Resumo: Em 1997 o Departamento de DST/AIS e Hepatites Virais estruturou em todo Brasil uma rede de laboratórios para realizar o exame de Carga Viral Plasmática do HIV (CV) denominada Rede Nacional de Carga Viral. O exame quantifica o RNA do HIV no plasma do paciente infectado utilizando a metodologia do branched-DNA, um ensaio de amplificação do sinal luminescente, o qual utiliza uma plataforma de detecção. Atualmente, esta rede é reconhecida internacionalmente e realiza 520.000 exames/ano. No entanto, vários fatores podem influenciar o resultado do exame como integridade do RNA, volume de amostra disponível, método e plataforma utilizados. Assim, o Departamento de DST/AIDS e Hepatites Virais implantou um protocolo pré-analítico para ser utilizado em todo o território nacional. Entretanto, as regiões brasileiras são muito diferentes e alguns laboratórios não conseguem seguir este protocolo. O objetivo deste estudo foi (a) avaliar as diferentes condições de transporte e armazenamento das amostras utilizadas no teste de CV, (b) validar a utilização de volumes iniciais de plasma inferiores ao preconizado, (c) comparar plataformas de detecção e (d) metodologias disponíveis para a execução do exame. Os resultados mostraram que as amostras podem ser processadas em até 8 h sem perda ou degradação do RNA, volumes iniciais inferiores ao preconizado podem ser utilizado com perda de sensibilidade e, as duas plataformas disponíveis no Brasil são equivalentes para a execução do teste. Apesar de existirem outras metodologias para a realização do teste, os resultados podem ser diferentes mostrando a necessidade da utilização da mesma metodologia em todo Brasil / Abstract: The Department of the DST/AIDS and Viral Hepatitis implemented since 1997 a laboratory network in all Brazil to perform the HIV plasma viral load (PVL) test named Viral Load National Network as part of the attendance to infected patient. This exam quantify the HIV plasma RNA in infected patient using Branched-DNA methodology, a signal amplification nucleic acid probe assay, which use a detection platform. Nowadays this network has international appreciation and to execute 520.000 tests/year. However, several factors can alter the result of the test as RNA integrity, available sample volume, used method and detection platform. Then an optimized pre-analytic protocol was implanted by Department of the DST/Aids to be used in all national territory. However the Brazil regions are many different and some laboratories don't get lead this protocol. The goal of this study was (a) to evaluate the different transport and storage conditions of the samples used to the PVL test, (b) to valid the use of the lower plasma initial input in the exam, (c) to compare the detection platforms and (d) methods available to execution of the test. The results showed blood sample can be process in until 8h after collection without RNA loss or degradation, lower initial input can be used with loss of sensibility and the two detection platforms available in Brazil are equivalent. In spite of others methods are available to execution of test, the results can be distinct showing the importance of the all laboratories in Brazil used the same method / Orientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Coorientador: Rejane Maria Tommasini Grotto / Banca: Emílio Carlos Curcelli / Banca: Paulo Inácio da Costa / Mestre

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Cintia Fridman / Banca: Rogério Nogueira de Oliveira / Banca: Gustavo Chemale / Banca: João Aristeu da Rosa / Resumo: A identificação humana por meio da análise de DNA utiliza o perfil genético de um indivíduo baseado na combinação de diversos marcadores que são herdados de seus progenitores. Estes marcadores são geralmente diferenças nas sequências de DNA nuclear entre os indivíduos (polimorfismos). Em alguns casos, entretanto, a análise do DNA nuclear não pode ser aplicada. Isso ocorre quando o DNA da amostra apresenta-se degradado ou em casos onde o material biológico não apresenta o DNA nuclear. Nestes casos, a análise do DNA mitocondrial (DNA mt) é o método de escolha. Entretanto, em um mesmo indivíduo podem existir populações de DNA mt diferentes, fenômeno denominado heteroplasmia. Este trabalho teve como objetivo o estudo de