Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-14Bitstream added on 2014-08-13T18:00:47Z : No. of bitstreams: 1 000753373.pdf: 543622 bytes, checksum: 568807a679f23679d4c54335db59a4d0 (MD5) / O reaparecimento de manifestações clínicas após tratamento eficaz, neste texto identificado como recaída, tem sido pouco avaliado. Assim, foram estudados os casos de recaída observados em 400 pacientes, 93 com a forma aguda/subaguda (FA) e 307 com a crônica (FC), que já tinham apresentado cura aparente, isto é, com cura clínica, normalização da velocidade de hemossedimentação e cura sorológica – caracterizada pela presença de teste negativo à imunodifusão dupla em gel de agar por dois anos. Vinte e um (5,2%) desses pacientes apresentaram recaídas da doença. Três (14,3%) eram do sexo feminino e 18 (85,7%) do masculino, com razão de masculinidade de 6:1. Dos 21 pacientes com recaída, 15 (4,8%) apresentavam a FC e 6 (6,4%) a FA (p>0,05). As reativações ocorreram de 46 a 296 meses após introdução do tratamento (Md=96) e de 4 a 267 meses (Md= 60) após sua suspensão. As formas clínicas não diferiram quanto aos tempos decorridos até a reativação. O diagnóstico sorológico de recaída pela IDD foi feito em apenas 45% dos casos, o que levou à avaliação de outros testes para esse fim. Assim, foi realizado o enzimaimunoensaio (ELISA) e o immunoblotting (IB). A sensibilidade da IDD e do ELISA / 0,710 foi 76,1% em amostras de soro obtidos no pré-tratamento (p=0,25). No diagnóstico de recaída, a sensibilidade da IDD foi menor que no pré-tratamento (80% vs 45%; p=0,017), enquanto o ELISA / 0,710 foi igual (80% vs 65%;p=0,125). A sensibilidade do IB para diagnóstico de recaída foi de 12,5% na identificação da gp70 e 43,8% na da gp43 (p<0,05). A avaliação da acurácia do teste ELISA revelou sensibilidade de 96%, especificidade de 95%, valor preditivo positivo de 95%, valor preditivo negativo de 96% e acurácia de 95,5% quando o cut-off utilizado foi a densidade óptica de 0,710, obtido em função da construção da receiver operator characteristc – ROC, para um intervalo de confiança ... / The reappearance of clinical manifestations after efficacious treatment, here identified as relapse, has been rarely evaluated. Thus, the cases of relapse observed in a cohort of 400 patients, 93 with acute/subacute form (AF) and 307 with chronic form (CF) were studied. They had already reached apparent cure, characterized as clinical cure, normalization of the erythrocyte sedimentation rate and serological cure, with a negative double agar gel immunodiffusion test (DID) for two years after antifungal discontinuation. Twenty-one (5.2%) of these patients had relapses. Three (14.3%) were female and 18 (85.7%) were male, with a male:female ratio of 6:1. Of the 21 relapsed patients, 15 (4.8%) presented the CF and 6 (6.4%) the AF (p>0.05). The relapse occurred 46-296 months after introduction of the treatment (Md=8 yrs) and from 4 to 267 months (Md=5 yrs) after withdrawal. Clinical forms did not differ regarding to the time elapsed until relapse. DID was positive in only 45% of the relapsed cases, which led to the evaluation of other tests to diagnose this condition. Thus, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was standardized and the cut off was determined using the curve receiver operator characteristic – ROC and confidence intervals of 95% and 99%, showing optical densities of 0.710 and 0.850, respectively. Then, serological evaluation was performed using ELISA/0.710 and ELISA/0.850, and immunoblotting identifying gp43 (IBgp43) and gp70 (IBgp70). ELISA 0.710 and DID showed the same sensitivity, 76.1%, in serum samples obtained before treatment (p=0.25). DID sensitivity was lower at relapse than before the initial treatment (45% vs 80%; p=0.017), whereas ELISA/0,710 was the same (65% vs 80%; p=0.125). IBgp70 showed a 12.5% and IBgp43 a 43.8% sensitivity for diagnosing relapse (p<0.05). ELISA/0.710 showed a 96% sensitivity, 95% specificity, 95% positive predictive value, 96% negative ...

