireto com rEMA-2 foi realizado e foi possível determinar uma diferença de mais de três vezes entre os soros de equinos confirmados como positivos e negativos para Theileriose. Com os dados obtidos neste trabalho podemos sugerir que a proteína rEMA-2 é um potencial candidato para ser utilizado como antígeno em imunodiagnóstico de T. equi.