polimorfismos presentes no DNA mt de indivíduos residentes na Grande São Paulo para aplicação na Identificação Humana. Para isso, foi sequenciada toda a região hipervariável do DNA mt de 160 indivíduos. Além disso, o SNP 3010 foi analisado por discriminação alélica (PCR em tempo real) para estudo do aumento do poder discriminatório quando os indivíduos não puderam ser diferenciados pela análise da região hipervariável. Foi desenvolvido, também, uma reação de SNaPshot em multiplex contendo 42 SNPs que permitiram a classificação das amostras em haplogrupos do DNA mt. Por fim, foram analisadas 100 amostras de cabelo dos mesmos indivíduos para o estudo da frequência de heteroplasmia na região HV3 do DNA mt. De um total de 160 amostras, 144 haplótipos diferentes foram encontrados quando analisamos toda a região hipervariável do DNA mt; 131 haplótipos foram únicos. O SNP 3010 foi suficientemente discriminatório para conseguir distinguir indivíduos que apresentavam o mesmo haplótipo em dois dos treze casos que apresentavam mais de um indivíduo com o mesmo haplótipo / Abstract: The human identification by DNA analysis uses the genetic profile of an individual based on the combination of diverse markers that are inherited of its ancestors. These markers are generally differences in sequences of nuclear DNA between individuals (polymorphisms). In some cases, however, the analysis of the nuclear DNA cannot be applied. It occurs when the DNA sample is degraded or in cases which the biological material does not content nuclear DNA. In these cases, the mitochondrial DNA (mtDNA) analysis is the choice method. However, inside one individual can exist different mtDNA populations, phenomenon called heteroplasmy. The aim of this work was to study mtDNA polymorphisms in individuals residents in São Paulo metropolitan area for application in Human Identification. For this, we have sequenced the entire hypervariable region of mtDNA for 160 individuals. Furthermore, the SNP 3010 was analyzed by allelic discrimination (Real-Time PCR) to study the increase of the discriminatory power when individuals could not be differentiated by analysis of the hypervariable region. It was developed also, a SNaPshot multiplex reaction containing 42 SNPs that allowed the classification of samples in mtDNA haplogroups. Finally, 100 hair samples, from the same individuals, were analyzed for the study of heteroplasmy frequency in the HV3 region of mtDNA. Among 160 samples, 144 different haplotypes were found when the entire hypervariable region of mtDNA was analyzed; 131 haplotypes were unique. The SNP 3010 SNP was able to distinguish individuals who had the same haplotype in two of thirteen cases with more than one individual with the same haplotype. Our population was classified in 46.6% of African, 27.3% of European, 25.5% of Native American and 0.6% Asian origin using the SNaPshot panel of 42 SNPs in multiplex / Doutor

Resumo: Com os objetivos de elucidar a origem genética do suíno casco-de-burro e de contribuir para sua conservação, realizou-se uma caracterização genética em 110 animais, oriundos das regiões Nordeste (NE), Centro-Oeste (CO) e Sudeste (SE), usando-se duas classes de marcador molecular e análises citogenéticas. Foram encontrados 13 haplótipos mitocondriais entre os cascos-de-burro, sendo que apenas um foi comum às três subpopulações (NE, CO e SE). O valor médio da diversidade haplotípica e o da nucleotídica na população total foram 0,61 e 0,05 respectivamente. Por meio do DNA mitocondrial, as subpopulações de casco-de-burro apresentaram menor distância genética da população da raça portuguesa bísara. No entanto o haplótipo mais frequente nos cascos-de-burro e o único comum a todas as subpopulações pertence à raça ibérica. A variabilidade genética média obtida por meio dos 25 microssatélites na população total foi: número de alelo = 9,8; conteúdo de informação polimórfica = 0,73; heterozigose esperada = 0,69; heterozigose observada = 0,58; consaguinidade (Fis) = 0,15; e apenas seis loci apresentaram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Considerando-se a divisão da população nas três subpopulações – que, por meio do DNA nuclear, estiveram mais próximas da população duroc e da bísara –, os valores observados para os índices de fixação foram: 