Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-10-24T18:46:15Z No. of bitstreams: 1 2013 - Gisele Santos de Meireles.pdf: 16741114 bytes, checksum: 1d4b03cbd2287a0984257f70efb149da (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-24T18:46:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013 - Gisele Santos de Meireles.pdf: 16741114 bytes, checksum: 1d4b03cbd2287a0984257f70efb149da (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / CAPES / FAPERJ / This study aimed to determine from the protein profile of oocysts of Cystoisospora felis recovered from the sequential use of various purification techniques adapted for specific use in sporulated oocysts of C. felis. With the aid of SDS-PAGE 12% resulted in identification of 25 groups of protein: 266, 240, 186, 165, 140, 119, 112, 105, 98, 90, 78, 55, 47, 42, 37, 35, 30, 27-28, 25, 22, 19, 18, 16, 14 kDa belonging to the structure of sporulated oocysts and sporozoites of C. felis. Based on this results and heterologous bovine serum anti-C. felis was possible to determine polypeptides dominant relevant to diagnostic immunoassay technique with "Western Blotting", these being immunodominant bands: P208, P138, P113, p106, p62, p56, p51, p48, p44, p38, p36, and p33 p27. In order to avoid misdiagnosis from cross-reactivity a positive control serum anti-C. felis was compared to with positive serum anti-Toxoplasma and Neospora in order to exclude the common protein bands, probably markers of gender and group to identify cattle infected naturally or experimentally with C. felis. As showed, the following specific antigenic protein units: p 206-208, P137-139, p112- 113, p104-107, p27-28 are responsible for determining the animal tested positive or not for Cystoisospora felis. Of the analysis of the variables could be observed that the presence of felines related to the handling, size and type of milking properties facilitates dispersion C. felis. / Este trabalho teve por objetivo, diagnosticar a infec??o por Cystoisospora felis em bovinos atrav?s do Western Blotting, apartir de oocistos obtidos com o uso sequencial de v?rias t?cnicas de purifica??o adaptadas para o uso em oocistos esporulados de C. felis. Com o aux?lio do SDS-PAGE a 12 % resultou na identifica??o de 25 grupos proteicos de: 266; 240; 186; 165; 140; 119, 112, 105, 98, 90, 78, 55, 47, 42, 37, 35, 30, 27-28, 25, 22, 19, 18, 16, 14 KDa, pertencentes a estrutura dos oocistos esporulados e esporozoitas de C. felis. Com base nesse resultado e em soro de bovino heter?logo anti-C. felis foi poss?vel determinar os polipept?deos dominantes relevantes ? t?cnica de diagn?stico imunoenzimatico com ?Western Blotting?, sendo estas, as bandas imunodominantes: p208, p138, p113, p106, p62, p56, p51, p48, p44, p38, p36, p33 e p27. A fim de evitar o diagn?stico equivocado a partir de rea??es cruzadas foi feita a compara??o do soro controle positivo anti-C. felis com o soro positivo anti-Toxoplasma e Neospora com o intuito de excluir as bandas proteicas comuns, prov?veis marcadoras de g?nero e grupo para identifica??o de bovinos infectados de maneira natural ou experimental com C. felis. Sendo evidenciadas, as seguintes unidades proteicas antig?nicas espec?ficas: p 206-208, p137-139, p112-113, p104-107, p27-28 respons?veis por determinar a positividade dos animais testados para C. felis. A partir das an?lises das vari?veis foi poss?vel observar que a presen?a de felinos associados, ao manejo, tipo de ordenha e tamanho das propriedades facilita a dispers?o de C. felis.

