L’objectif principal de cette étude est de déterminer la valeur pronostique de l’infiltrat lymphocytaire dans l’adénocarcinome du pancréas. Les densités des lymphocytes T CD3+, CD4+, CD8+, FOXP3+ et CD45RO+ intratumoraux (T) et péritumoraux (PT) de 111 spécimens ont été mesurées avec des micromatrices tissulaires. Un Index Lymphocytaire (IL) a été créé basé sur les valeurs des CD4+ T, CD8+ PT et le ratio CD3+ T/PT regroupant les patients selon que les tumeurs présentaient aucune (IL---), 1 à 2 (IL+/-) ou les 3 caractéristiques immunitaires favorables (IL+++). La survie médiane des patients atteints d’un cancer du pancréas est significativement différente selon la catégorie d’index lymphocytaire; elle était de 14 mois pour IL---, de 19 mois pour IL +/- et de 29 mois pour IL+++ (p=0,01). L’IL est un facteur indépendant de survie en analyse multivariée ainsi que la différenciation tumorale et l’utilisation d’un traitement adjuvant. L’IL est un facteur pronostique de survie des adénocarcinomes du pancréas réséqués et devrait pouvoir permettre une meilleure classification des patients. / The main objective of this project was to determine the prognostic significance of T-lymphocytes densities in pancreatic adenocarcinoma. Using tissue microarrays, CD3+, CD4+, CD8+, CD45RO+, and FOXP3 T-cells were quantified by immunohistochemistry in the intratumoral (T) and peritumoral (PT) compartments of 111 specimens. An immune score (IS) based on T CD4+ and PT CD8+ counts and T/PT CD3+ ratio grouped patients into IS---, IS+/- and IS+++ if none, 1 or 2, or all 3 of the favorable immune features were present, respectively. Patients have different overall survival (OS) depending on their IS status. Patients IS--- have a median OS of 14 months and of 19 months and 29 months for those IS+/- and IS+++ respectively (log-rank p=0.01). By multivariate analysis, IS was independently associated with survival as were the histological grade and adjuvant therapy. An immune score that combines specific T-cell location and density may have prognostic value in patients with resected pancreatic adenocarcinoma, independently from current pathologic features.

L’immunothérapie tumorale à médiation cellulaire est un traitement qui utilise le système immunitaire des patients afin d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette réponse est produite suite à la reconnaissance des antigènes par les T CD8+. Ces cibles sont appelées antigènes tumoraux (TAA) et définies comme des protéines exprimées par les cellules cancéreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifié Dickkopf-1 (DKK1), une protéine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothérapie à médiation cellulaire efficace requiert l’identification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothérapie pourrait également être améliorées par l’augmentation de la puissance d’action anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spécifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractérisation de l’expression de DKK1 dans les cancers communs et la détermination de son immunogénicité afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints d’un cancer commun, vers un phénotype moins différentié afin d’augmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractérisé l’expression de DKK1 dans le cancer du sein et dans d’autres cancers communs. Le profil d’expression de DKK1 a été étudié par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignées cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. L’expression de DKK1 a aussi été étudiée dans des échantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant d’un cancer du sein exprimaient DKK1. La moitié des tumeurs DKK1(+) était triple négative, donc pas de récepteurs d’œstrogène et de progestérone et était Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilités de traitements très restreintes). De plus, 50% des échantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectuées dans le cancer du poumon ont été, par la suite, corroborées par d'autres groupes qui ont montré une corrélation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Après avoir confirmée l’expression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons évalué l’immunogénicité de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectué des stimulations in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s d’un cancer du sein ou du poumon avec des peptides dérivés de DKK1 pouvant être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont été identifiés et isolés. Par essai multiplex et cytométrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalité d’un ces clones T CD8+ spécifiques à DKK1 a été étudiée et a révélée un profil effecteur, renforçant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans cette première partie de thèse suggèrent une possible utilisation de DKK1 en immunothérapie contre les cancers communs, attribuable à son expression dans ces cancers et la possibilité de faire proliférer des T CD8+ effecteurs spécifiques à DKK1 à partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thèse, je décrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints d’un cancer commun, afin d’augmenter la force et la durée de leurs fonctions anti-tumorales. Il a été démontré que des lymphocytes moins différentiés sont capables d’une réponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons basé ce projet sur l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur conférer un phénotype moins différentié, partageant