0,10 para Fis, 0,09 para Fst e 0,18 para Fit. Os cascos-de-burro possuem o número diploide 2n = 38, não sendo verificado miscigenação com o javali. Os resultados demonstram origem genética ibérica para os cascos-de-burro, com posterior introgressão alélica das raças internacionais importadas no século passado / Abstract: With the purpose of elucidating the genetic origin of Brazilian Mulefoot pigs and to contribute to their conservation, 110 animals from Northeast (NE), Central- West (CW), and Southeast (SE) Brazil were characterized using two molecular marker classes and cytogenetic analysis. A total of 13 mitochondrial haplotypes was found, but only one was common to the three subpopulations (NE, CW, SE) of Brazilian Mulefoot pigs. The total population presented mean haplotype and nucleotide diversity values of 0.61 and 0.05, respectively. Mitochondrial DNA analysis showed that the Brazilian Mulefoot pig subpopulations presented the shortest genetic distance from the Portuguese Bísara breed. However, the most frequent haplotype found in the Brazilian Mulefoot population, and the only one common to all subpopulations belongs to the Ibérica breed. The mean genetic variability of the total population, obtained using 25 microsatellites, was: allele number = 9.8; polymorphic information content = 0.73; expected heterozygosity = 0.69; observed heterozygosity = 0.58; inbreeding = 0.15; and only six loci displayed Hardy-Weinberg equilibrium. Considering the three studied subpopulations – which were closer to the Bísara and Duroc populations, based on nuclear DNA – the values observed for the fixation indexes were: 0.09 for Fis, 0.10 for Fst, and 0.18 for Fit. Brazilian Mulefoot pigs have a diploid number of 2n = 38, which indicates that there is no interbreeding with wild boars. The results demonstrate that the genetic origin of Brazilian Mulefoot pigs is Iberian, with later allele introgression from foreign breeds imported during the 20th century / Orientador: Jeffrey Frederico Lui / Coorientador:Carlos Manuel M. Santos Fonseca / Coorientador: Maria Aparecida Cassiano Lara / Banca: Sandra Aidar de Queiroz / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Samuel Rezende Paiva / Banca: Eucleia Primo Betioli Contel / Doutor

Resumo: Com a crescente disponibilidade das biotécnicas de reprodução animal, o comércio dos produtos envolvidos com essas práticas também está em expansão, oferecendo a possibilidade de melhoria dos índices zootécnicos às produções de bovinos. Porém deve-se levar em consideração que há riscos sanitários em práticas como a inseminação artificial caso não se realize o controle do material biológico utilizado. Dentre os agentes infecciosos que podem estar presentes no sêmen e passíveis de serem transmitidos por esse estão a leptospirose e a brucelose, enfermidades responsáveis por grandes perdas reprodutivas e econômicas na bovinocultura mundial. Este projeto teve como objetivos detectar molecularmente esses patógenos em amostras de sêmen bovino provenientes de centrais de comercialização brasileiras, utilizando um kit comercial para extração de DNA ("RTP Bacteria DNA Mini Kit" (Invitek®), aperfeiçoá-lo para a extração de DNA bacteriano a partir de sêmen e avaliar sua aplicabilidade à rotina laboratorial. O DNA bacteriano foi extraído e quantificado por eletroforese em gel de agarose. Pretendeu-se também realizar reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os "primers" B4 e B5 para amplificação do DNA de Brucella spp. e os "primers" Lep 1 e Lep 2 para Leptospira spp. O kit de extração foi otimizado com sucesso, e todas as 96 amostras examinadas foram negativas para qualquer DNA bacteriano. Os resultados podem ser úteis para estabelecer alternativas de controle sanitário em touros doadores de sêmen e permitir o fornecimento de material genético livre de patógenos, aumentando o "status" sanitário da reprodução de bovinos no Brasil / Abstract: With the increasing disponibility of animal reproduction biotechniques, trading of products involved with these activities is also in expansion offering improving possibilities in zootecnic indexes of bovine herds. However, considerations should be taken about sanitary risks in practices like artificial insemination if any control is applied to this biological