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-12T19:38:37Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lázaro Moreira Marques Neto - 2014.pdf: 2595139 bytes, checksum: 33c715b27b61926700bbdbafb220894a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-12T19:38:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lázaro Moreira Marques Neto - 2014.pdf: 2595139 bytes, checksum: 33c715b27b61926700bbdbafb220894a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-12T19:38:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lázaro Moreira Marques Neto - 2014.pdf: 2595139 bytes, checksum: 33c715b27b61926700bbdbafb220894a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Tuberculosis (TB) is an ancient plague which affects mankind for thousands of years and remains a serious public health problem, causing illness of over 8 millions and killing more than 1 million people throughout the year. The currently used vaccine, BCG, was developed in 1921 and began to be used in 1924 as a prophylactic agent against tuberculosis, and today is the most widely used vaccine worldwide. The protective potential of BCG is very variable, with rates of protection ranging from 0 to 80%, but it is still used because it protects against the most serious forms of the disease in childhood. Consequently the need for a new vaccine strategy is urgently needed. Subunit protein vaccines and fusion proteins strategy only deal with the components of the organism that best stimulate the immune system rather than using the whole organism system. However, the development of fusion proteins has no defined rules, as approximating artificial peptides from different proteins leads to new and unpredicted intramolecular interactions. In this study we propose the construction of a fusion protein (CDα) composed of antigenic subunits from proteins of Mycobacterium tuberculosis (Ag85c, MPT51 and HspX). The subunits were chosen due to their potential in inducing a Th1-type immune response and especially for its role in activation and induction of various populations of CD8+ T lymphocytes. Based on analyzes in silico we could design primers that allowed the amplification and subsequent fusion of the subunit gene sequences of, and in addition, inserting a hinge sequence of glycine and serine between each subunit that allowed better protein stability. The gene sequence of CDα was inserted into an expression plasmid and transformed into Escherichia coli BL21 and from this it was possible to induce its expression and purify the recombinant protein on a large scale, however, it was not possible to obtain the protein in a soluble form. The protein sequence was confirmed by sequencing the expression plasmid and analysis of purified recombinant protein composition by mass spectrometry MALDI-TOF. The purified protein was used to standardize an immunoassay test to detect human antibodies, and our data show that the CDα is not antigenic for humoral immune response of patients infected with Mtb (latent TB or active TB). Monoclonal antibodies produced by immunization of BALB/c mice generated titers of 1:20,000 against IgG1 and IgG2a, indicating that the protein has immunogenic potential. We conclude that the CDα protein was constructed without any error or mutation, and this was possible due to technical alliance in silico and in vitro, however further studies are needed to purify the protein in soluble form and especially to ascertain their vaccine potential. / A tuberculose (TB) é um mal antigo que assola a humanidade há milhares de anos e ainda hoje é um grave problema de saúde pública, causando adoecimento de mais de 8 milhões e matando mais de 1 milhão de pessoas todo o ano. A vacina utilizada atualmente, a BCG, foi desenvolvida em 1921 e a partir de 1924 passou a ser utilizada como método profilático contra a tuberculose, sendo considerada a vacina mais amplamente utilizada em todo o mundo. Seu potencial protetor é muito variável, tendo índices de proteção variando de 0 a 80%, mas ainda é utilizada porque ela protege contra as formas mais graves da doença na infância. Vacinas de subunidade protéica e proteínas de fusão utilizam da estratégia de poder lidar apenas com os componentes do microrganismo que melhor estimulam o sistema imune ao invés de utilizar o microrganismo inteiro. No entanto, o desenvolvimento de proteínas de fusão não possui regras definidas, pois a aproximação artificial de peptídeos pertencentes a diferentes proteínas acarretam em novas interações intramoleculares cujos resultados ainda não podem ser totalmente previstos. Nesse trabalho propusemos a construção de uma proteína de fusão (CDα) a partir de subunidades de proteínas conhecidamente antigênicas do Mycobacterium tuberculosis (Ag85c, MPT51 e HspX). As subunidades foram escolhidas a partir de seu potencial de induzir uma resposta imune do tipo Th1 e, principalmente, pelo seu papel na ativação e indução de populações diversas de linfócitos T CD8+. Com base em análises "in silico" foi possível construir oligonucleotídeos iniciadores que possibilitaram a amplificação e posterior fusão das sequências gênicas das subunidades além da inserção de uma sequência hinge de glicina e serina entre cada subunidade que permitiram melhor estabilidade da proteína. A sequência gênica da CDα foi inserida em um plasmídeo de expressão e transformada em Escherichia coli BL21 e a partir disso foi possível induzir sua expressão e purificar a proteína em larga escala, contudo, não foi possível obter a proteína em sua forma solúvel. A sequência da proteína foi confirmada pelo sequênciamento do plasmídeo e por análise da constituição protéica por espectrometria de massa MALDI-TOF. A partir da proteína purificada foi possível padronizar a utilização da proteína em teste de imunoensaio demonstrando que a proteína não é antigênica para a resposta imune humoral de pacientes infectados com o Mtb (TB ativa ou TB latente). Produzimos anticorpos monoclonais por imunização de camundongos BALB/c gerando títulos de 20.000 para IgG1e IgG2, indicando que a proteína tem potencial imunogênico. Podemos concluir que, a proteína CDα foi construída sem qualquer erro ou mutação e isso foi possível devido à aliança de técnicas "in silico" e "in vitro", contudo estudos precisam ser feitos para obter a proteína em sua forma solúvel e principalmente para averiguar seu potencial vacinal.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 131-153).