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:02:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-14. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:29Z : No. of bitstreams: 1 000849126.pdf: 1214857 bytes, checksum: a2d47dd516d137071a1aa19d9f8af738 (MD5) / A nucleoproteína (NP) do Vírus da Influenza Aviária (VIA) é um importante alvo antigênico no imunodiagnóstico desta doença, devido à sua baixa variabilidade entre as diferentes estirpes do VIA, resultando em uma elevada reatividade cruzada, e por ser também uma proteína altamente imunogênica para hospedeiros vertebrados. Neste estudo, o gene codificador da NP do VIA foi parcialmente clonado e expresso em Escherichia coli como uma proteína recombinante fusionada ao polipeptídeo SUMO e uma etiqueta de poli-histidina para seu uso no desenvolvimento de um ensaio de ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos contra o VIA. A NP recombinante foi expressada na fração solúvel e foi mais facilmente purificada. Após análise em relação aos seus principais sítios de antigenicidade e caracterização por meio de Western blotting, a NP recombinante foi utilizada como uma preparação antigênica no ELISA indireto para detecção de anticorpos contra o VIA presentes em amostras de soro de galinha. A análise comparativa do teste desenvolvido no presente estudo com um ELISA comercial apresentou valores de 95%, 97% e 96,7% de sensibilidade, especificidade e acurácia, respectivamente e um índice κappa de 0,88. Os resultados permitem concluir que a NP recombinante do VIA desenvolvida neste estudo possui características favoráveis para ser aplicada como antígeno no ELISA indireto, constituindo-se em um método sensível e específico para o imunodiagnóstico da Influenza Aviária em galinhas / The nucleoprotein (NP) of Avian Influenza Virus (AIV) is an important antigenic target for immunodiagnosis of this disease, due to its low variability among different AIV strains, resulting in high cross-reactivity, and the also highly immunogenic for vertebrate hosts. In this study, the gene enconding NP of AIV was cloned and expressed in Escherichia coli as a recombinant protein fused to SUMO polypeptide with a polyhistidine tag and used to develop an indirect ELISA for the detection of AIV-specific antibodies. The recombinant NP was expressed in the soluble fraction and easily purified. After Analysis of the main sites of antigenicity and characterization in Western-Blotting, the recombinant NP was optimized as an antigen preparation for indirect ELISA to detect anti-AIV antibodies in chicken serum samples. The comparative analysis of this ELISA with a commercial ELISA showed values of 95%, 97%, 96.7% of sensitivity, specificity and accuracy, respectively, and an agreement of k=0.88. In conclusion, the results indicated that the recombinant NP of AIV produced in this study is a good source of antigen for indirect ELISA and provides a sensitive and specific method for the immunodiagnosis of Avian Influenza in chickens

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006Bitstream added on 2014-06-13T18:48:34Z : No. of bitstreams: 1 menosso_jc_me_botfmvz.pdf: 1568332 bytes, checksum: 5f6742d0d4281777a48557024d7871e0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A cisticercose bovina é resultante da ingestão de ovos de T. saginata proveniente de pastagens e águas contaminadas fornecidas aos animais. É causa de preocupações na área de saúde pública por ocasionar a teníase em humanos, mas causa sérios prejuízos na indústria agropecuária e aos pecuaristas, devido às condenações ou tratamentos de frio ou salga pelas quais as carcaças consideradas positivas são submetidas. O método de diagnóstico rotineiramente utilizado para a cisticercose bovina tem sido a inspeção post-mortem. Muitos pesquisadores têm desenvolvido métodos de diagnóstico antemortem, com especificidade e sensibilidade variadas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a aplicação da amplificação de DNA circulante de T. saginata, através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), como ferramenta diagnóstica para cisticercose bovina. Para a realização da pesquisa