material. Among infectious agents that could be present and transmitted by semen are leptospirosis and brucellosis, diseases that are responsible for numerous reproductive and economic losses in world's cattle culture. The goals of this project were to molecularly detect these pathogens in bovine semen samples from Brazilian artificial insemination centers using a commercial kit for DNA extraction (RTP Bacteria DNA Mini Kit (Invitek®), to improve it for extracting bacterial DNA from semen and to analyze its applicability in laboratory routine. Bacterial DNA was extracted and quantified by agarose gel electrophoresis. We also intended to realize polymerase chain reaction (PCR) using primers B4 and B5 for amplification of Brucella spp. DNA and primers Lep 1 e Lep 2 for Leptospira spp. DNA. The extraction kit was successfully optimized and all of 96 examined samples were negative for any bacterial DNA. Results could be useful to establish alternative measures of sanitary control in semen donors and to allow the supplying of genetic material free of pathogens, increasing sanitary status of bovine reproduction in Brazil / Orientador: Raul José Silva Gírio / Coorientadora: Fernanda Senter Magajevski / Banca: Luis Antonio Mathias / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Cursi / Mestre

Resumo: Os objetivos deste trabalho foram a padronização de metodologia alternativa de genotipagem do SNP AY_731081:g.1900T>C do gene CD14 equino por PCR-RFLP, bem como a caracterização em equinos da raça Mangalarga deste e de outros dois polimorfismos, o AY_005808: c.1530A>G do TLR4 e o AX_463789: g.133T>C do Cε, a fim de promover o embasamento necessário para futuras pesquisas visando associação entre marcadores de DNA e características relacionadas à fisiologia do sistema imune na raça. Para tanto, foram utilizados 151 animais Mangalarga, de ambos os sexos e de idades variadas, representativos da população do estado de São Paulo. O método de PCR-RFLP mostrou-se adequado para a genotipagem do SNP AY_731081: g.1900T>C do gene CD14 equino. Entretanto, tal polimorfismo provavelmente não ocorre em equinos Mangalarga, impossibilitando estudos de associação com o marcador na raça. Os parâmetros genético-populacionais obtidos para os polimorfismos AY_005808:c.1530A>G do gene TLR4 e o AX_463789:g.133T>C do gene Cε demonstraram a possibilidade de realização de pesquisas visando a associação entre os marcadores e características relacionadas ao sistema imune na raça Mangalarga / Abstract: The objective of this work was to contribute to the molecular characterization of the equine Mangalarga, aiming at future studies on the association of DNA polymorphisms and traits associated with the immune system physiology of this equine breed. An alternative PCR-RFLP genotyping method was developed for the SNP AY_731081:g.1900T>C, in the gene CD14. Furthermore, this SNP plus the AY_005808: c.1530A>G, in the gene TLR4, and the AX_463789: g.133T>C, in the gene Cε, were used to analyze 151 Mangalarga individuals. The analyzed horses are representative of the São Paulo State population and consisted of male and female animals of several ages. The PCR-RLP method has been demonstrated to be suitable for equine genotyping using the SNP AY_731081: g.1900T>C of the gene CD14. However, this polymorphism is apparently absent in the Mangalarga breed. The population genetic data obtained for the polymorphisms AY_005808:c.1530A>G, of the gene TLR4, and the AX_463789:g.133T>C, in the gene Cε, indicated the feasibility of these SNPs for further studies aiming at the association of molecular markers with traits related to the immune system of the Mangalarga horse breed / Orientador: Marcílio Dias Silveira da Mota / Coorientador: Rogério Abdallah Curi / Banca: Humberto Tonhati / Banca: Lenira El Faro Zadra / Mestre

