Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2014-09-29T19:48:15Z No. of bitstreams: 3 license_text: 22302 bytes, checksum: 1e0094e9d8adcf16b18effef4ce7ed83 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2014RuandaSilvaRafael.pdf: 903715 bytes, checksum: 324efd3857a20f7e9735070f16b1b6f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2014-10-06T14:07:37Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_text: 22302 bytes, checksum: 1e0094e9d8adcf16b18effef4ce7ed83 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2014RuandaSilvaRafael.pdf: 903715 bytes, checksum: 324efd3857a20f7e9735070f16b1b6f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-06T14:07:37Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_text: 22302 bytes, checksum: 1e0094e9d8adcf16b18effef4ce7ed83 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2014RuandaSilvaRafael.pdf: 903715 bytes, checksum: 324efd3857a20f7e9735070f16b1b6f9 (MD5) / A enzima β – galactosidase é reconhecida por catalisar a hidrólise da lactose e possibilitar a formação de galactooligossacarídeos. O objetivo do presente trabalho foi estudar diferentes condições de imobilização de β – galactosidases de Aspergillus oryzae e Kluyveromyces lactis utilizando suporte comercial Immobead. Ambas as enzimas foram imobilizadas nos suportes tratados e não tratados com etilenodiamina e submetidas a processos de imobilização uni e multipontual. Os derivados também foram avaliados quanto ao bloqueio dos grupamentos epóxi com glicina. As análises de estabilidade ao armazenamento sob refrigeração, estabilidade térmica, ciclos de reuso para hidrólise da lactose, determinação das propriedades cinéticas e determinação de pH e temperatura ótimos foram realizadas nos derivados obtidos. Os resultados de eficiência de imobilização variaram de 30 a 50% e os valores de rendimento variaram entre 80 e 90%. Modificações químicas no suporte foram realizadas utilizando etilenodiamina com o objetivo de gerar modificações químicas no suporte, causando a rápida adsorção de enzimas e favorecendo a formação de ligações covalentes multipontuais em tempo reduzido. Verificou-se que suportes modificados com etilenodiamina imobilizaram a mesma carga de enzimas em menor tempo, quando comparados a suportes sem modificação. Entretanto, a significativa perda de atividade verificada nesses suportes durante os ciclos de reuso sugere que a superfície do suporte possa ter sido modificada em sua totalidade, dificultando a formação de ligações covalentes e permitindo a lixiviação de enzimas para o meio reacional. Derivados não bloqueados apresentaram perda considerável de atividade enzimática durante a armazenagem, indicando a ocorrência de possíveis distorções da enzima, ocasionadas pela interação de grupamentos epóxi livres. Ensaios submetidos à imobilização multipontual apresentaram melhorias em sua estabilidade térmica. Os valores de Km para as enzimas imobilizadas de K. lactis e A. oryzae foram 49,69 e 55,29 mM, valores superiores àqueles verificados para as enzimas livres (19,11 e 17,37 mM, respectivamente), indicando possíveis alterações conformacionais na estrutura da proteína, resultantes do processo de imobilização. Os resultados indicaram que derivados não tratados com etilenodiamina, submetidos à imobilização covalente multipontual e bloqueio com glicina apresentaram os resultados mais expressivos para as condições estudadas de estabilidade ao armazenamento, estabilidade térmica e ciclos de reuso para hidrólise de lactose. Esses derivados não apresentaram distorções em relação às condições ótimas de temperatura e pH quando comparadas com as respectivas enzimas livres. As β – galactosidases de A. oryzae e K. lactis submetidas à imobilização covalente multipontual no suporte Immobead posteriormente bloqueado com glicina apresentaram as melhores propriedades para futura aplicação industrial.