foram utilizadas amostras de sangue de bovinos abatidos em frigoríficos sob S.I.F., segundo apresentarem ou não cisticercose. Inicialmente avaliaram-se cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores através da determinação do limiar de detecção da PCR de cada um deles. Objetivou-se ainda estabelecer qual a fração do sangue experimentalmente contaminado resultaria em amplificação de fragmentos de DNA através da PCR, para posteriormente avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados com T. saginata. O melhor limiar de detecção foi observado com o uso do par de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, nas frações de sangue denominadas pellet e sobrenadante. As amostras de sangue de animais positivos para cisticercose na inspeção de rotina e submetidos a PCR não resultaram em amplificação do fragmento de DNA desejado, sugerindo que a baixa carga parasitária possa ter influenciado os resultados. / Bovine cysticercosis is caused by the ingestion of T. saginata eggs from contaminated pastures and water provided to animals. It is a public health problem by causing the taeniasis in human beings, but it also causes serious damages in the agro-cattle industry and to the cattle raisers by de condemnation or treatment by coldness or salting of carcass detected as positive. Routinely bovine cysticercosis diagnosis has been the post-mortem inspection. Several researchers have developed ante-mortem diagnosis methods, with variable specificity and sensitivity. The present study aimed at evaluating the amplification of circulating DNA of T. saginata, by the Polymerase Chain Reaction (PCR), as a diagnostic tool to bovine cysticercosis. Blood samples from bovines slaughtered under Federal Meat Inspection abattoirs were taken according to the presence or absence of cyst forms. Initially, we evaluated five primers and established which blood fraction experimentally contaminated resulted in DNA fragment amplification by PCR. The best detection limit was observed with the use of the SCAR K primers, in the blood fractions denominated “pellet” and “supernatant”. Blood samples of naturally infected animals considered positive in the routine inspection didn’t result in the desired DNA fragment amplification by PCR.

Orientador: Helio Jose Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Banca: Everlon Cid Rigobelo / Resumo: Foi realizada a clonagem e expressão do gene da glicoproteína HN da estirpe La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina no sistema hospedeiro constituído por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que apesar de tentativas de otimização, não evidenciou a expressão da proteína recombinante. Após isso, foram produzidas as porções N-terminal e C-terminal da glicoproteína HN como proteínas recombinantes de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o peptídeo SUMO no sistema hospedeiro constituído pela bactéria Escherichia coli. Contatou-se que o sistema procarioto de expressão foi mais eficiente e permitiu a geração de dois peptídeos, que depois de devidamente caracterizados e purificados foram utilizados como antígenos para a realização de testes de imunodiagnóstico em sustituição aos kits comerciais utilizados atualmente. Foram desenvolvidos dois ensaios de ELISA baseados na adsorção de um antígeno formado pela expressão da porção N-terminal da glicoproteína HN (ELISA HN N-terminal) e na porção C-terminal da mesma glicoproteína (ELISA HN C-terminal), recuperados a partir da purificação da fração solúvel de culturas de E. coli. O ELISA C-terminal mostrou os melhores coeficientes de correlação com o teste padrão HI e com o teste S-ELISA-ConA, além de melhores índices de sensibilidade, especificidade e acurácia. Com isso, o ELISA baseado em um antígeno da porção C-terminal da glicoproteína HN e uma única diluição do soro desenvolvido neste estudo pode ser aplicado no diagnóstico e monitoramento pós-vacinal do VDN / Abstract: Was carried out the cloning and expression of the glycoprotein gene of the strain La Sota HN of the Newcastle disease virus (NDV), as a recombinant fusion protein containing a poly-histidine tail at the host system