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Rogério Nogueira de Oliveira / Banca: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga / Resumo: A identificação humana através da análise de DNA utiliza o perfil genético de um indivíduo baseado na combinação de diversos marcadores que são herdados de seus progenitores. Esses marcadores são geralmente diferenças nas seqüências de DNA nuclear entre os indivíduos (polimorfismos). Em alguns casos, entretanto, a análise do DNA nuclear não pode ser aplicada. Isso ocorre quando o DNA da amostra apresenta-se degradado ou em casos onde o material biológico não apresenta o DNA nuclear. Nestes casos, a análise do DNA mitocondrial (DNA mt) é o método de escolha. Entretanto, em um mesmo indivíduo podem existir populações de DNA mt diferentes, fenômeno denominado heteroplasmia. Este trabalho teve como objetivo o estudo da freqüência de heteroplasmia no DNA mt extraído de amostras de cabelo, quando comparado ao DNA mt contido no sangue dos mesmos indivíduos; análise da terceira região hipervariável (HV3) do DNA mt em amostras de sangue para estudo do seu poder discriminatório em nossa população; e aplicação da técnica de análise do DNA mt em vestígios biológicos. Para isso foram seqüenciadas as regiões hipervariáveis HV1 e HV2 em amostras de cabelo e sangue de 100 indivíduos, além do sequenciamento da região hipervariável HV3 em amostras de 150 indivíduos, todos residentes na Grande São Paulo. Uma freqüência de 10,5% de heteroplasmia foi encontrada em amostras de cabelo, e uma diversidade haplotípica de 0,8233 e probabilidade de semelhança de 0,1822 na região HV3 do DNA mt em amostras de sangue. Os resultados obtidos estão de acordo com os resultados relatados em outras populações e permitem sua aplicação no contexto forense brasileiro. / Abstract: The human identification by DNA analysis uses the genetic profile of an individual based on the combination of diverse markers that are inherited of its ancestors. These markers are generally differences in sequences of nuclear DNA between individuals (polymorphisms). In some cases, however, the analysis of the nuclear DNA cannot be applied. It occurs when the DNA sample is degraded or in cases which the biological material does not content nuclear DNA. In these cases, the mitocondrial DNA (mtDNA) analysis is the choice method. However, inside one individual can exist different mtDNA populations, phenomenon called heteroplasmy. The objective of this work was to study the frequency of heteroplasmy in extracted mtDNA from hair, when compared with mtDNA contained in the blood of the same individuals; and to analysis the third hypervariable region (HV3) of mtDNA in blood samples to study its discriminatory power in our population. For it, hypervariable regions HV1 and HV2 in hair and blood samples from 100 individuals had been sequenced, beyond the sequencing of hypervariable region HV3 in 150 individuals samples, inhabitants of Grande São Paulo. A heteroplasmic frequency of 10.5% was found in hair samples, and a haplotype diversity of 0.8233 and a random match probability of 0.1822 were found in the HV3 region of mtDNA in blood samples. These results are in agreeing with those obtained from other populations and allow its application in the Brazilian forensic context. / Mestre

Orientador: Odair Correa Bueno / Banca: Ana Eugênia C. Campos Farinha / Banca: Denise Selivon Scheepmaker / Resumo: O gênero Solenopsis tem distribuição cosmopolita, mas espécies do grupo S. saevissima, são nativas da América do Sul e inclui as conhecidas formigas lava-pés. Elas foram introduzidas de forma acidental em diversas regiões biogeográficas do mundo. No Brasil possuem ampla distribuição, mas têm preferência por áreas de atividade humana. São formigas altamente agressivas e são responsáveis por acidentes que podem levar a choques anafiláticos e à morte. As formigas apresentam associações de diferentes tipos com outros organismos, inclusive com bactérias endossimbiontes como a Wolbachia, bactéria intracelular que também infecta as formigas do gênero Solenopsis. No presente trabalho, procurou-se caracterizar as populações de lava-pés (Solenopsis spp.) de ampla área do território brasileiro, analisando o parentesco dessas populações e inferindo sobre sua filogenia. Além disso, foi investigada a presença, frequência e distribuição do endossimbionte Wolbachia em populações de Solenopsis spp. no Brasil. A caracterização das lava-pés foi baseada na análise do gene citocromo oxidase I e em estudos filogenéticos. Observou-se desde completa coerência geográfica, até polifilia para as espécies S. invicta e S. saevissima, o que demonstra claramente a diversidade desse gênero de formigas no Brasil. Existe a possibilidade de ocorrer populações isoladas reprodutivamente, tendo como decorrência processos evolutivos de especiação. Além disso, clados com espécies divergentes agrupadas podem trazer evidências de espécies erroneamente identificadas morfologicamente, presente em bancos de dados. O levantamento da ocorrência de Wolbachia foi baseado no gene wsp do endossimbionte e análises filogenéticas foram realizadas para inferir a história evolutiva dessas bactérias nas populações de lava-pés do país. Foi encontrada uma grande... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The genus Solenopsis has a cosmopolitan distribution, but species of S. saevissima group are native from South America and include the known fire ant. They were accidentally introduced in several countries of the world. In Brazil they have wide distribution with preference for areas of human activity. Ants are highly aggressive and responsible for accidents that can lead to anaphylactic shock and death. The ants have different associations with other organisms, including bacteria endosymbionts such as Wolbachia, intracellular bacteria that also infect the ants of the Solenopsis genus. In this study, we sought to characterize the populations of fire ants (Solenopsis spp.) in a wide area of Brazil, analyzing the relationship of these populations and inferring their phylogeny. Furthermore, we investigated the presence, frequency and distribution of the endosymbiont Wolbachia in those populations of Solenopsis spp. in Brazil. The characterization of fire ants was based on analysis of the cytochrome oxidase I gene and on phylogenetic studies. It was observed that there were complete geographical coherence and polyphyly for the species S. invicta and S.saevissima, which clearly demonstrate the diversity of this genus of ants in Brazil. There is the possibility to occur reproductively isolated populations, leading to evolutionary processes of speciation. Furthermore, clustered clades with divergent species can bring evidences of species wrong morphologically identified, presents in databases. The survey of the occurrence of Wolbachia was based on the wsp gene of the endosymbiont and the phylogenetic analyses were performed to infer the evolutionary history of these bacteria in the populations of fire ants. There was a great diversity of Wolbachia in the genus Solenopsis, with 51% of the analyzed colonies presenting infection and the highest incidence was found in populations from... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Germano Francisco Biondi / Resumo: A cisticercose bovina é resultante da ingestão de ovos de T. saginata proveniente de pastagens e águas contaminadas fornecidas aos animais. É causa de preocupações na área de saúde pública por ocasionar a teníase em humanos, mas causa sérios prejuízos na indústria agropecuária e aos pecuaristas, devido às condenações ou tratamentos de frio ou salga pelas quais as carcaças consideradas positivas são submetidas. O método de diagnóstico rotineiramente utilizado para a cisticercose bovina tem sido a inspeção post-mortem. Muitos pesquisadores têm desenvolvido métodos de diagnóstico antemortem, com especificidade e sensibilidade variadas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a aplicação da amplificação de DNA circulante de T. saginata, através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), como ferramenta diagnóstica para cisticercose bovina. Para a realização da pesquisa foram utilizadas amostras de sangue de bovinos abatidos em frigoríficos sob S.I.F., segundo apresentarem ou não cisticercose. Inicialmente avaliaram-se cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores através da determinação do limiar de detecção da PCR de cada um deles. Objetivou-se ainda estabelecer qual a fração do sangue experimentalmente contaminado resultaria em amplificação de fragmentos de DNA através da PCR, para posteriormente avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados com T. saginata. O melhor limiar de detecção foi observado com o uso do par de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, nas frações de sangue denominadas pellet e sobrenadante. As amostras de sangue de animais positivos para cisticercose na inspeção de rotina e submetidos a PCR não resultaram em amplificação do fragmento de DNA desejado, sugerindo que a baixa carga parasitária possa ter influenciado os resultados. / Abstract: Bovine cysticercosis is caused by the ingestion of T. saginata eggs from contaminated pastures and water provided to animals. It is a public health problem by causing the taeniasis in human beings, but it also causes serious damages in the agro-cattle industry and to the cattle raisers by de condemnation or treatment by coldness or salting of carcass detected as positive. Routinely bovine cysticercosis diagnosis has been the post-mortem inspection. Several researchers have developed ante-mortem diagnosis methods, with variable specificity and sensitivity. The present study aimed at evaluating the amplification of circulating DNA of T. saginata, by the Polymerase Chain Reaction (PCR), as a diagnostic tool to bovine cysticercosis. Blood samples from bovines slaughtered under Federal Meat Inspection abattoirs were taken according to the presence or absence of cyst forms. Initially, we evaluated five primers and established which blood fraction experimentally contaminated resulted in DNA fragment amplification by PCR. The best detection limit was observed with the use of the SCAR K primers, in the blood fractions denominated "pellet" and "supernatant". Blood samples of naturally infected animals considered positive in the routine inspection didn't result in the desired DNA fragment amplification by PCR. / Mestre

Resumo: Os crisopídeos são insetos com grande potencial para uso em programas de controle biológico de pragas agrícolas. Populações de Chrysoperla externa apresentam ampla distribuição geográfica, abrangendo desde o sul dos Estados Unidos até o sul da América do Sul, ocorrendo em diferentes ambientes. Contudo, há relativamente poucos estudos buscando compreender a estrutura genética de agentes de controle biológico, especialmente insetos predadores. Desta forma, os principais objetivos deste trabalho foram caracterizar geneticamente as populações de C. externa por meio de sequências do gene mitocondrial COI e compreender sua estrutura populacional nos municípios amostrados no Estado de São Paulo. Para tanto, indivíduos adultos foram coletados em pomares de citros, e da região torácica foi extraído o DNA total. O gene COI foi amplificado por meio da técnica de PCR e as amostras foram purificadas e sequenciadas. As populações de C. externa analisadas apresentaram elevada diversidade genética, bem distribuída entre os municípios amostrados. Esta homogeneização pode ser decorrência de fluxo gênico, ação antrópica, correntes de ar, proximidade das fazendas com matas nativas e elevado potencial reprodutivo de C. externa. A partir dos resultados obtidos é possível inferir que o agroecossistema, por ser um ambiente homogêneo, esteja contribuindo para a perda de estruturação que havia entre estas populações quando elas viviam em ecossistemas nativos, sendo assim, é fundamental que as populações de C. externa sejam estudas neste ambiente, para que possam ser compreendidas em seu habitat de origem e sem a influência da ação antrópica / Abstract: The green lacewings are insects with great potential for use in programs of biological control of agricultural pests. Populations of Chrysoperla externa are widely distributed geographically, being found from the southern United States until the southern South America, occurring in different environments. However, there are relatively few studies trying to understand the genetic structure of biological control agents, especially predatory insects. Thus, the main objectives of this work were to characterize genetically the populations of C. externa through COI mitochondrial gene sequences and to understand its population structure in sampled municipalities in the State of São Paulo. For this purpose, adult individuals were collected in citrus orchards, and from its torax were extracted the total DNA. The COI gene was amplified by PCR and the samples were purified and sequenced. The populations showed high genetic diversity, well distributed among the municipalities. This homogenization may be due to gene flow, human action, action of winds, proximity of farms to native forests, and high reproductive potential of C. externa. From the results, is possible to infer that the agroecosystem, a homogeneous environment, may be contributing to the loss of structure that existed among the populations when they lived in native ecosystems, and therefore, the populations of C. externa must be studied in this environment, so they could be understood in its natural habitat and without the influence of the human action / Orientador: Sérgio de Freitas / Coorientador: Adriana Coletto Morales / Banca: Sergio Antonio de Bortoli / Banca: Fernando de Faria Franco / Mestre

Resumo: A mancha areolada causada por Thanatephorus cucumeris, é uma das doenças mais importantes da seringueira (Hevea brasiliensis) na região Amazônica. Apesar disso, há pouca informação disponível sobre a diversidade biológica, patogênica e genética do patógeno. Uma questão importante sobre o real posicionamento filogenético deste patógeno ainda não foi respondida. Neste estudo, foram analisadas seqüências da região ITS-5.8S do rDNA de uma população de T. cucumeris (fase anamórfica = Rhizoctonia solani AG 2-2) associado à mancha areolada da seringueira, obtida em Belém (PA), Manaus (AM) e Xapuri/Rio Branco (AC). Esta população foi também comparada filogeneticamente com membros do AG 2 descritos mundialmente. Este estudo representa um passo importante para revelar a origem, os padrões de movimento e amplificação de genótipos epidemiologicamente importantes de T. cucumeris da seringueira. Filogenéticamente, através de análise Bayesiana e de máxima parcimônia, encontramos suporte para nomear um novo grupo de anastomose associado à mancha areolada da seringueira: o AG 2-2 Hb. Este grupo constitui-se numa unidade evolucionária independente em relação aos subgrupos mundiais do AG 2-2 analisados. Na genealogia construída por análise coalescente, observou-se que a população de R. solani AG 2-2 Hb, de Belém, é relativamente mais velha que as demais populações analisadas. O ancestral comum de todas as três populações analisadas está associado com a mancha foliar do maracujazeiro (Passiflora edulis), em Belém, e tem cerca de 0,8 unidades evolucionárias coalescentes de idade. Nenhum haplótipo da região ITS-5.8S do AG 2-2 Hb, de Belém, foi observado em outras regiões. Entretanto, a população de Manaus compartilhou dois, de seus quatro haplótipos, com aqueles observados em Xapuri / Rio Branco, no Acre, indicando fluxo gênico e deriva genética. / Abstract: Thanatephorus leaf spot is one of the most important diseases of rubber tree (Hevea brasiliensis) in the Amazon region, Brazil. However, there is fill information available about the biological, pathogenic and genetic diversity of the pathogen. An important question about the actual phylogenetic placement of this pathogen is not answered yet. In this study, we analyzed sequences of the ITS-5.8S rDNA region from a population of T. cucumeris (anamorphase = Rhizoctonia solani AG 2-2) associated to the rubber tree leaf spot obtained in Belém (PA), Manaus (AM) and Xapuri/Rio Branco (AC). This population was also phylogenetically compared with members of AG 2 world-widely described. This study represents an important step to reveal the origin, the patterns of movement and amplification of epidemiologically important genotypes of rubber tree-infecting T. cucumeris. Phylogenetically, through both Bayesiana and maximum parsimony analyses, we found support to nominate a new group of anastomosis associated with the rubber tree foliar spot: the AG 2-2 Hb. This group consisted of a independent evolutionary unit in relation to the world-wide sub-groups of AG 2-2 analyzed. In the gene genealogy built by coalescent analysis, was observed that the population of R. solani AG 2-2 Hb of Belém is relatively older than the other populations analyzed. The oldest most recent common ancestor of all the three populations analyzed was associated with a sample obtained from passion-fruit (Passiflora edulis) leaf blight in Belém and has about 0.8 coalescent evolutionary units of age. No AG 2- 2 Hb ITS-5.8S rDNA haplotype from Belém was observed in any other regions. However, the population from Manaus shared two, of its four haplotypes, with those observed in Xapuri/Rio Branco (Acre), indicating both gene flow and genetic drift. / Orientador: Paulo Cezar Ceresini / Coorientador: Alcebíades Ribeiro de Campos / Banca: Cesar Junior Bueno / Banca: Edson Luiz Furtado / Mestre