Esta tese aborda quatro tópicos fundamentais para o desenvolvimento e aplicação de membranas eletroativas nanoestruturadas (MENs): (i) síntese e caracterização de nanopartículas (Nps) de prata, ouro e platina encapsuladas em moléculas de dendrímero poliamidoamina geração 4 (PAMAM); (ii) preparação de filmes automontados contendo PAMAM e Nps de ouro (PAMAM-Au); (iii) preparação de MENs utilizando sistema core-shell PAMAM-Au@Me, onde Me é um mediador redox; (iv) imobilização enzimática em MENs e estudos biocatalíticos associados a processos eletroquímicos. As Nps foram caracterizadas observando-se a banda plasmônica em espectros na região do UV-Vis. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que PAMAM-Au e PAMAM-Pt possuem morfologias esféricas, enquanto o PAMAM-Ag forma grandes cristais com estruturas fractais. Estruturas cúbicas de face centrada caracterizaram os cristais formados de Au e Pt, sendo possível estimar os diâmetros (3,0 nm) das Nps pela equação de Scherrer em difratogramas de raios X, confirmados posteriormente por microscopia eletrônica por transmissão (TEM). Um indício de estabilização por encapsulamento do híbrido PAMAM-Au foi obtido de espectros de infravermelho (FTIR), a partir de modificações nas bandas das amidas. A cinética de reação para formação de PAMAM-Au também foi estudada. Filmes de PVS/PAMAM-Au (onde PVS é o poli(ácidovinilssulfônico)) foram preparados com 5 minutos de imersão, com a mesma quantidade de material sendo adsorvida em cada camada, segundo medidas de espectroscopia UV-Vis e voltametria cíclica (CV). No caso do eletrodo ITO-(PVS/PAMAM-Au), saltos de elétrons foram considerados o mecanismo de transporte de carga ao longo do filme. Um novo sistema core-shell Au@PB foi preparado, formando um sistema ITO-(PVS/PAMAM-Au)6@PB, em que a eletrodeposição de PB (azul da Prússia) foi monitorada medindo-se as correntes faradaicas durante os ciclos potenciodinâmicos. Outros mediadores de hexacianoferratos de metais de transição (Fe, Ni, Co e Cu) foram obtidos sobre eletrodos de ITO-(PVS/PAMAM-Au). De resultados de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS), verificou-se que a resistência de transporte de carga decresce na sequência CuHCF > FeHCF > NiHCF > CoHCF e todos os eletrodos apresentaram atividade catalítica para o peróxido de hidrogênio. Uma nova configuração de eletrodo, ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF-GOx, pôde ser aplicada como dispositivo enzimático, com a glicose oxidase (GOx) sendo imobilizada por drop-coating na superfície do eletrodo e aplicada em experimentos de biocatálise. A glicose pôde ser detectada a 0,0 V (Ag/AgCl), com resposta linear até 100 µmol L-1 de glicose, sensibilidade de 115 nA mmol L-1, limite de detecção de 5,5 µmol L-1 e KMapp de 0,24 mmol L-1, mostrando que o sistema aqui proposto cria um ambiente propício para a enzima operar com alta atividade catalítica. / This thesis addresses four fundamental topics for producing and applying electroactive nanostructured membranes (ENMs): (i) synthesis of Au, Pt and Ag nanoparticles (Nps) using polyamidoamine (PAMAM generation 4) dendrimers as template/stabilizers; (ii) fabrication of layer-by-layer (LbL) films comprising PAMAM with AuNps (PAMAM-Au) and poly(vinylsulfonic acid) (PVS); (iii) preparation of a new core-shell system with Prussian blue (PB) around the Au nanoparticles (PAMAM-Au@PB); (iv) enzyme immobilization on ENMs and bioelectrochemistry studies. The formation of the Nps inside PAMAM was monitored by measuring the plasmonic band of NPs via UV-Vis spectroscopy. Images from transmission electron microscopy (TEM) showed well-organized Au and Pt spherical particles, with average diameter of 3 nm and narrow size distribution. In addition, X-ray diffraction of Nps enabled easy identification of the Nps atomic planes (face-centered cubic arrangements). However, PAMAMAg growth showed fractals structures. In order to confirm Au NPs encapsulation inside the PAMAM dendrimer, FTIR spectra in the transmission mode for neat PAMAM and PAMAM-Au were compared. The kinetics of formation of PAMAM-Au was studied by UV-Vis spectroscopy. The deposition of individual PAMAM-Au layers was examined in detail: the adsorption kinetics was determined by CV to be first-order and that 5 min of adsorption was sufficient for maximum coverage. Formation of PVS/PAMAM-Au multilayers showed a linear increase in anodic and cathodic peak currents, indicating that the same amount of material was adsorbed in each deposition step. Electron-hopping was inferred as the charge transport mechanism between PAMAM-Au layers. Using hexacyanoferrate (III) to probe the electrochemical reaction at the electrode surface, the charge transport in the PAMAM-Au layers was shown to be faster than for non-modified electrodes. A new system based on PAMAM-Au@PB was prepared by simple potential cycling electrodeposition after ITO-PVS/PAMAM-Au LbL film preparation. New systems are described based on ENM membranes of ITOPVS/ PAMAM-Au LbL electrodes, with a redox mediator (Me) electrodeposited around Au nanoparticles. The resulting ITO-PVS/PAMAM-Au@Me system was then characterised electrochemically using cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. We demonstrated that the concept of ENM can be generalized to a wider variety of redox mediators. All electrodes modified with hexacyanoferrates showed electrocatalytic activity towards hydrogen peroxide, which is promising for the preparation of nanodevices requiring redox mediators. An electrochemical enzyme device with glucose oxidase (GOx) immobilized at ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF ENM was developed. Using CoHCF as redox mediator, hydrogen peroxide (the enzymatic reaction product) was determined at 0.0 V (vs. SCE), with linear range up to 100 Zmol L-1 of glucose, sensitivity of 115 nA mmol L-1, detection limit of 5.5 Zmol L-1 and KM app of 0.24 mmol L-1. Such a performance indicates that this system promotes a friendly environment for enzyme immobilization.

Esta tese aborda quatro tópicos fundamentais para o desenvolvimento e aplicação de membranas eletroativas nanoestruturadas (MENs): (i) síntese e caracterização de nanopartículas (Nps) de prata, ouro e platina encapsuladas em moléculas de dendrímero poliamidoamina geração 4 (PAMAM); (ii) preparação de filmes automontados contendo PAMAM e Nps de ouro (PAMAM-Au); (iii) preparação de MENs utilizando sistema core-shell PAMAM-Au@Me, onde Me é um mediador redox; (iv) imobilização enzimática em MENs e estudos biocatalíticos associados a processos eletroquímicos. As Nps foram caracterizadas observando-se a banda plasmônica em espectros na região do UV-Vis. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que PAMAM-Au e PAMAM-Pt possuem morfologias esféricas, enquanto o PAMAM-Ag forma grandes cristais com estruturas fractais. Estruturas cúbicas de face centrada caracterizaram os cristais formados de Au e Pt, sendo possível estimar os diâmetros (3,0 nm) das Nps pela equação de Scherrer em difratogramas de raios X, confirmados posteriormente por microscopia eletrônica por transmissão (TEM). Um indício de estabilização por encapsulamento do híbrido PAMAM-Au foi obtido de espectros de infravermelho (FTIR), a partir de modificações nas bandas das amidas. A cinética de reação para formação de PAMAM-Au também foi estudada. Filmes de PVS/PAMAM-Au (onde PVS é o poli(ácidovinilssulfônico)) foram preparados com 5 minutos de imersão, com a mesma quantidade de material sendo adsorvida em cada camada, segundo medidas de espectroscopia UV-Vis e voltametria cíclica (CV). No caso do eletrodo ITO-(PVS/PAMAM-Au), saltos de elétrons foram considerados o mecanismo de transporte de carga ao longo do filme. Um novo sistema core-shell Au@PB foi preparado, formando um sistema ITO-(PVS/PAMAM-Au)6@PB, em que a eletrodeposição de PB (azul da Prússia) foi monitorada medindo-se as correntes faradaicas durante os ciclos potenciodinâmicos. Outros mediadores de hexacianoferratos de metais de transição (Fe, Ni, Co e Cu) foram obtidos sobre eletrodos de ITO-(PVS/PAMAM-Au). De resultados de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS), verificou-se que a resistência de transporte de carga decresce na sequência CuHCF > FeHCF > NiHCF > CoHCF e todos os eletrodos apresentaram atividade catalítica para o peróxido de hidrogênio. Uma nova configuração de eletrodo, ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF-GOx, pôde ser aplicada como dispositivo enzimático, com a glicose oxidase (GOx) sendo imobilizada por drop-coating na superfície do eletrodo e aplicada em experimentos de biocatálise. A glicose pôde ser detectada a 0,0 V (Ag/AgCl), com resposta linear até 100 µmol L-1 de glicose, sensibilidade de 115 nA mmol L-1, limite de detecção de 5,5 µmol L-1 e KMapp de 0,24 mmol L-1, mostrando que o sistema aqui proposto cria um ambiente propício para a enzima operar com alta atividade catalítica. / This thesis addresses four fundamental topics for producing and applying electroactive nanostructured membranes (ENMs): (i) synthesis of Au, Pt and Ag nanoparticles (Nps) using polyamidoamine (PAMAM generation 4) dendrimers as template/stabilizers; (ii) fabrication of layer-by-layer (LbL) films comprising PAMAM with AuNps (PAMAM-Au) and poly(vinylsulfonic acid) (PVS); (iii) preparation of a new core-shell system with Prussian blue (PB) around the Au nanoparticles (PAMAM-Au@PB); (iv) enzyme immobilization on ENMs and bioelectrochemistry studies. The formation of the Nps inside PAMAM was monitored by measuring the plasmonic band of NPs via UV-Vis spectroscopy. Images from transmission electron microscopy (TEM) showed well-organized Au and Pt spherical particles, with average diameter of 3 nm and narrow size distribution. In addition, X-ray diffraction of Nps enabled easy identification of the Nps atomic planes (face-centered cubic arrangements). However, PAMAMAg growth showed fractals structures. In order to confirm Au NPs encapsulation inside the PAMAM dendrimer, FTIR spectra in the transmission mode for neat PAMAM and PAMAM-Au were compared. The kinetics of formation of PAMAM-Au was studied by UV-Vis spectroscopy. The deposition of individual PAMAM-Au layers was examined in detail: the adsorption kinetics was determined by CV to be first-order and that 5 min of adsorption was sufficient for maximum coverage. Formation of PVS/PAMAM-Au multilayers showed a linear increase in anodic and cathodic peak currents, indicating that the same amount of material was adsorbed in each deposition step. Electron-hopping was inferred as the charge transport mechanism between PAMAM-Au layers. Using hexacyanoferrate (III) to probe the electrochemical reaction at the electrode surface, the charge transport in the PAMAM-Au layers was shown to be faster than for non-modified electrodes. A new system based on PAMAM-Au@PB was prepared by simple potential cycling electrodeposition after ITO-PVS/PAMAM-Au LbL film preparation. New systems are described based on ENM membranes of ITOPVS/ PAMAM-Au LbL electrodes, with a redox mediator (Me) electrodeposited around Au nanoparticles. The resulting ITO-PVS/PAMAM-Au@Me system was then characterised electrochemically using cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. We demonstrated that the concept of ENM can be generalized to a wider variety of redox mediators. All electrodes modified with hexacyanoferrates showed electrocatalytic activity towards hydrogen peroxide, which is promising for the preparation of nanodevices requiring redox mediators. An electrochemical enzyme device with glucose oxidase (GOx) immobilized at ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF ENM was developed. Using CoHCF as redox mediator, hydrogen peroxide (the enzymatic reaction product) was determined at 0.0 V (vs. SCE), with linear range up to 100 Zmol L-1 of glucose, sensitivity of 115 nA mmol L-1, detection limit of 5.5 Zmol L-1 and KM app of 0.24 mmol L-1. Such a performance indicates that this system promotes a friendly environment for enzyme immobilization.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.