consisting of the yeast species Saccharomyces cerevisiae, which despite attempts at optimizing, showed no expression of recombinant protein. After that, the portions N-terminal and C-terminal from glycoprotein HN were produced as recombinant proteins containing a fusion tail and the poly-histidine peptide SUMO at the host system consisting of Escherichia coli. It was noted that the prokaryotic expression system was more efficient and allowed the generation of two peptides, which once characterized and purified were used as antigens for immunodiagnostic tests replacement in the commercial kits currently used. Were developed two ELISA assays based on the adsorption of the antigen formed by expression of the N-terminal portion of the HN glycoprotein (HN ELISA N-terminal) and the C-terminal portion of the same glycoprotein (HN ELISA C-terminus), recovered from purification of the soluble fraction of cultures of E. coli. The C-terminal ELISA showed the best correlation coefficients with the standard HI test and ELISA test S-ConA-, and higher sensitivity, specificity and accuracy. Therefore, the ELISA of the antigen based on a C-terminal portion of the glycoprotein HN and a single serum dilution developed in this study can be applied in the diagnosis and monitoring of post-vaccination VDN / Doutor

Orientador: Germano Francisco Biondi / Resumo: A cisticercose bovina é resultante da ingestão de ovos de T. saginata proveniente de pastagens e águas contaminadas fornecidas aos animais. É causa de preocupações na área de saúde pública por ocasionar a teníase em humanos, mas causa sérios prejuízos na indústria agropecuária e aos pecuaristas, devido às condenações ou tratamentos de frio ou salga pelas quais as carcaças consideradas positivas são submetidas. O método de diagnóstico rotineiramente utilizado para a cisticercose bovina tem sido a inspeção post-mortem. Muitos pesquisadores têm desenvolvido métodos de diagnóstico antemortem, com especificidade e sensibilidade variadas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a aplicação da amplificação de DNA circulante de T. saginata, através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), como ferramenta diagnóstica para cisticercose bovina. Para a realização da pesquisa foram utilizadas amostras de sangue de bovinos abatidos em frigoríficos sob S.I.F., segundo apresentarem ou não cisticercose. Inicialmente avaliaram-se cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores através da determinação do limiar de detecção da PCR de cada um deles. Objetivou-se ainda estabelecer qual a fração do sangue experimentalmente contaminado resultaria em amplificação de fragmentos de DNA através da PCR, para posteriormente avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados com T. saginata. O melhor limiar de detecção foi observado com o uso do par de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, nas frações de sangue denominadas pellet e sobrenadante. As amostras de sangue de animais positivos para cisticercose na inspeção de rotina e submetidos a PCR não resultaram em amplificação do fragmento de DNA desejado, sugerindo que a baixa carga parasitária possa ter influenciado os resultados. / Abstract: Bovine cysticercosis is caused by the ingestion of T. saginata eggs from contaminated pastures and water provided to animals. It is a public health problem by causing the taeniasis in human beings, but it also causes serious damages in the agro-cattle industry and to the cattle raisers by de condemnation or treatment by coldness or salting of carcass detected as positive. Routinely bovine cysticercosis diagnosis has been the post-mortem inspection. Several researchers have developed ante-mortem diagnosis methods, with variable specificity and sensitivity. The present study aimed at evaluating the amplification of circulating DNA of T. saginata, by the Polymerase Chain Reaction (PCR), as a diagnostic tool to bovine cysticercosis. Blood samples from bovines slaughtered under Federal Meat Inspection abattoirs were taken according to the presence or absence of cyst forms. Initially, we evaluated five primers and established which blood fraction experimentally contaminated resulted in DNA fragment amplification by PCR. The best detection limit was observed with the use of the SCAR K primers, in the blood fractions denominated "pellet" and "supernatant". Blood samples of naturally infected animals considered positive in the routine inspection didn't result in the desired DNA fragment amplification by PCR. / Mestre