des caractéristiques de la cellule naïve et de la cellule mémoire. Des cultures de T CD8+, spécifiques à des antigènes viraux, en présence de l’inhibiteur ont permis d’augmenter la sécrétion d’interféron (IFN)- et leur activité cytotoxique. Ces résultats indiquent un effet de l’activation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportées pour la première fois chez les T CD8+ humains et suggèrent une nouvelle stratégie, applicables à l’immunothérapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activité anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont mené à la réalisation d’une étape très importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la démonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux dérivés d’organes importants. Ces travaux ont également mené à la démonstration de l’immunogénicité de DKK1, par l’identification d’un peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, l’étude de la polyfonctionnalité des T CD8+ spécifiques à DKK1 a révélée un profil effecteur favorable pour l’obtention d’une réponse anti-tumorale efficace. Ces découvertes pourraient servir à l’élaboration d’une stratégie d’immunothérapie à médiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, l’étude phénotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donné lieu à l’observation d’un phénotype encore jamais rapporté chez l’humain, conférant aux T CD8+ un aspect moins différentié avec des caractéristiques propre à un phénotype mémoire. Ces résultats sont pertinents dans l’amélioration de l’immunothérapie du cancer, passant par l’augmentation de la persistance des lymphocytes. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse de doctorat fournissent des évidences indéniables quant à la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothérapie à médiation cellulaire des cancers communs. Ces résultats fournissent également des preuves quant à la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par l’activation de la voie de la voie de Wnt, afin de générer des lymphocytes médiateurs plus efficaces pour ce type de thérapie. / Cell-mediated cancer immunotherapy is based on the priming of the patient’s CD8+ T lymphocytes (CD8+ T cells) to mediate an immune response directed against the tumour. This anti-tumour response is antigen-specific and directed against tumour associated antigens (TAA), which are defined as proteins expressed principally by cancer cells and absent from non-malignant tissues. By utilizing a bio-informatic approach, we identified the gene DKK1, a Wnt pathway inhibitor, as a potential TAA. This was an important novel finding as the identification of a new TAA is one of the key elements to enhance cell-mediated cancer immunotherapy. Furthermore, patient treatment options may also be improved through the amplification of the force and duration of the anti-tumour immune response mediated by TAA specific T cells. This thesis is divided in two parts: 1- The characterization of DKK1 expression and immunogenicity in common cancers as validation of TAA candidate. 2- The reprogrammation of CD8+ T cells from patient with common cancers to restore a less-differentiated phenotype in an attempt to improve their anti-tumour response. We first characterized DKK1 expression in breast cancer and other common cancers. In order to prove its specificity to malignant tissues, the DKK1 expression profile was initially established by RT-PCR and ELISA assay using cancer cell lines and in RNA panels from normal tissues. DKK1 expression was also described using clinical samples from breast, lung and kidney cancers. We found that 30% of breast cancer clinical samples were positive for DKK1 expression. Interestingly, half of the triple negative breast cancer tumours (negative for the expression of progesterone and estrogen receptors and Her-2/neu) were DKK1 (+). Moreover, 50% of the lung cancer and 30% of the kidney cancer clinical samples were also DKK1 (+). These results have been corroborated by other groups who recently reported similar observations in lung cancer with a correlation with poor prognosis. After confirming that the DKK1 gene expression profile in common cancer qualifies DKK1 as a relevant TAA, we then explored its immunogenicity. To do so, we performed in vitro stimulations of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from lung and breast cancer patients with DKK1-derived synthetic peptides, which were selected for their capacity to be presented by the major histocompatibility complex (MHC) HLA-A*0201. With this method, we identified and isolated CD8+ T cell clones with a specificity unique for one DKK1 peptide. Cytokine secretion profile of anti-DKK1 T cells was established by cytokine mutiplex assay and flow cytometry. This study revealed that DKK1-specitfic CD8+ T cells had an effector profile with polyfunctionality proprieties, thereby reinforcing DKK1 as a TAA candidate. Altogether, the results obtained in this first part of this thesis suggest the possible use of DKK1 in common cancer immunotherapy as it is principally expressed by malignant tissues and can generate the activation of effector CD8+ T cells. In the second part of this thesis, I will describe in vitro manipulations of patients’ CD8+ T cells in the goal of augmenting their longevity and the strength of the anti-tumour response. Previous research revealed that a less-differentiated phenotype correlated with an augmented capacity of persistence and the intensity of the T cell response. For this project, we generated less-differentiated CD8+ T cells by activating the Wnt pathway with a pharmalogical inhibitor of GSK-3. These less-differentiated T cells shared a phenotype of both naive and memory T cells. As for their immune functions, viral antigen specific CD8+ T cells cultured with the inhibtitor showed an elevation in interferon (IFN)-γ production and cytotoxic activity. This represent the first report of such observations in humans CD8+ T cells and suggest a new stategy to prolonge the persistence of T cells in a cancer immunotherapy setting. In conclusion, this work has strongly contributed to the validation of DKK1 as a TAA for common cancers, as it is expressed in malignant tissues and relatively absent in form normal tissues. It demonstrated the immunogenicity of DKK1 with the identification of a DKK1 peptide recognized by CD8+ T cells. Moreover, these DKK1-specific CD8+ T cells appear to be polyfunctional with an effector profil, which is favorable to mount a potent anti-tumour response. These findings could serve in novel strategies to be exploited in cell-mediated immunotherapy against common cancers. Furthermore, the phenotypic and functional study of the Wnt pathway activation resulting in a less-differentiated CD8+ T cells, generated observations that had never been reported in humans. These findings are relevant for cancer immunotherapy because they could help generate less-differentiated cells with augmented persistance and anti-tumorale capacities. Altogether, the results presented in this doctoral thesis provide significant evidence that DKK1 may serve as a TAA in cell-mediated immunotherapy for patients affected by common cancers and that reprogramming of CD8+ T cells through activation of the Wnt pathway could generate more effective mediator for this type of treatment.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Malgré plusieurs chimiothérapies suivies d’une transplantation et d’une immunothérapie, 40% des patients avec un neuroblastome (NB) à haut risque subissent une progression de la maladie ou une rechute. L’échec de ces traitements est attribué à la présence de cellules initiatrices de tumeur (TIC) qui expriment le marqueur CD133 et qui sont souvent résistantes aux agents chimiothérapeutiques. Les cellules Natural Killer (NK), qui possèdent un effet anti-tumoral, peuvent être utilisées dans le cadre du développement de nouvelles approches immuno-thérapeutiques. Nous posons l’hypothèse que les cellules NK activées éliminent efficacement les TIC et contribuent à la réduction des risques de rechute. De plus, il est possible d’augmenter l’effet anti-tumoral des cellules NK contre le NB. L’activité cytotoxique des cellules NK est augmentée par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) activées. A la suite de la stimulation de leurs récepteurs Toll-like les pDC produisent de grandes quantités d'interféron-alpha (IFN-α). Nous avons étudié les propriétés lytiques des cellules NK contre des lignées cellulaires de NB à la suite de leur activation par l’IFN-α ou des pDC activées. Nos résultats révèlent une augmentation de l’activité cytolytique des cellules NK contre ces lignées en réponse à une stimulation par les pDC activées. De plus, les cellules de NB CD133+ ou celles résistantes à l’immunothérapie dirigée contre le GD2 sont sensibles à la lyse médiée par les cellules NK stimulées par les pDC. Nous avons examiné les mécanismes cellulaires impliqués dans la lyse des cellules de NB. Nous montrons que cette cytotoxicité est médiée en partie par TRAIL induisant l'apoptose et en partie par la libération des granules cytotoxiques. Ainsi, ces résultats permettent de proposer une nouvelle approche immuno-thérapeutique complémentaire au traitement par l’anticorps anti-GD2 pour les patients atteints de NB à haut risque. / Despite aggressive treatment by chemotherapy followed by transplantation and treatment with anti-tumor cell disialoganglioside (GD2) monoclonal antibody, IL-2, GM-CSF and retinoic acid, 40% of patients with high-risk neuroblastoma (NB) still undergo disease progression or relapse. Furthermore, tumor-initiating cells (TIC) expressing the CD133 marker are present in NB tumors and are more resistant to chemotherapy. To evaluate a new immunotherapeutic approach, we took advantage of the anti-tumor effect of Natural Killer (NK) cells. We hypothesized that activated NK cells would be a potent therapeutic strategy to eliminate TIC and reduce relapse of NB. We aimed to establish the best strategy to increase the NK cell mediated cytotoxicity against NB. NK cell cytotoxic activity is increased by cytokines, chemokines and activated plasmacytoid dendritic cells (pDC) which produce high amounts of interferon-alpha (IFN-α) upon Toll-like receptor stimulation. We investigated NK-cell lytic properties against NB cell lines following activation by IFN-α or activated pDC. Our results reveal an increased cytolytic activity of NK cells against NB cell lines after stimulation by activated pDC, CD133+ (TIC) as well as anti-GD2 resistant NB cells are sensitive to NK cell mediated cytotoxicity following stimulation by activated pDC. We also examined the cellular mechanisms involved in NK cell-mediated lysis of NB cell lines. The increased cytotoxicity is partially mediated by TRAIL induced apoptosis and as well as by the release of cytolytic granules. In conclusion, we propose a new immunotherapeutic approach that can be used in combination with the anti-GD2 therapy for the treatment of high-risk NB patients.

La prévalence des allergies alimentaires IgE-médiées aurait triplé au cours de la dernière décennie avec des études Nord-Américaines atteignant les 8% chez les enfants. Quoiqu’il n’y ait à ce jour aucun traitement curatif pour les allergies alimentaires, l’immunothérapie oral (OIT) constitue une nouvelle approche expérimentale prometteuse. Cette dernière consiste en l’administration de doses progressive d’allergènes par voie orale sur une période prolongée dans le but d’instaurer un état de désensibilisation et possiblement une tolérance orale soutenue. Cette approche a été démontrée sécuritaire et permettrait la désensibilisation à haute dose de plus de 80% des participants allergiques aux arachides, lait ou œufs. Dans cette thèse, nous présentons 2 études de phase 1 portant sur des protocoles d’OIT, destinés à optimiser l’efficience du traitement chez les sujets avec allergies alimentaires multiples. Près de 30% des enfants avec allergie alimentaire sont allergiques à plus d’un aliment, une proportion qui augmente à 70% lorsqu’on considère les cas les plus sévères. Ces enfants sont à risque augmenté de réactions accidentelles et souffrent d’un impact plus grand sur leur qualité de vie. Dans la première étude, en créant un mélange individualisé avec un ratio stochiométrique 1:1 entre les protéines des aliments allergiques de l’enfant, nous démontrons qu’il est possible de désensibiliser jusqu’à 5 aliments simultanément avec un profil d’innocuité similaire à une monothérapie. Dans la seconde étude, nous utilisons un traitement à l’omalizumab, un anticorps monoclonal anti-IgE, pour permettre une désensibilisation orale multi-allergénique fortement accélérée. Lorsque comparé à l’approche sans omalizumab, ce protocole s’associe à une nette diminution du temps requis pour atteindre les doses d’entretien, passant d’une médiane de 21 à 4 mois, sans affecter le profil d’innocuité. Alors que ces études fournissent des approches cliniques raisonnables pour désensibiliser la population multi-allergique, plusieurs questions persistent, notamment en ce qui a trait à l’induction de tolérance permanente. Une barrière majeure à cet égard réside dans notre piètre compréhension des mécanismes sous-jacents à l’immunothérapie. Prenant avantage d’échantillons cliniques bien caractérisés provenant des essais cliniques ci-haut mentionnés, nous utilisons les nouvelles technologies de séquençage TCR pour suivre la distribution clonale des lymphocytes T spécifiques aux arachides durant une immunothérapie orale. Nous démontrons que l’OIT s’associe à des changements significatifs dans les fréquences des clones spécifiques, suggérant un processus d’épuisement clonal et de remplacement. Nous démontrons par ailleurs que le test de prolifération lymphocytaire, traditionnellement utilisé pour évaluer la réponse cellulaire allergique, est dominé par une distribution polyclonale hautement non-spécifique. Cette observation a des implications majeures considérant que la plupart de la littérature actuelle sur la réponse T se base sur cette technique. En somme, cette thèse jette les bases pour des programmes de recherche translationnelle pour optimiser et personnaliser les protocoles cliniques actuels et développer de nouvelles avenues d’investigation et de traitement pour améliorer la prise en charge des sujets avec allergies alimentaires. / The prevalence of IgE-mediated food allergies has tripled over the last decade with prospective studies indicating that up to 8% of children may be affected in North America. There is currently no cure for food allergy but oral immunotherapy (OIT) is an experimental approach to treat food allergies. It consists in the progressive administration from minute to large amounts of the allergenic food by the mouth over a prolonged period of time to induce a state of desensitization and possibly sustained tolerance. This approach has been shown to be safe and to allow desensitization to high doses in over 80% of participants allergic to peanuts, milk or egg. In this thesis, we present two phase 1 trials on OIT protocols designed to efficiently treat multiple foods allergies. About 30% of children with food allergy are allergic to more than one food. This proportion increases to 70% when considering the most severe cases. Children with multiple food allergies are at higher risk of accidental reactions and suffer from greater impact on quality of life than those with single food allergies. By creating a customized treatment mix with a 1:1 stoichiometric ratio for the child’s relevant food proteins, we were first able to safely desensitize up to 5 foods simultaneously with a safety profile similar to single allergen therapy and a minimal increase in time to maintenance. Then, taking advantage of recent evidence showing that omalizumab, an anti-IgE receptor monoclonal antibody, can significantly raise reaction thresholds in food allergic subjects, we used short courses of omalizumab to allow very rapid oral desensitization to various foods in a second phase 1 study. When compared to “standard” multi-OIT, the omalizumab-enabled rush protocol resulted in a decreased time to maintenance from a median of 21 to 4 months. While these studies provide reasonable clinical approaches to this population, many questions remain, especially with regards to long term tolerance. A major limit to our progress in improving these protocols stems from our lack of understanding of the underlying immune mechanisms of oral immunotherapy. Taking advantage of well phenotyped samples from the afore-mentioned trials, we used next-generation high-throughput TCR sequencing to follow clonal distribution of peanut specific T cells during oral immunotherapy. We found that OIT is associated with significant changes in food-specific clonal frequencies, suggesting clonal exhaustion and replacement as an underlying mechanism of OIT. In addition, we show that the proliferation assay which is traditionally used to assess the cellular response is dominated by a highly non-specific polyclonal distribution. This observation has important implications considering most of the current literature on T cell response to immunotherapy is based on this assay. This highlights the need for the development of new tools to assess the cellular allergic response. Overall this thesis lays the ground for further comprehensive translational research programs on the treatment of food allergy.

CD73 est un ecto-enzyme qui a été associé à la suppression de l'immunité anti-tumorale. Ses valeurs pronostiques et thérapeutiques ont été mises de l'avant dans plusieurs types de cancer. La première hypothèse du projet est que l'expression de CD73 dans la tumeur prédit le pronostic des patients atteints du cancer de la prostate. L'expression de CD73 a été étudiée par immunofluorescence dans des échantillons de tumeur. Puis, des analyses univariées et multivariées ont été conduites pour déterminer si l'expression de CD73 permet de prédire la récidive biochimique des patients. Nous avons déterminé que CD73 prédit indépendamment le pronostic des patients atteints du cancer de la prostate. De plus, nous avons déterminé que son expression dans le tissu normal adjacent ou dans la tumeur prédit différemment la survenue de la récidive biochimique. La deuxième hypothèse est que l'inhibition de CD73 permet d'améliorer l'efficacité d'un vaccin thérapeutique contre le cancer de la prostate. L'effet d'un vaccin de type GVAX a été étudié dans des souris CD73KO ou en combinaison avec un anticorps ciblant CD73. Nous avons observé que l'efficacité du vaccin était augmentée dans les souris où CD73 était absent. Cependant, la combinaison avec l'anti-CD73 n'a pas permis d'améliorer l'efficacité. / The ectoenzyme CD73 has been associated with suppression of anti-tumor immunity. Its prognostic and therapeutic values have been highlighted in many types of cancer. The first hypothesis of this project is that tumor CD73 expression predicts the prognosis of prostate cancer patients. CD73 expression was determined by immunofluorescence in tumor tissues. Univariates and multivariates analysis were conducted to determine if CD73 expression could predict patients' biochemical recurrence. We determined that CD73 predicts independently the prognosis of prostate cancer patients. Moreover, we determined that CD73 expression in normal adjacent tissue or in the tumor predicts differently the occurrence of biochemical recurrence. The second hypothesis is that CD73 blockade enhances the efficacy of a therapeutic vaccine against prostate cancer. The GVAX-like vaccine was studied in CD73KO mice or in combination with an antibody against CD73. We observed that the vaccine was more efficient in mice where CD73 was absent. However, the combination with the anti-CD73 did not enhances the efficacy of the vaccine.

Le transfert de gènes dans les cellules souches hématopoïétiques par des vecteurs lentiviraux s’inscrit dans les protocoles actuels de traitement par thérapie génique de plusieurs maladies monogéniques (B-thalassémie, Adrénoleucodystrophie, SCID…). De même, le transfert de gènes dans les lymphocytes T et B ouvre des perspectives tant au niveau de la thérapie génique que pour l’immunothérapie. Nous avons mis au point des vecteurs lentiviraux pseudotypés par des glycoprotéines chimérique (BaEV/TR) et mutante (BaEVRLess) du rétrovirus endogène de babouin. Nous avons montré que ces nouveaux vecteurs peuvent transduire de manière plus efficace les cellules souches hématopoïétiques stimulées et quiescentes que les vecteurs pseudotypés par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G). Il en est de même pour les vecteurs développés récemment et pseudotypés par les Glycoprotéines H et F du virus de la rougeole. Nous avons aussi comparé la capacité de ces derniers vecteurs à ceux pseudotypés par les glycoprotéines BaEV/TR et BaEVRLess dans le transfert de gènes dans les lymphocytes B et T ainsi que dans l’ensemble des cellules de la lignée T. Nous sommes désormais en mesure de proposer des vecteurs adaptés au transfert de gènes à chaque étape de la différenciation des cellules CD34+ en thymocytes ainsi qu’en lymphocytes T matures. Ceci pourrait permettre de proposer de nouveaux protocoles cliniques en thérapie génique avec une co-transplantation de cellules souches génétiquement modifiées et de cellules T différenciées à partir de ces cellules. Ceci permettrait notamment de réduire les phases d’aplasie actuellement nécessaires pour la greffe de cellules souches. / Lentiviral vectors and their ability to transfer gene into hematopoietic stem cells are currently evaluated for the cure of several single-gene diseases (eg : B-thalassemia, Adrenoleucodystrophy, SCID). Likewise, gene transfer into B and T lymphocytes is of major interest in gene therapy and immunotherapy. We engineered new lentiviral vectors pseudotyped by some chimeric (BaEV/TR) and mutant (BaEVRLess) glycoproteins from the baboon endogenous retrovirus. We demonstrated that these new vectors can transduce more efficiently resting and mild stimulated hematopoietic stem cells than obtained with lentivectors pseudotyped by the glycoprotein G from the vesicular stomatitis virus (VSV-G). It is the same with the recently developed lentiviral vectors pseudotyped by the H and F glycoprotein from measles virus (H/F-LVs). We also compared the ability of the H/F-LVs with the BaEV/TR and BaEVRLess lentiviral vector pseudotype to transfer genes into B and T lymphocytes and into the whole T lineage. From now on, we are able to propose adapted vectors for gene transfer at each stage of differentiation from CD34+ cells to thymocytes and mature T cells. This could allow us to propose some new clinical protocols in gene therapy with a co-transplantation of genetically modified stem cells and their differentiated T progenitors in order to reduce the aplasia stage induced by current transplantation protocols.

Les maladies allergiques sont de plus en plus fréquentent. Elles atteignent souvent l’enfant jeune chez qui l’allergie respiratoire et l’allergie alimentaire sont les principales pathologies. L’unique traitement curatif est l’immunothérapie spécifique d’antigène (ITA), largement développée dans l’allergie respiratoire et encore à ses débuts dans l’allergie alimentaire. Pour adapter au mieux la prise en charge du patient, le diagnostic précis de l’allergie est indispensable et il n’existe actuellement pas d’examen biologique totalement fiable. Seul, la présence d’IgE spécifiques permet de diagnostiquer une sensibilisation à un allergène mais pas une allergie cliniquement symptomatique. Dans une première partie, nous avons étudié l’intérêt d’un test fonctionnel, l’ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot), dans le diagnostic de l’allergie aux acariens chez l’enfant asthmatique. Le nombre de lymphocytes T circulants spécifiques d’acariens sécréteur d’interleukine (IL)-4 ou d’IL-13 était associé à la présence d’une allergie symptomatique, indépendamment des IgE spécifiques. Il était plus élevé dans le cas d’une rhinite allergique sévère et plus faible dans le cas d’une rhinite allergique légère. De plus, il variait au cours de l’année en fonction des saisons avec un pic en automne et un pic en début de printemps. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l’intérêt de l’ELISpot dans le diagnostic de l’allergie au lait de vache chez l’enfant, confirmée par un test de provocation orale en double aveugle. Nous avons décrit que le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine et sécréteurs d’IL-4 et d’IL-13 était associé à l’allergie au lait de vache avec une sensibilité de 100%. Par ailleurs, le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine était également associé à la dose maximale de lait tolérée par l’enfant.Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié la réponse lymphocytaire T au cours d’une ITA sub-linguale (SLIT) d’une part et sous-cutanée (SCIT) d’autre part, chez des enfants asthmatiques allergiques aux acariens suivis pendant une année. Nous avons décrit une diminution des lymphocytes Th2 (sécréteurs d’IL-4 et IL-13) spécifiques d’acariens après 12 mois de SLIT associée à une augmentation des cellules sécrétrices d’IL-10 (Tr1) spécifiques d’acariens après 6 mois de SLIT. De plus, les lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25hiCD127loFoxp3+) étaient augmentés après 12 mois de SCIT. Nous n’avons pas retrouvé de production accrue d’interféron γ (IFNγ) par les lymphocytes T spécifiques d’acariens au cours de la désensibilisation.Au total, ce travail nous a permis de décrire qu’un test fonctionnel, l’ELISpot, permet de réaliser un diagnostic fiable de l’allergie aux acariens et de l’allergie au lait de vache chez l’enfant. Par ailleurs, l’ITA induit une diminution des cellules Th2 et une augmentation des cellules Tr1 par voie sub-linguale ainsi qu’une augmentation des Treg Foxp3+ par voie sous-cutanée sans immunodéviation Th2/Th1, chez l’enfant allergique aux acariens. / Allergic diseases are steadily increasing steadily and especially in children. Allergen specific immunotherapy (desensitization) is the only curative treatment for which accurate diagnosis of allergy is essential. Currently, the presence of specific IgE diagnoses a sensitization to an allergen but not a clinically symptomatic allergy. In a first part, we studied the value of a functional test, the ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot) in the diagnosis of allergy to house dust mites (HDM). The number of circulating HDM-specific IL-4 and IL-13 secreting T cells was associated with the presence of symptoms, regardless of specific IgE and was higher in severe rhinitis than in mild rhinitis. In addition, it varied according to the season with a peak in autumn and a peak in early spring (wet periods with greater allergen exposure). In a second part, we studied the value of ELISpot for the diagnosis of cow's milk allergy in children, confirmed by double blind placebo control food challenge. We found that the number of casein-specific IL-4 and IL -13 secreting T-cells was associated with allergy to cow's milk. It was also inversely correlated to the cow’s milk tolerated cumulative dose. Receiver-operating characteristic (ROC) curve of combined IL-4 and IL-13 analysis was generated. AUC was 0,98 (95% CI 0.90-1.06). For a cut-off of 10 IL-4- and 12 IL-13 secreting T-cells, sensitivity and negative predictive value were 100%.Finally, in the third part, we monitored antigen specific T-cell response in HDM allergic children treated with sublingual ITA (SLIT) on the one hand and subcutaneous ITA (SCIT) on the other hand, during one year. We found a decrease in HDM specific Th2 cells after 12 months of SLIT associated with an increase in HDM specific IL-10 secreting T-cells after 6 months of SLIT. In addition, regulatory T cells (CD4 + CD25hiCD127loFoxp3+) were increased after 12 months of SCIT. In conclusion, this work has allowed us to describe a functional test, the ELISpot, as a reliable tool for the diagnosis of mite allergy and cow's milk allergy in children. In addition, in HDM allergic children, a decrease of Th2 cells and an increase of IL-10 secreting T-cells was found in children treated with SLIT to HDM as well as an increase in Foxp3+ Treg in children treated with SCIT.

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement efficace des Hémopathies malignes. Cependant, les complications des allogreffes parmi lesquelles les infections virales sont associées parfois à une morbidité et une mortalité importantes. Ces infections surviennent en l’absence de reconstitution immunitaire. Un monitoring régulier de la charge virale des principaux agents infectieux impliqués est réalisé mais amène parfois à la mise en oeuvre abusive de traitements anti-viraux qui ne sont pas dénués de toxicité.Dans ce travail, nous proposons d’associer à ce monitoring un suivi régulier de la reconstitution immunitaire spécifique afin de cibler parmi les patients présentant une réactivation ceux qui nécessitent un traitement curatif de ceux qui pourront maîtriser l’infection par leur système immunitaire. Nous illustrons ce propos avec le virus d’Epstein Barr (EBV) et avons en cours une étude sur l’Adénovirus (ADV).Dans certains cas parfaitement ciblés, les traitements anti-viraux s’avèrent inefficaces. C’est pourquoi dans ce travail, nous présentons la mise au point d’une technique de grade clinique de production de lymphocytes T cytotoxiques anti-ADV (CTL anti-ADV) en condition GMP (Good Manufacturing Practice), grâce au système CliniMACS et au Cytokine Capture System de Miltenyi, afin de proposer une immunothérapie adoptive.Nous décrivons par la suite trois expériences cliniques de traitement compassionnel d’une infection ADV post-allogreffe de CSH. Enfin, nous présentons les résultats préliminaires de la production de CTL bispécifique anti-ADV et CMV / Hematopoietic stem cells Transplantation (HSCT) is a well recognized strategy for treatment of haematological malignancies. However, HSCT complications among which the viral infections a reassociated with high morbidity and mortality. These infections arise in the absence of immune reconstitution. Monitoring of viral reactivations after allogeneic HSCT is necessary, to identify patients at risk of viral infections, but not sufficient, as patients may be abusively treated. In this work we propose to combine viral DNA load assessment with specific immune monitoring to target patients who need to be treated. We report a retrospective study investigating EBV infection and EBV-specific immune recovery using the functional IFN Elispot assay in 40 allogeneic HSCT patients. We initiated a similar study with ADV which is pending. However, although patients are correctly targeted, anti-viral treatment is sometimes not effective. We present a study on the development of a complete clinical grade generation of Human anti-Adenovirus cytotoxic T cells in GMP (Good Manufacturing Practice) conditions, thanks to the system CliniMACS and the Cytokine Capture System, to propose an adoptive immunotherapy to the recipient.We describe afterwards three clinical experiments of treatment of an ADV infection after HSCT.Finally, we present the preliminary results of the anti-ADV and -CMV bi-specific CTL production.

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement standard pour hémopathies bénigne ou malignes et immunodéficience primaire. Cependant, sauf le GvHD et la rechute de la maladie, l’infection microbiologique notamment l’infection virale est la complication fréquente des allogreffes qui est souvent responsable de la morbidité et la mortalité. Ces infections surviennent souvent en l’absence de reconstitution immunitaire. Les traitements médicamenteux anti-viraux qui ne sont pas toujours efficace et avec une toxicité non inégligeable. Donc le traitement prometteux est l’immunothérapie cellulaire notamment celui-ci avec l’injection de lymphocytes T spécifiques anti-viraux (VSTs). A UTCT, la production de VSTs-ADV a été mis au point depuis 2010 et une protocole clinique avec VSTs-ADV est en cours. Donc mon travail est s’inscrit dans ce thème pour produire les VSTs-EBV afin de proposer une protocole clinique. Comme les lymphocytes T ont plusieurs sous-populations, chaque sous-population présente des caractères différentes et leur efficacité en immunothérapie est limité par leur caractère. Notamment avec la découverte de Lymphocytes T mémoire à cellules souches (TSCM) qui joue un rôle très important en immunothérapie anti-cancéreux ou anti-viraux, nous nous intéréssons à étudier la compostion de sous-populations de VSTs. A la fin, c’est toujours avantageux de produire le VSTs contre deux ou plusieurs virus simutanément avec une économie financielle et personnelle. Nous voulons produire le VSTs bispécifique. Dans ce travail, premièrement, nous montrons le résulat de la mise au point de la production de VSTs-EBV de grade clinique qui est confromé à la réglémentation européenne. 6 productions ont été réalisées avec un antigène synthétique préablement défini qui est compatible avec utilisation clinique. In vitro, ces VSTs-EBV montre une spécificité, efficacité et non toxicité. Deuxième, nous illustrons nos résulats sur l’étude déscriptive de sous-populations de VSTs-ADV et CMV. D’abord nous montrons la distribution de sous-populations de VSTs chez les donneurs saints (avant la séléction), puis nous analysons la distribution après séléction immunomagnétique et aussi après expansion in vitro avec cytokine IL-2. A la fin, nous montrons nos résultats préliminaires sur les 3 productions de VSTs bispécifique anti-ADV et anti-EBV. Et nous les comprarer avec les VSTs monospécifique au niveau de qualité de production et spécificité, efficacité et toxicité in vitro / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the standard treatment for malignant or non-malignant hematological disorders or primary immunodeficiencies. However, microbiological infections especially viral infections are the major cause for morbidity and mortality for the patients after HSCT except the GvHD and disease relapse. It comes often in the period of absence of cellular immunity when the antiviral treatment is not always efficiency with an important toxicity. So the alternative treatment is adoptive cellular immunotherapy by infusion of virus specific T cells (VSTs) which has been shown efficacy in virus infections control after HSCT. In UTCT, they have produced the VSTs-ADV with a good procedure conforming to the European laws for clinical use and a clinic trial is in processing. So my work was to produce the VSTs-EBV with the same model aiming to promote a clinic trial in future. Furthermore, there are several subsets of T lymphocytes. Each subset has their own unique feature which decides their efficacy in viral infection control. Especially the discovery of stem cell like memory T cells (TSCM) with an important self-renewed ability which is critical in successful immunotherapy in viral infection or tumor control inspire us to study the distribution of subsets for VSTs. Finally, it’s advantageous to produce the VSTs targeted two or more virus in the same time with one production which is more economical. So we are interested in producing the VSTs bi-specific to ADV and EBV. Here, we present firstly our results of six production of VSTs-EBV with a synthesized antigen which is compatible with clinic use and is defined in advance. Also the specificity, efficiency in eliminating the virus and the non toxicity with a weak alloreactivity are confirmed in vitro after a short-term cell culture with IL-2. Then we showed the results obtained with the T cell subset study in producing the VSTs-ADV for clinical trial and VSTs-CMV for validation of clinical grade medium TEXMACS for cell culture in producing the VSTs. We describe the distribution of T cell subsets in healthy donors (Before selection), also after selection and after expansion in vitro with IL-2. Finally, we present the preliminary results of producing the VSTs bi-specific with three donors, in total 3 VSTs-ADV, 3 VSTs-EBV and 3VSTs-ADV/EBV are generated. The comparison between the bi-specific VSTs and mono-specific VSTs in aspect of specificity, efficiency to eliminate the viral infection and toxicity of presenting the alloreactivity in vitro showed advantage to produce the bi-specific VSTs with one selection in keeping the same specific, efficiency and weak toxicity as mono-specific VSTs