LIMA, Ariosvana Fernandes. Imobilização de uma β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-1564 cultivada em soro de leite. 2012. 100 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, RENORBIO, Centro de Ciências, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:46:24Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) Previous issue date: 2012 / The enzymatic hydrolysis of lactose by β-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products, such as the production of milk containing low concentrations of lactose, the prevention of crystallization in dairy products, and the use of galactosyltransferase for synthesizing galacto-oligosaccharides. In this context, this work aims to study how Kluyveromyces strains can be used to produce β-galactosidase from an agro-industrial by-product such as whey. The species studied were K. marxianus (LAMI CE 025, CCA 510, ATCC 36907) and K. lactis(NRRL Y-1564 and Y-4087). This work also aims to investigate the immobilization of the enzyme onto chitosan and determine its properties such as the optimal operating pH and temperature, the thermal stability of the enzyme, the thermal desnaturation constant, the half-life and the kinetic parameters Km and Vmax using ONPG as substrate of the enzyme β-galactosidase from Kluyveromyces lactis strain NRRL Y1564. K. marxianus LAMI CE 025 and CCA 510 did not consume lactose of the complex medium. The other strains were studied for β-galactosidase production in whey. The maximum enzymatic activity of 3.7 U/mL was achieved by K. lactis NRRL Y-1564 after 12h of fermentation at 180 rpm and 30°C, being selected as a microorganism for β-galactosidase production. The optimal pH for soluble β-gal activity was found to be 6.5 while the optimal pH for immobilized β-gal activity was found to be 7.0, while the optimal operating temperatures were 50°C and 37°C, respectively. The soluble and immobilized enzyme showed similar deactivation profiles at 40°C. For more than 200 min, both biocatalysts showed the same stability, retaining approximately 50 % of their initial activities. However, However, the immobilized enzyme showed an increased stability (8 times) at 50°C. In the lactose hydrolysis at 37°C and pH 7.0 by soluble enzyme was observed a conversion of 58.68% using a enzymatic charge of 2.0 U and 17.57% to 0.5 U. The immobilized enzyme was reused for 10 cycles, showing a good operational stability by retaining more than 74% of its initial activity. The immobilized enzyme retained 100% of its initial activity when it was stored at 4°C and pH 7.0 for a period of 93 days. The soluble β-galactosidase lost 9.4% of its initial activity when it was stored at the same conditions. According to these results, an alternative culture medium prepared by using deproteinized whey supplemented with yeast extract was efficiently used for the production of β-galactosidase through the cultivation of Kluyveromyces strains. Chitosan activated with glutaraldehyde is a suitable alternative low cost support for β-galactosidase immobilization, providing the immobilized enzyme with higher thermal, operational and storage stabilities in comparison with the soluble enzyme. / A hidrólise enzimática da lactose por β-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, sendo uma das aplicações à obtenção de leite com lactose reduzida para o consumo por indivíduos com intolerância à lactose, produção de cápsulas de enzimas para tratamento e a prevenção da cristalização em produtos lácteos. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando a seleção de cepas de Kluyveromyces produtoras da enzima β-galactosidase usando um resíduo agroindustrial, o soro de leite como meio de cultivo. Inicialmente, realizou-se a seleção de espécies de Kluyveromyces capazes de produzir β- galactosidase utilizando lactose como fonte de carbono, em meio complexo e posteriormente em soro de leite (50 g/L de lactose) desproteinado e suplementado com extrato de levedura (1 g/L). Após definir a levedura que apresentava maior produção da enzima de interesse, estudou-se a produção e a viabilidade de imobilizá-la em quitosana. Após, caracterizou-se a enzima solúvel e imobilizada, consistindo na determinação do pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, estimativa dos parâmetros termodinâmicos e determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando como substrato ONPG. As cepas de K. marxianus LAMI CE025 e CCA 510 não consumiram lactose em meio complexo. As demais cepas foram avaliadas quanto à produção de β-galactosidase em soro de leite. A atividade máxima de 3,7 U/mL foi obtida por K. lactis NRRL Y-1564 após 12 h de cultivo a 180 rpm e 30ºC, sendo selecionada como micro-organismo para a produção da β-galactosidase. O pH ótimo para a enzima solúvel e imobilizada foram 6,5 e 7,0, respectivamente, e temperatura ótima de 50 e 37°C para a β-galactosidase solúvel e imobilizada, respectivamente. A enzima solúvel e imobilizada mostrou perfis semelhantes de desactivação a 40 ° C. Durante mais de 200 min, ambos os biocatalisadores mostrou a mesma estabilidade, retendo cerca de 50% da sua actividade inicial. Entretanto, a 50ºC, a enzima imobilizada mostrou uma maior estabilidade térmica, sendo 8 vezes mais estável. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 3,34 mM e 1,78 mM/min para a β-galactosidase solúvel comparado com 3,68 mM e 3,38 mM.min para a enzima imobilizada. Na hidrólise de lactose utilizando a enzima solúvel a 37ºC e pH 7,0 foi verificada uma conversão de 30,77% da lactose para a carga de 2,0 U e 9,8% usando 0,5 U. Após o 10º reciclo de uso, a enzima imobilizada reteve 74% da atividade inicial. A β-galactosidase imobilizada, estocada em tampão fosfato de potássio pH 7,0 a 4°C manteve 100% de sua atividade enzimática inicial no período de 93 dias. A β-galactosidase solúvel perdeu 9,4% de sua atividade inicial quando foi estocada nas mesmas condições. De acordo com os resultados obtidos, o soro de leite mostrou-se uma fonte de carbono alternativa para produção de β-galactosidase de K. lactis NRRL Y1564 e a quitosana ativada com glutaraldeído é um suporte alternativo adequado de baixo custo para imobilização da β-galactosidase, proporcionando a enzima imobilizada estabilidades térmicas, operacional e de armazenamento comparado com a enzima solúvel.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.

As caprilinas são acilgliceróis de cadeia média com diversas aplicações nos campos alimentício, farmacêutico e cosmético. A esterificação direta é um processo importante para a síntese de caprilinas, dado que o glicerol é subproduto da produção de biodiesel e que a tricaprilina, material de partida para a glicerólise e hidrólise, não é um composto abundante naturalmente. As reações existentes para a síntese de acilgliceróis podem ser catalisadas por via química ou enzimática, sendo esta última superior em diversos aspectos. Dois dos principais contrapontos à utilização de enzimas são seu alto custo e dificuldade de recuperação. A imobilização de enzimas é uma das maneiras existentes para contornar estas questões. A maioria dos estudos científicos relativos à obtenção destes compostos refere-se aos acilgliceróis de cadeia longa. Portanto, é necessário aprimorar a esterificação direta entre o glicerol e ácido caprílico catalisada por lipase, através da compreensão da cinética reacional e da influência dos parâmetros reacionais. A existência de uma metodologia de separação, identificação e quantificação simples e eficaz também é importante, tornando as pesquisas relacionadas às caprilinas mais rápidas e menos complicadas. Desta maneira, este trabalho consistiu de três etapas principais: (1) a imobilização de lipases em resinas de troca aniônica, visando reduzir os custos em relação à lipase imobilizada comercial; (2) o desenvolvimento de um método de cromatografia em camada delgada capaz de quantificar as caprilinas formadas; (3) o estudo da reação de esterificação para a obtenção de caprilinas em regime descontínuo e descontínuo-alimentado. A resina DOWEX® 1X2-400 foi a que apresentou a melhor eficiência de imobilização (EI) da Palatase®. Sua atividade lipolítica foi apenas 12,7% inferior à versão imobilizada comercial da lipase, a Lipozyme®RM IM, indicando a viabilidade de substituição desta última. O desenvolvimento de método de cromatografia em camada delgada resultou em relações lineares para a detecção e quantificação de ácido caprílico, monocaprilina, dicaprilina e tricaprilina com R2 e R2pred de 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectivamente, e com valor-p de 0,000. As reações em regime descontínuo foram realizadas seguindo planejamento fatorial completo, no qual foram variadas a temperatura (30 ou 70°C), a proporção molar entre os reagentes (1:1 ou 3:1 - ácido caprílico : glicerol) e o tempo reacional (6 ou 10h). A análise de regressão do rendimento reacional expresso em porcentagem de consumo de ácido caprílico indicou que, nestas condições, os fatores relevantes para o resultado final são a temperatura e a proporção molar, bem como a interação entre eles. As melhores condições para a obtenção de mono e dicaprilinas foram, portanto, de 30ºC e razão molar de 1:1. O estudo da cinética da reação indica que 40,4% do ácido caprílico são consumidos na primeira hora e que o consumo máximo ocorre na terceira hora de reação. Houve uma queda drástica no rendimento reacional, quando a reação foi conduzida em regime descontínuo-alimentado, provavelmente devido à menor eficiência catalítica da lipase devido ao baixo teor de água na primeira hora de reação. / Caprylins are medium chain acylglycerols that find several applications in food, pharmaceutical and cosmetic fields. Direct esterification is an important route for the synthesis of caprylins, since glycerol is a byproduct of biodiesel production and tricaprylin, the starting material of glycerolysis and hydrolysis, is not a naturally abundant compound. The glycerides synthesis can be catalyzed by either chemical or enzymatic routes, the latter being superior in several aspects. The biggest issues regarding the use of enzymes are their high cost and difficult recovery. Using immobilized enzymes can minimize these concerns. Most of scientific studies concerning the obtainment of these compounds address to long chain acyglycerols. Thus, the improvement of lipase catalyzed esterification of glycerol and caprylic acid is necessary, by understanding the reaction kinetics and the role of reaction parameters. A simple and effective method of separation, identification and quantification of caprylins is also a relevant contributing factor for easier and faster researches. Therefore, this work consisted of three main steps: (1) immobilization of lipases on anion exchange resins in order to produce a cheaper alternative to imported commercial immobilized lipases; (2) development of a thin layer chromatographic method capable of quantifying caprylins; (3) studying the obtainment of caprylins by direct esterification in batch and fed batch systems. DOWEX® 1X2-400 resin presented the best immobilization efficiency (IE) results. Additionally, its lipolytic activity was only 12.7% lower than the commercial Lipozyme® RM IM, suggesting that Lipozyme\'s substitution is feasible. Regarding the developing of a thin layer chromatography method, linear correlations were obtained for detection and quantification of caprylic acid, monocaprylin, dicaprylin and tricaprylin, with a R2 and R2pred of 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectively, with a p-value of 0,000. The batch reactions were carried out according to a complete factorial design, in which the temperature (30 or 70ºC), the molar ratio between the reagents (1:1 or 3:1) and reaction time (6h or 10h) were varied. The regression analysis of reactional yield expressed in terms of percentage of caprylic acid consumption indicated that only the temperature, molar-ratio and their interaction were important for reaction yields, within the studied conditions. The best conditions related to the obtainment of mono and dicaprylins were 30ºC and molar ratio of 1:1. The reaction kinetics indicates that 40.4% of the caprylic acid is consumed within one hour of reaction and that the maximal consumption was achieved in the third hour. A drastic drop in reaction yield was observed when the fed batch mode was adopted, probably due a lower catalytic efficiency presented by lipase as a result of the lower water content in the first hour of reaction.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema microfluídico, contendo, como componente principal, um reator enzimático constituído de um microcanal fabricado em substrato de poli(metacrilato de metila) e um sistema amperométrico como detector. Para a construção de microcanais foi utilizando equipamento de usinagem a laser de CO2 para escavar os microcanais, que a seguir foram selados termicamente. A superfície interna desse microcanal foi submetida à modificação química com poli(etilenoimina), que se mostrou eficiente para posterior imobilização da enzima glicose oxidase, utilizando glutaraldeído como agente de ligação covalente cruzada, gerando assim um microrreator para determinação amperométrica de glicose. O peróxido de hidrogênio gerado na reação enzimática foi detectado em uma célula eletroquímica em fluxo, localizada externamente ao reator, com eletrodo de platina como eletrodo de trabalho. Uma bomba peristáltica programável foi empregada para promover a injeção de amostra, utilizando tubulação de pequeno diâmetro (0,3 mm), permitindo alcançar reprodutibilidade para a injeção de pequenos volumes, tipicamente da ordem de 5 microlitros de solução. O sistema proposto foi utilizado para a determinação amperométrica diferencial de glicose presente em amostras de refrigerantes, apresentando boa repetibilidade (DPR = 1,72%, n = 50), limite de detecção apreciável (1,40 x10-6 mol L-1), elevada frequência de amostragem (345 amostras h-1) e relativa estabilidade a longo prazo (420 determinações em mais de 20 dias com perda de atividade menor que 50%). As análises realizadas com o sistema proposto neste estudo levaram a resultados concordantes com os obtidos pelo método espectrofotométrico clássico, utilizado para análise de glicose em fluídos biológicos. / This work describes the development of a microfluidic system having as a main component an enzymatic reactor constituted by a microchannel assembled in poly(methyl methacrylate) substrate, connected to an amperometric detector. To manufacture the microchannels, a CO2 laser ablation machine was utilized to engrave the channels, which in sequence were thermally sealed. The internal surfaces of the microchannels were chemically modified with poly(ethyleneimine) which showed good effectiveness for the immobilization of glucose oxidase enzymes using glutaraldehyde as crosslinking agent, producing in this way a microreactor effective for the amperometric detection of glucose. The hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction was detected in the electrochemical flow cell, localized outside of the reactor, using platinum as the working electrode. A programmable peristaltic pump was utilized to inject the samples, utilizing tubes with small diameter (0.3 mm), allowing attain reproducibility even for injections of small volumes, in the order of 5 microliters of solution. The proposed system was applied for differential amperometric determination of glucose content in soft drinks, showing good repeatability (DPR = 1.72%, n = 50) low detection limit (1,40 x10-6 mol L-1), high sample frequency (345 samples h-1) and relatively good stability for long term (420 determinations along more than 20 days, with a decrease of activity lower than 50%). The analysis performed with the system proposed in this study lead to results which agree with those obtained by the classical spectrophotometric method, utilized to analyze glucose in biological fluids.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema microfluídico, contendo, como componente principal, um reator enzimático constituído de um microcanal fabricado em substrato de poli(metacrilato de metila) e um sistema amperométrico como detector. Para a construção de microcanais foi utilizando equipamento de usinagem a laser de CO2 para escavar os microcanais, que a seguir foram selados termicamente. A superfície interna desse microcanal foi submetida à modificação química com poli(etilenoimina), que se mostrou eficiente para posterior imobilização da enzima glicose oxidase, utilizando glutaraldeído como agente de ligação covalente cruzada, gerando assim um microrreator para determinação amperométrica de glicose. O peróxido de hidrogênio gerado na reação enzimática foi detectado em uma célula eletroquímica em fluxo, localizada externamente ao reator, com eletrodo de platina como eletrodo de trabalho. Uma bomba peristáltica programável foi empregada para promover a injeção de amostra, utilizando tubulação de pequeno diâmetro (0,3 mm), permitindo alcançar reprodutibilidade para a injeção de pequenos volumes, tipicamente da ordem de 5 microlitros de solução. O sistema proposto foi utilizado para a determinação amperométrica diferencial de glicose presente em amostras de refrigerantes, apresentando boa repetibilidade (DPR = 1,72%, n = 50), limite de detecção apreciável (1,40 x10-6 mol L-1), elevada frequência de amostragem (345 amostras h-1) e relativa estabilidade a longo prazo (420 determinações em mais de 20 dias com perda de atividade menor que 50%). As análises realizadas com o sistema proposto neste estudo levaram a resultados concordantes com os obtidos pelo método espectrofotométrico clássico, utilizado para análise de glicose em fluídos biológicos. / This work describes the development of a microfluidic system having as a main component an enzymatic reactor constituted by a microchannel assembled in poly(methyl methacrylate) substrate, connected to an amperometric detector. To manufacture the microchannels, a CO2 laser ablation machine was utilized to engrave the channels, which in sequence were thermally sealed. The internal surfaces of the microchannels were chemically modified with poly(ethyleneimine) which showed good effectiveness for the immobilization of glucose oxidase enzymes using glutaraldehyde as crosslinking agent, producing in this way a microreactor effective for the amperometric detection of glucose. The hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction was detected in the electrochemical flow cell, localized outside of the reactor, using platinum as the working electrode. A programmable peristaltic pump was utilized to inject the samples, utilizing tubes with small diameter (0.3 mm), allowing attain reproducibility even for injections of small volumes, in the order of 5 microliters of solution. The proposed system was applied for differential amperometric determination of glucose content in soft drinks, showing good repeatability (DPR = 1.72%, n = 50) low detection limit (1,40 x10-6 mol L-1), high sample frequency (345 samples h-1) and relatively good stability for long term (420 determinations along more than 20 days, with a decrease of activity lower than 50%). The analysis performed with the system proposed in this study lead to results which agree with those obtained by the classical spectrophotometric method, utilized to analyze glucose in biological fluids.

As caprilinas são acilgliceróis de cadeia média com diversas aplicações nos campos alimentício, farmacêutico e cosmético. A esterificação direta é um processo importante para a síntese de caprilinas, dado que o glicerol é subproduto da produção de biodiesel e que a tricaprilina, material de partida para a glicerólise e hidrólise, não é um composto abundante naturalmente. As reações existentes para a síntese de acilgliceróis podem ser catalisadas por via química ou enzimática, sendo esta última superior em diversos aspectos. Dois dos principais contrapontos à utilização de enzimas são seu alto custo e dificuldade de recuperação. A imobilização de enzimas é uma das maneiras existentes para contornar estas questões. A maioria dos estudos científicos relativos à obtenção destes compostos refere-se aos acilgliceróis de cadeia longa. Portanto, é necessário aprimorar a esterificação direta entre o glicerol e ácido caprílico catalisada por lipase, através da compreensão da cinética reacional e da influência dos parâmetros reacionais. A existência de uma metodologia de separação, identificação e quantificação simples e eficaz também é importante, tornando as pesquisas relacionadas às caprilinas mais rápidas e menos complicadas. Desta maneira, este trabalho consistiu de três etapas principais: (1) a imobilização de lipases em resinas de troca aniônica, visando reduzir os custos em relação à lipase imobilizada comercial; (2) o desenvolvimento de um método de cromatografia em camada delgada capaz de quantificar as caprilinas formadas; (3) o estudo da reação de esterificação para a obtenção de caprilinas em regime descontínuo e descontínuo-alimentado. A resina DOWEX® 1X2-400 foi a que apresentou a melhor eficiência de imobilização (EI) da Palatase®. Sua atividade lipolítica foi apenas 12,7% inferior à versão imobilizada comercial da lipase, a Lipozyme®RM IM, indicando a viabilidade de substituição desta última. O desenvolvimento de método de cromatografia em camada delgada resultou em relações lineares para a detecção e quantificação de ácido caprílico, monocaprilina, dicaprilina e tricaprilina com R2 e R2pred de 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectivamente, e com valor-p de 0,000. As reações em regime descontínuo foram realizadas seguindo planejamento fatorial completo, no qual foram variadas a temperatura (30 ou 70°C), a proporção molar entre os reagentes (1:1 ou 3:1 - ácido caprílico : glicerol) e o tempo reacional (6 ou 10h). A análise de regressão do rendimento reacional expresso em porcentagem de consumo de ácido caprílico indicou que, nestas condições, os fatores relevantes para o resultado final são a temperatura e a proporção molar, bem como a interação entre eles. As melhores condições para a obtenção de mono e dicaprilinas foram, portanto, de 30ºC e razão molar de 1:1. O estudo da cinética da reação indica que 40,4% do ácido caprílico são consumidos na primeira hora e que o consumo máximo ocorre na terceira hora de reação. Houve uma queda drástica no rendimento reacional, quando a reação foi conduzida em regime descontínuo-alimentado, provavelmente devido à menor eficiência catalítica da lipase devido ao baixo teor de água na primeira hora de reação. / Caprylins are medium chain acylglycerols that find several applications in food, pharmaceutical and cosmetic fields. Direct esterification is an important route for the synthesis of caprylins, since glycerol is a byproduct of biodiesel production and tricaprylin, the starting material of glycerolysis and hydrolysis, is not a naturally abundant compound. The glycerides synthesis can be catalyzed by either chemical or enzymatic routes, the latter being superior in several aspects. The biggest issues regarding the use of enzymes are their high cost and difficult recovery. Using immobilized enzymes can minimize these concerns. Most of scientific studies concerning the obtainment of these compounds address to long chain acyglycerols. Thus, the improvement of lipase catalyzed esterification of glycerol and caprylic acid is necessary, by understanding the reaction kinetics and the role of reaction parameters. A simple and effective method of separation, identification and quantification of caprylins is also a relevant contributing factor for easier and faster researches. Therefore, this work consisted of three main steps: (1) immobilization of lipases on anion exchange resins in order to produce a cheaper alternative to imported commercial immobilized lipases; (2) development of a thin layer chromatographic method capable of quantifying caprylins; (3) studying the obtainment of caprylins by direct esterification in batch and fed batch systems. DOWEX® 1X2-400 resin presented the best immobilization efficiency (IE) results. Additionally, its lipolytic activity was only 12.7% lower than the commercial Lipozyme® RM IM, suggesting that Lipozyme\'s substitution is feasible. Regarding the developing of a thin layer chromatography method, linear correlations were obtained for detection and quantification of caprylic acid, monocaprylin, dicaprylin and tricaprylin, with a R2 and R2pred of 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectively, with a p-value of 0,000. The batch reactions were carried out according to a complete factorial design, in which the temperature (30 or 70ºC), the molar ratio between the reagents (1:1 or 3:1) and reaction time (6h or 10h) were varied. The regression analysis of reactional yield expressed in terms of percentage of caprylic acid consumption indicated that only the temperature, molar-ratio and their interaction were important for reaction yields, within the studied conditions. The best conditions related to the obtainment of mono and dicaprylins were 30ºC and molar ratio of 1:1. The reaction kinetics indicates that 40.4% of the caprylic acid is consumed within one hour of reaction and that the maximal consumption was achieved in the third hour. A drastic drop in reaction yield was observed when the fed batch mode was adopted, probably due a lower catalytic efficiency presented by lipase as a result of the lower water content in the first hour of reaction.