Orientadores: Dagmar Ruth Stach-Machado, Marcos Antonio Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peroni_LuisAntonio_D.pdf: 5677765 bytes, checksum: 2a4cb6ec8aba9b1ec6655c771981377f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este trabalho visou efetuar a identificação dos epitopos das prottnas recombinantes CB-22 e CB-104 do capsídeo do Cítrus tristeza vírus (CTV), reconhecidos pelos anticorpos monoclonais (MAb) produzidos por Stach-Machado e colaboradores (2000). Assim, os epitopos reconhecidos pelos MAbs 30.G.02 e 37.G.ll, correspondem às seqüências de aminoácidos NLHIDPTLI e TQQNAALNRDLF, localizadas nas posições 32 a 40 e 50 a 61 das proteínas recombinantes CB-22 e CB-104. O epitopo reconhecido pelo MAb 39.07 que apresenta especificidade apenas para a CB-104, homóloga aos isolados severos do CTV corresponde a seqüência TDVVFNSKGIGN, localizados na posição 120 a 131 da proteína. Estes dados corroboram com os ensaios de ELlSA, confirmando o MAb 30.G.02 como um anticorpo universal, atuando quer como anticorpo de captura ou de detecção em ELlSA Sandwich, uma vez que, seu epitopo é conservado em 87.2% dos isolados de CTV. O MAb 37.G.ll deve ser adotado apenas como anticorpo de detecção pois reconhece uma seqüência encontrada em 62,6% dos isolados, permitindo uma identificação ampla, sem efetuar a diferenciação de estirpes. O MAb 39.07 foi classificado como "forte", pois seu epitopo está presente em apenas 19,7% das seqüências, sendo estas provenientes de isolados fortes do CTV de todo o mundo. A utilização de peptídeos lineares não permitiu a identificação e caracterização do epitopo do MAb 1C.04-12, confirmando dados preliminares de nosso laboratório que permitiram inferir que o mesmo reconhece um epítopo conformacional. O conhecimento das características estruturais da proteína do capsídeo viral possibilita obtenção de informações relevantes quanto às suas propriedades biológicas, como a participação na organização e montagem da partícula viral, proteção do material genético, interação com o inseto-vetor e com a planta hospedeira e também, pela "movimentação" da partícula viral no processo de infecção na planta. Considerando que até a presente data não existem dados disponíveis no Protein Data Bank (PDB) sobre a estrutura tridimensional da proteína do capsídeo do CTV, efetuamos o estudo estrutural da CB-22, utilizando Dicroísmo Circular (CD) e Difração de Raios X a Baixo Ângulo (SAXS). A análise dos dados de CD mostrou um espectro característico de proteínas cuja estrutura secundária é predominantemente formada por a-hélices, sendo este resultado coerente com a estrutura secundária predita pelo software PSIPRED. Os estudos de SAXS revelaram uma proteína altamente oligomerizada com estruturas formadas por subunidades, que variam de acordo com a concentração da mesma em solução. Este resultado, embora tenha impossibilitado a resolução e modelagem da estrutura secundária da CB-22, demonstrou que esta proteína recombinante mantém a função da proteína nativa, responsável pela formação do capsídeo vira!. Assim sendo, podemos postular a sua utilização como uma molécula carreadora, podendo ser aplicada em protocolos de vacinação ou no transporte dirigido de ácidos nucléicos ou proteínas. Por fim, este trabalho estabeleceu diagnósticos imunomoleculares como Imunocaptura-PCR (IC-PCR) e Imuno-PCR (I-PCR) para a detecção da bactéria gramnegativa Xylella jastid[osa, agente etiológico da Cvc. Os ensaios imunomoleculares apresentaram o limite de detecção muito superior aos diagnósticos utilizados na rotina como ELlSA e PCR, sendo o limite de detecção do IC-PCR e do I-PCR de 103 a 101 células, respectivamente. Portanto, estes métodos são uma alternativa viável para efetuar o diagnóstico da CVC e também em estudos epidemiológicos, com a vantagem de eliminar as etapas de extração e concentração do material genético bacteriano, permitindo um diagnóstico acurado dessa doença / Abstract: This work aims to carry out the identification of epitopes of the Citrus tristeza virus (CTV) recombinant coat protein (CB-22 and CB-l04) which are recognized by four monoclonal antíbodies (MAb) produced by Stach-Machado et aI. (2000). MAb 1C.04-12 recognizes CB-22 protein, homologous to CTV isolates that induce weak symptoms in indicators plants; while MAb 39.07 reacts to CB-l04 protein, homologous to severe CTV isolates and, MAbs 30.G.02 and 37.G.ll recognize both proteins. MAb 30.G.02 recognized the sequence formed by amino acids NLHIDPTLI, located at positions 32 to 40, while MAb 37.G.ll recognized the amino acids from 50 to 61, whose sequence is TQQNAALNRDLF. On the other hand, the MAb 39.07 recognized the sequence TDVVFNSKGIGN, located at positions 120 to 131 in CB-l04 protein. MAb 30.G.02 was considered a Universal antibody, once its epitope is conserved in 87.2% of CTV isolates, and can be applied as a coating antibody or even as a detection antibody in ELlSA Sandwich assays. The epitope of MAb 37.G.ll is conserved in 62.6% of sequences and, can be applied as detection antibody, allowing a quick and wide range screening but without strains differentiation. Finally, MAb 39.07 was classified as "Severe" antibody, once its epitope is present at only 19.7% of CTV sequences, which were derived frem severe worldwide CTV isolates. The technique of linear peptides did not allow the epitope determination of MAb 1C.04-12, since this antibody may recognize a conformational epitope in the CB-22 tridimensional structure, according to the early data from our laboratory showing that this MAb did not recognize the CB-22 under denaturating conditions, confirming the conformational nature of its eptiope. The knowledge about structural features of viral coat protein enables acquiring relevant information about biological properties of this protein. The coat protein plays an essential role in the organization and assembly of viral particle, acts in genetic material protection and, probably is involved in the interaction with insect-vector and with host plant, being responsible for the movement of viral particle in the infection processo However, there are not any data in Protein Data Bank (PDB) about the secondary and tertiary structures of CTV coat protein, and so, this work carried out a structural study about CB-22 by Circular Oichroism Spectroscopy (CO) and Small-Angle X-ray Scattering (SAXS). The CO data analysis demonstrated a spectrum characteristic of proteins whose secondary structure is predominantly formed by a-helixes, and these results are coherent of predicted structure by PSIPREO software. The SAXS data revealed a highly oligomeric protein comprising many subunits whose quantities are dependent and vary according to the protein concentration in solution. These data, although had impaired the modeling and resolving of CB-22 secondary structure, demonstrated that this recombinant protein maintain the function of native protein, responsible for the assembly of CTV capsid, and this structure without bacterial ONA is also called virus-/ike, which allows to postulate its usefulness as nucleic acid ca rrier in vaccination protocols. Finally, the third objective of this work was the establishment of immunomolecular diagnosis to gram-negative bacterium, Xy/ella fastidiosa, which causes Citrus Variegated Chlorosis in Brazil. We carried out two immunomolecular assays, like !mmmuno,Çapture PCR and !mmuno-PCR for direct detection of X. fastidiosa without ONA isolation. Whereas the reactivity of ELlSA and PCR ranged from 106 to 104 bacterial cells, the IC-PCR sensitivity was up to 103 and the detection limit of I-PCR was up to 101 bacterial cells. Therefore, ICPCR and I-PCR assays provide an alternative for quick and very sensitive rnethods to screening X. fastidiosa, with the advantage of not requiring any concentration or ONA purification steps while still allowing an accurate diagnosis of Cvc / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular